- Biết cách sử dụng máy đo quang phổ để xác định được hàm lượng ADNDNA và đánh giá được độ sạch của ADNDNA tách chiết được.. Máy đo quang phổ là thiết bị thường được sử dụng để xác định
Trang 1CHƯƠNG TRÌNH THỰC TẬP KỸ THUẬT DI TRUYỀN (1 TÍN CHỈ)
Số tiết 15
Số tiết quy đổi: 30 tiết
Bài 1 Kỹ thuật tách chiết DNA từ thực vật/động vật (5 tiết)
Bài 2: Kỹ thuật nhân dòng gen sử dụng vector plasmid (5 tiết)
Bài 2 Kỹ thuật điện di ADN trên gel agarose (5 tiết)
Bài 3 Kỹ thuật PCR (5 tiết)
Bài 4 Kỹ thuật chỉ thị phân tử (5 tiết)
Bài 5 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose (5 tiết)Kỹ thuật nhân dòng gen sử dụng vector plasmid (5 tiết)
Bài 6 Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (5 tiết)
Trang 2BÀI 1
KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA TỪ THỰC VẬT/ĐỘNG VẬT
1 Mục đích, yêu cầu
- Sinh viên nắm được một quy trình tách chiết ADNDNA tổng số điển hình ở thực vật/động vật
- Biết cách sử dụng máy đo quang phổ để xác định được hàm lượng ADNDNA và đánh giá được
độ sạch của ADNDNA tách chiết được
- Giải thích được vai trò của các hóa chất, đệm chiết của từng bước trong quy trình tách ADNDNA
2 Kỹ thuật tách chiết DNA
2.1 Quy trình tách chiết DNA từ mô thực vật (mô lá khoai tây/lúa)
a/ Nguyên liệu: Mô lá cây khoai tây/lúa
Để tăng hiệu quả tách chiết DNA, không chọn mô lá quá già (chứa nhiều các chất trao đổi thứ cấp)
và chọn vào lúc trước khi cây quang hợp Lá sau khi lấy về được rửa sạch nhiều bằng nước cất vô trùng, xử lý cồn 25% trong 2 phút và tráng lại bằng nước cất vô trùng Bảo quản ở 40C Đối với mô
lá in vitro chỉ cần lấy lượng cần thiết cho tách chiết mà không cần xử lý mẫu.
- Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1)
- Hỗn hợp Chloroform: Isoamylalcohol (24:1)
- Ethanol 70% và 100%, SDS 10%, Sodium acetate 5M pH 5.,
- Đệm TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA)
- Cối chày sứ vô trùng, khay đá để đựng mẫu trong quá trình tách chiết DNA
- Pipet, đầu típ các loại, ống eppendorff 1.,5ml, cuvette…
- Máy li tâm, máy đo quang phổ
c/ Tiến hành thí nghiệm
1. Lấy mẫu lá lúa/khoai tây, cắt nhỏ bằng kéo vô trùng cho vào cối
2. Cho vào 300 µl đệm chiết, nghiền nát bằng cối chày sứ thành dung dịch đồng thể
3. Cho tiếp 400µl đệm chiết vào cối, nghiền và trộn đều sau đó đặt trên đá 5 phút
4. Ly tâm 13.000 rpm trong 8 phút
Trang 35. Chuyển phần dịch trong sang ống eppendorf mới
6. Thêm vào 700µl hỗn hợp Phenol: Chloroform:Isoamylalcohol (25:24:1)
7. Trộn đều nhẹ nhàng bằng cách đảo ngược ống sau đó li tâm 13.000 trong 8 phút
8. Hút 500 µl phần dịch trên sang ống eppendorf mới
9. Bổ sung 600µl Chloroform: Isoamyl alcohol (24 :1) và trộn đều như bước 7
10. Ly tâm 13000rpm/5 phút và hút 400 µl dịch trong lớp trên sang ống eppendorff mới
11. Thêm 800µl cồn tuyệt đối, trộn đều và để trên đá 5 phút
12. Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút, chắt bỏ cồn để thu tủa DNA ở đáy ống
13. Cho vào 500µl Ethanol 70%, voltex và ly tâm 13.000 vòng trong 5 phút
14. Chắt bỏ ethanol, làm khô tủa DNA trong không khí (hoặc ủ ở 50-600C trong 5 phút)
15. Hòa tan DNA trong 50µl TE và bảo quản ở -200C
16. Bảo quản DNA
2.2 Quy trình tách chiết DNA từ tế bào động vật (mẫu máu toàn phần)
* Dung dịch SDS 10% bổ sung trước khi sử dụng một lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch B
* Dung dịch Proteinase K (20 mg/ml) bổ sung trước khi sử dụng một lượng bằng 1/100 thể tích dung dịch B
