Thực hành vi ssinh vật thực phẩm

BỐ CỤC CHƯƠNG TRÌNHBài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong một mẫu thực phẩm Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của VSV Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và kh

THỰC HÀNH

VI SINH VẬT THỰC PHẨM

BỐ CỤC CHƯƠNG TRÌNH

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong một mẫu thực phẩm

Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của VSV

Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật

trong một mẫu thực phẩm

I Khái quát chung về công tác xác định số lượng VSV

Mục tiêu:

Giúp cho người nghiên cứu biết được mật độ vi sinh vật có trong mẫu thực phẩm là bao

nhiêu, phục vụ cho công tác nghiên cứu (tỷ lệ tiếp giống…), hoặc cho công tác công bố chất

lượng thực phẩm

Các phương pháp xác định:

+ Phương pháp xác định trực tiếp

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật

Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật

Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật

- Lưới khắc chia thành 25 ô vuông lớn  diện tích 1 ô

vuông lớn là 1/25 mm2

- Mỗi ô vuông lớn lại chia thành 16 ô vuông nhỏ 

Số ô vuông nhỏ trên lưới khắc là 400 ô  diện

tích 1 ô vuông nhỏ là 1/400 mm2

- Chiều sâu của mỗi ô là 0,1mm

Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật

2 Cách tiến hành

- Xác định số lượng tế bào nấm men của men bánh mì khô

- Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-4

- Nhỏ một giọt dịch huyền phù có vi sinh vật vào giữa khung đếm và đậy kín bằng lá kính, di chuyển nhẹ

khung đếm làm dịch chiếm đầy các khoang

- Đặt khung đếm vào bàn kẹp tiêu bản của kính hiển vi, chọn vật kính 10x hoặc 40x rồi từ từ dùng ốc chỉnh

thô đưa bàn kẹp tiêu bản lên trên để buồng đếm gần chạm vào vật kính

- Dùng ốc vi chỉnh từ từ đưa tiêu bản xuống dưới để tìm ảnh và lấy nét Tiến hành đếm số tế bào trong 5 ô

vuông lớn hoặc 20 ô vuông nhỏ.

Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật

3 Tính kết quả:

- N = a 10n 103 /h.s

- Trong đó N: số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù; a là số tế bào trung bình trong 1 hình vuông của

lưới, h là chiều sâu của khung đếm; n là độ pha loãng dịch huyền phù; s là diện tích một hình vuông

của lưới

- Lưu ý: số tế bào trong 1 ô lớn không vượt quá 20, số tế bào trong 1 ô nhỏ không vượt quá 10.

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật

trong mẫu thực phẩm

III Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật thông qua phương pháp đếm khuẩn lạc

1. Nguyên tắc:

Mẫu được đồng nhất và được pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi cấy trên môi trường thạch chọn

lọc cho từng nhóm, loài VSV Xác định số lượng khuẩn lạc trên bề mặt thạch sau thời gian nuôi

trong tủ ấm.

Cách đếm: lấy bút chì kẻ 2 đường vuông góc ở đáy hộp petri Đếm số khuẩn lạc trong từng góc theo

thứ tự từ trái qua phải, từ trên xuống dưới

Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật

2 Cách tiến hành:

- Xác định số lượng tế bào nấm men của men bánh mì khô

- Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-6 – 10-8

- Chuẩn bị các đĩa thạch có chứa môi trường nuôi Hansen, (chiều dày lớp môi trường từ 2 – 3mm

- Cấy 0,1ml dịch mẫu vào đĩa petri (3 đĩa/1 nồng độ) vào chính giữa đĩa thạch, trang đều, ủ ở

28 – 300C

- Xác định số khuẩn lạc sau 48h nuôi.

Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật

2 Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường Hansen:

- Thành phần môi trường:

Đường saccaro: 30g/l;Pepton 10 g/l; K2HPO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000ml

- Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng ở 1210 C/15 phút Sau đó để nguội, đổ vào 9 đĩa petri đã

khử trùng.

Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật

3 Tính kết quả:

Σ C

N =

(n1 x f1 + n2 x f2) x v

N: Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g hoặc CFU/ml)

C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật

trong mẫu thực phẩm

IV Đặt thí nghiệm cho bài 2

1. Thí nghiệm lên men rượu: Chuẩn bị 100ml dung dịch đường saccharose 10% cho vào bình tam

giác 250ml, thêm 0,1g nấm men Sac cerevisiae hòa tan Lên men ở nhiệt độ phòng trong 24h.

2 Thí nghiệm lên men lactic:

Chuẩn bị 100ml sữa tươi vào bình tam giác 250ml Thêm vào 10g sữa chua Lên men ở 40độ C trong 6h.

3 Đặt thí nghiệm lên men axetic:

Chuẩn bị 100ml bia + 1ml rượu + 15ml dấm ăn vào bình tam giác 250ml Lên men ở nhiệt độ phòng

trong 7 ngày

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật

trong mẫu thực phẩm

V Đặt thí nghiệm cho bài 3

1. Thí nghiệm thủy phân protein

Chuẩn bị 5g thịt vụn + 150ml nước vào bình tam giác 250ml.

Đun sôi trong 10 phút.

Để nguội, kiểm tra pH bằng giấy thử pH.

Kẹp 1 miếng giấy thử pH ở miệng bình tam giác Ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày.