1. Lấy 0.,3 ml máu toàn phần cho vào ống eppendorf 1.,5ml
2. Cho vào 0.,7 ml dung dịch lysis buffer (đặt trong đá)
Trang 43. Voltex nhẹ
4. Ly tâm 10.000 vòng/ phút ở 40C trong 5 phút, thu lấy tủa tế bào
a (Quá trình này lặp lại vài lần cho đến khi tủa tế bào có màu trắng)
2. Cho 0.,5 ml dung dịch đệm B, bổ sung 50 µl SDS 10% và 5 ul Proteinase K (20 mg/ml)
3. Ủ 550C từ 3-5h thỉnh thoảng lắc nhẹ cho đến khi tế bào bị phá vỡ hoàn toàn
4. Cho 0.,7 ml Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1)
5. Voltex nhẹ
6. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 7 phút
7. Thu phần dịch trong phía trên cho vào ống eppendorf mới
8. Lặp lại bước 7 đến bước 9 từ 2 đến 3 lần
9. Cho 0.,4 ml Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)
16. Hòa tan DNA trong TE hoặc nước cất vô trùng
17. Bảo quản DNA
3 Xác định hàm lượng và độ sạch của ADNDNA
Để xác định hàm lượng và độ sạch của ADNDNA có nhiều phương pháp được sử dụng bao gồm: phương pháp mật độ quang (đo độ hấp phụ), phương pháp điện di, phương pháp nhuộm phân
tử ADNDNA bằng fluorescent Tuy nhiên xác định hàm lượng và độ sạch của ADNDNA trong đó
sử dụng máy đo quang phổ là đơn giản nhất và được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm
Trang 5Máy đo quang phổ là thiết bị thường được sử dụng để xác định hàm lượng một số chất như Protein, ADNDNA, chlorophil, tinh bột… trong dung dịch dựa vào mức độ hấp thụ cực đại ở các bước sóng ánh sáng khác nhau tương ứng với mỗi loại dung dịch Dựa vào công thức hoặc đồ thị chuẩn có thể xác định được hàm lượng của các chất Hiện nay, một số máy hiện đại có thể hiển thị ngay các thông số của dung dịch cần đo như hàm lượng protein, ADNDNA, polysacharide…
Hàm lượngNồng độ ADNDNA được xác định bằng công thức:
[ADNDNA] = OD260 × 50 × X x conversion factor(µg)Trong đó:
- X: là số lần pha loãng từ dung dịch ADNDNA gốc ban đầu
- (ng/50 µ l hoặc µ g/ml): hệ số nồng độ dsDNA A260 dsDNA = 50 ng/µ l ( hoặc µ g/ml)
- conversion factor: hệ số chuyển đổi Khi sử dụng cuvette có đường kính 10 mm ( độdài mà ánh sáng đi qua mẫu là 10 mm – path lenghth) thì hệ số này bằng 1 Khi sử dụng cuvette khác, với độ dài ánh sáng đi qua mẫu thay đổi thì hệ số này cũng thay đổi Giả sử với cùng một mẫu, khi sử dụng cuvette có path length = 10 mm thì hệ số chuyển đổi bằng 1, trong khi đó sử dụng cuvette có path lenghth = 2 mm thì hệ số chuyển đổi bằng 10/2 = 5 vì lúc này giá trị OD cũng bị giảm đúng bằng 10/2 = 5 lần
- Đơn vị của nồng độ DNA : ng/µ l hoặc µ g/ml
Hàm lượng DNA được xác định bằng công thức:
Nồng độ DNA x tổng thể tích mẫu
Độ sạch ADNDNA được xác định bằng tỉ số OD260/OD280 Nếu tỉ số này > 1,7 thì dung dịch ADNDNA đem đo được coi là sạch Khái niệm sạch ở đây là lượng protein còn lại trong dung dịch DNA DNA tách được
Trang 6BÀI 2
KỸ THUẬT NHÂN DÒNG GEN SỬ DỤNG VECTOR PLASMID
1 Mục đích, yêu cầu
- Sinh viên nắm được thành phần môi trường và biết cách pha chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn
- Sinh viên hiểu và giải thích được nguyên lý kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp dựa trên cơ sở của một Kit nhân dòng (Cloning KIT)
- Giải thích được nguyên lý quá trình nuôi cấy vi khuẩn, chọn lọc thể tái tổ hợp
- Giải thích được quá trình biến nạp nhờ sốc nhiệt
- Biết cách cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng và môi trường đặc
- Biết cách bảo quản và lưu giữ vi khuẩn
- Giải thích được quá trình chọn lọc
- Giải thích được nguyên lý của các bước thí nghiệm và vai trò của các hoá chất đã sử dụng
- Sinh viên phải ghi chép đầy đủ các bước trong quá trình thực tập và giải thích được các quá trình đó
2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ
Vật liệu
• Clone Jet PCR Cloning Kit TM
- pJET1.2/blunt cloning vector (50 ng/µl)
- 2X Reaction Buffer
- T4 DNA Ligase (5u/µl)
- pJET1.2 Forward Sequencing Primer (10 µM)
- pJET1.2 Reverse Sequencing Primer (10 µM)
- Control PCR production (24 ng/µl)
- Water, nuclease-free
• DNA ngoại là một đoạn DNA thu được bằng PCR (sử dụng Taq DNA polymerase)
• Tế bào E coli khả biến ( E coli TOP10)
Trang 7- Box cấy vô trùng, máy lắc…
- Máy ổn nhiệt (Water bath)
- Tủ định ổn
3 Cách tiến hành thí nghiệm
3.1 Chuẩn bị môi trường
• Môi trường S.O.C
3.2 Thực hiện phản ứng nối đoạn DNA vào vector nhân dòng
• Thực hiện phản ứng nối (ligation) đoạn DNA vào vector nhân dòng pJET1.2/blunt
Trang 83.3 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ
- Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ lạnh sâu: -800 C, để tan từ từ trong đá
- Bổ sung 5 µl sẩn phẩm lai vào 50 µ l tế bào khả biến, trộn đều
- Để trong đá lạnh từ 20-30 phút
- Sốc nhiệt 45 giây ở nhiệt độ 42 C 0
- Bổ sung ngay 500 l môi trường S.O.C và nuôi lắc 200rpm ở 37µ 0 C trong 1 giờ
3.4 Nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường chọn lọc
- Lấy 50, 100, 150 µl dịch vi khuẩn nuôi cấy trải trên môi trường chọn lọc:
- Nuôi cấy ở 37 C qua đêm (12-16 h).0
- Vi khuẩn E.coli thuộc loại Gram âm, có khả năng gây bệnh do đó các thao tác phải lưu ý tránh
lây nhiễm cho người và giảm tạp nhiễm cho các thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn khác
- Để đảm bảo cho thí nghiệm thành công cần lưu ý khử trùng môi trường tốt để tránh tạp nhiễm
- Khi lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ lạnh sâu phải để tan từ từ trong đá
- Lưu ý thời gian và nhiệt độ trong quá trình biến nạp
Bài 2
KỸ THUẬT ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE
1 Mục đích, yêu cầu
- Sinh viên phải hiểu được nguyên lý của quá trình điện di
- Biết cách sử dụng máy điện di, nguồn điện một chiều
- Biết cách tạo gel, nhuộm màu và sử dụng máy chụp ảnh
2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ
- a Vật liệu: ADN tách chiết từ bài 1
b Hóa chất:
Trang 9- Đệm chạy điện di TAE hoặc TBE
- Đệm mẫu (loading dye)
- Dung dịch Ethilium Bromide 0,01 %
3 Chạy điện di trên gel agarose
3.1 Đổ gel agarose 1 %
1. Cân 1 gam agarose cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt
2. Đổ 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc đều
3. Cho vào lò vi sóng, đun cho agarose tan hoàn toàn
4. Chuẩn bị khuôn và lược, đặt thăng bằng
5. Để agarose nguội từ từ đến 600C, bổ sung 3 µl ethilium bromide, lắc đều rồi đổ nhẹ nhàng và liên tục vào khuôn, tránh tạo bọt
6. Để cho agarose đông lại (15 phút), tháo bỏ lược, cho khuôn gel vào bể điện di
3.2 Chạy điện di
1. Đổ đầy đệm TAE 1X ngập khay điện di
2. Cắt một mảnh parafin, hút 2µl dung dịch đệm mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu DNA
3. Hút 5µl dung dịch ADN trộn đều với dung dịch đệm mẫu và nhỏ vào các giếng điện di
4. Cắm điện cực sao cho dòng điện chạy từ (-) (+) tính từ giếng
5. Bật nguồn điện di đặt cố định theo hiệu điện thế hoặc cường độ dòng điện
Trang 10BÀI 33
KỸ THUẬT PCR
1 Mục đích, yêu cầu
- Qua bài thực hành sinh viên sẽ hiểu rõ hơn nguyên lý của kỹ thuật PCR