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật

trong mẫu thực phẩm

V Đặt thí nghiệm cho bài 3

2.Thí nghiệm thử khả năng sinh tổng hợp enzyme amilase

- Thành phần môi trường:

NaNO3: 3g/l; K2HPO4: 1g/l; KCl: 0,5g/l; MgSO4.7H20: 0,5g/l; FeSO4: 0,1g/l; Tinh bột tan: 15g/l; Agar:

20g/l; Nước: 1000ml (Chú ý: Tinh bột tan hòa trong nước ấm cho tan thành dạng hồ rồi mới đổ

vào môi trường).

- Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng ở 1210 C/15 phút Sau đó để nguội, đổ vào 8 đĩa petri đã

khử trùng.

- Cấy chấm điểm nấm mốc Aspergillus và Penecillium vào giữa các đĩa (8 đĩa, 1 mốc 4 đĩa)

Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật

1. Quá trình lên men rượu:

-. Quan sát hiện tượng

-. Quan sát tế bào nấm men: Làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm, quan sát ở vật kính 40X, xác định hình

dạng, cách sắp xếp tế bào nấm men

-. Xác định tỷ lệ nấm men nảy chồi: Làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm, quan sát ở vật kính 40X, đếm tổng

số tế bào nấm men và số tế bào nấm men nảy chồi ở 5 trường kính để tính

Cách làm tiêu bản tươi không nhuộm: Nhỏ 1 giọt dung dịch chứa VSV vào giữa phiến kính, dùng lam

kính đậy lại

Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật

1. Quá trình lên men rượu:

-. Xác định tỷ lệ nấm men sống: Làm 1 tiêu bản tươi nhuộm đơn bằng safranin, quan sát ở vật kính 40X,

đếm tổng số tế bào nấm men và số tế bào nấm men sống ở 5 trường kính để tính

Cách làm tiêu bản tươi nhuộm đơn: Nhỏ 1 giọt dung dịch chứa VSV vào giữa phiến kính, nhỏ tiếp 1

giọt thuốc nhuộm safarnin, trộn đều, dùng lam kính đậy lại, đếm trong vòng 3 phút

Lưu ý: Tế bào nấm men sống không bắt màu, tế bào nấm men chết bắt màu của thuốc nhuộm

Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật

2. Quá trình lên men lactic :

-. Quan sát hiện tượng

- Xác định lượng axit lactic tạo thành: Cân 10g sữa chua vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml

nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N

1ml NaOH 0.1N = 0,009g lactic

-. Quan sát vi khuẩn lactic: làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách sắp

xếp, loại Gram của các chủng vi khuẩn lactic trong sữa chua

Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật

2. Quá trình lên men axetic :

-. Quan sát hiện tượng

- Xác định lượng axit axetic tạo thành: Hút 10ml dịch lên men axetic vào bình tam giác 250ml,

thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N

1ml NaOH 0.1N = 0,006g axetic

-. Quan sát vi khuẩn axetic: làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách

sắp xếp, loại Gram của các chủng vi khuẩn axetic trong dịch lên men

Các bước nhuộm gram

Các bước nhuộm Gram

- Cố định vết bôi: Đặt 1 giọt nước cất lên giữa phiến kính, lấy 1 vòng que cấy tròn sinh khối vi sinh vật hòa đều vào giọt nước cất (hoặc lấy 1 giọtdung dịch chứa vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính), dàn

mỏng, hong khô

- Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi

- Nhỏ dd Crystal violet (tím) thấm ướt hết giấy lọc Để từ 1 – 2 phút ( nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút ) Rửa nước, thấm (hong) khô. 

- Tẩy cồn 96: 15 – 30 giây ( từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ 

thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây ) Rửa nước, thấm (hong) khô Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản,

cho cồn chảy từ từ ở mép trên phiến kính Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu

tím. 

Các bước nhuộm Gram

- Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhuộm lần 2 bằng cách nhỏ dung dịch Fuschin kiềm loãng để 1 phút Rửa nước, thấm (hong) khô tiêu bản. 

- Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 100 lần. 

Vi khuẩn G (+) bắt màu tím Crystal violet, vi khuẩn G (–)

bắt màu hồng

- Chú ý: Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi. Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm (hong) khô tiêu bản. 

Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

1. Xác định khả năng thủy phân protein của VSV

-. Quan sát hiện tượng

-. Xác định định tính :

So sánh giá trị pH ở thời điểm đặt thí nghiệm và thời điểm đọc kết quả

-. Quan sát vi khuẩn gây thối rữa protein:

Làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram từ dịch thủy phân để xác định: Hình dạng của các loài vi

khuẩn, so sánh tỷ lệ vi khuẩn G(+) và G(-) trong tiêu bản

Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

2 Xác định khả năng sinh tổng hợp emzym amilaza

- Thuốc thử: Dùng dung dịch Lugol (I2 và KI) đổ vào đĩa thạch có chứa tinh bột tan đã nuôi nấm

mốc

- Xác định định tính khả năng sinh enzym amilase của VSV:

Xác định đường kính khuẩn lạc: d (mm)

Xác định đường kính vòng môi trường đã bị thủy phân: D

Hiệu số D – d là đại lượng định tính để xác định khả năng sinh enzym của vi sinh vật

So sánh khả năng sinh enzym amilase của 2 loài nấm mốc đã sử dụng

Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

2 Xác định khả năng sinh tổng hợp emzym amilaza

- Quan sát nấm mốc:

Làm 01 tiêu bản tươi không nhuộm: để quan sát hình dạng hệ sợi nấm (có vách ngăn hay không, có

phân nhánh hay không?), màu của bào tử

Làm 01 tiêu bản tươi nhuộm đơn bằng safranin: để quan sát bộ phận sinh bào tử của nấm mốc

(bào tử trần hay bào tử nang, bào tử trần dạng bàn tay xòe hay dạng hoa hướng dương )