- Sinh viên nắm phải biết được vai trò của các thành phần tham gia phản ứng PCR
- Biết cách vận hành và đặt chương trình chu trình nhiệt cho máy PCR
- Quan sát sản phẩm PCR sau khi điện di
2 Nguyên tắc
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra hiệu quả nhân dòng gen sử dụng vector nhân dòng và hiệu quả biến nạp vector nhân dòng vào vi khuẩn bằng PCR Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen housekeeping của khoai tây bằng phản ứng PCR Quá trình này được lặp lại nhiều lần để tổng hợp hàng triệu bản sao của đoạn gen từ một vài phân tử ban đầu, qua đó có thể phát hiện được đoạn gen mục tiêu dưới đèn UV sau khi điện di
3 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
3.1 Nguyên liệu: ADN tách chiết từ bài 1 Khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường chọn lọc sau biến nạp 3.2 Hóa chất và thiết bị:
- Cặp mồi Forward và Reverse
- Enzym DNA polymerase (Taq)
- Pipet, đầu tip các loại, ống eppendorff 50 µl khử trùng
- Máy PCR, máy điện di ADNDNA, máy chụp gel
4 Tiến hành thí nghiệm
4.1 Chuẩn bị phản ứng PCR
- Sử dụng mồi Po-ef1α có trình tự: F: TTGGAAACGGATATGCTCCA
Trang 114.3 Chạy điện di agarose kiểm tra sản phẩm PCR
Các bước chạy điện di được thực hiện theo các bước trong bài thực tập 52, sử dụng agarose 12%, hiệu điện thế 70V, ladder 1kb Sản phẩm mong muốn có kích thước 174 bp
- Sinh viên cần phải ghi chép cẩn thận các bước và thành phần phản ứng (rất có thể quên hoặc bỏ sót trong quá trình thao tác)
Trang 12BÀI 4
KỸ THUẬT RAPD TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
1 Mục đích, yêu cầu
- Qua bài thực hành sinh viên sẽ hiểu rõ hơn nguyên lý của kỹ thuật RAPD
- Sinh viên nắm phải biết được vai trò của các thành phần tham gia phản ứng PCR
- Biết cách vận hành và đặt chương trình chu trình nhiệt cho máy PCR
- Quan sát sản phẩm PCR sau khi điện di
2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1 Nguyên liệu: ADNDNA tách chiết từ bài 1
- Enzym DNA polymerase (Taq)
- Microp Pipette, đầu tip các loại, ống eppendorff 50 µl khử trùng
- Máy PCR, máy điện di ADNDNA, máy chụp gel
Trang 13dNTP 2 mM 2,0
3.2 Chạy điện di agarose kiểm tra sản phẩm PCR
Các bước chạy điện di được thực hiện theo các bước trong bài thực tập 2, sử dụng agarose 2%, hiệu điện thế 70V, ladder 1kb
4 Phân tích kết quả RAPD
Bản gel chạy điện di sản phẩm của kỹ thuật RAPD được phân tích bằng cách ghi điểm cho
sự có mặt hay không có mặt của các vạch băng trong từng hàng Các băng này có thể dễ dàng chuyển sang dạng số liệu nhị nguyên (có băng = 1, không có băng = 0)
Số liệu sau đó được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng (ví dụ: NTSYS pc, PopGene )
o + Tính lặp lại (yêu cầu phải lặp lại thí nghiệm)
o + Độ đậm
o + Kích thước
o + Sự phân ly mong muốn quan sát được
Trang 14Bài 5
KỸ THUẬT ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE
1 Mục đích, yêu cầu
- Sinh viên phải hiểu được nguyên lý của quá trình điện di
- Biết cách sử dụng máy điện di, nguồn điện một chiều
- Biết cách tạo gel, nhuộm màu và sử dụng máy chụp ảnh
- Đệm chạy điện di TAE hoặc TBE
- Đệm mẫu (loading dye)
- Dung dịch Ethilium Bromide 1 %
3 Chạy điện di trên gel agarose
3.1 Đổ gel agarose 1 %
7. Cân 1 gam agarose cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt
8. Đổ 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc đều
9. Cho vào lò vi sóng, đun cho agarose tan hoàn toàn
Trang 1510. Chuẩn bị khuôn và lược, đặt thăng bằng.
11. Để agarose nguội từ từ đến 60 C, bổ sung ethilium bromide đạt nồng độ 0.5 0 µ g/ml, lắc đều rồi đổ nhẹ nhàng và liên tục vào khuôn, tránh tạo bọt
12. Để cho agarose đông lại (khoảng 15 phút), tháo bỏ lược, cho khuôn gel vào bể điện di
3.2 Chạy điện di
6. Đổ đầy đệm TAE 1X ngập khay điện di
7. Cắt một mảnh parafin, hút 2µ l dung dịch đệm mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu DNA
8. Hút 5µ l dung dịch DNA trộn đều với dung dịch đệm mẫu và nhỏ vào các giếng điện di
9. Cắm điện cực sao cho dòng điện chạy từ (-) (+) tính từ giếng
10. Bật nguồn điện di đặt cố định theo hiệu điện thế hoặc cường độ dòng điện
Trang 16BÀI 5
KỸ THUẬT NHÂN DÒNG GEN SỬ DỤNG VECTOR PLASMID
1 Mục đích, yêu cầu
- Sinh viên nắm được thành phần môi trường và biết cách pha chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn
- Sinh viên hiểu và giải thích được nguyên lý kỹ thuật tạo ADN tái tổ hợp dựa trên cơ sở của một Kit tách dòng (Cloning KIT)
- Giải thích được nguyên lý quá trình nuôi cấy vi khuẩn, chọn lọc thể tái tổ hợp
- Giải thích được quá trình biến nạp nhờ sốc nhiệt
- Biết cách cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng và môi trường đặc
- Biết cách bảo quản và lưu giữ vi khuẩn
- Giải thích được quá trình chọn lọc “trắng/xanh”, chọn lọc dương tính “sống/chết”
- Giải thích được nguyên lý của các bước thí nghiệm và vai trò của các hoá chất đã sử dụng
- Sinh viên phải ghi chép đầy đủ các bước trong quá trình thực tập và giải thích được các quá trình đó
2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ
Vật liệu
Trang 17• Clone Jet TM PCR Cloning Kit
- pJET1.2/blunt cloning vector (50 ng/µl)
- 2X Reaction Buffer
- T4 DNA Ligase (5u/µl)
- pJET1.2 Forward Sequencing Primer (10 µM)
- pJET1.2 Reverse Sequencing Primer (10 µM)
- Control PCR production (24 ng/µl)
- Water, nuclease-free
• DNA ngoại là một đoạn DNA thu được bằng PCR (sử dụng Taq ADN polymerase)
• Tế bào E coli khả biến (E coli TOP10)
- Bình nón 250ml, đĩa petri, que cấy vô trùng
- Box cấy vô trùng, máy lắc…
- Máy ổn nhiệt (Water bath)
Trang 183.2 Thực hiện phản ứng nối đoạn DNA vào vector nhân dòng
• Thực hiện phản ứng nối (ligation) đoạn DNA vào vector nhân dòng pJET1.2/blunt
Tổng thể tích 10 µl
- Trộn nhẹ, spin 3-5s
- Ủ hỗn hợp phản ứng ở 14oC trong tối thiểu 4 giờ (thường để qua đêm)
3.3 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ
- Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ lạnh sâu: -800C, để tan từ từ trong đá
- Bổ sung 2µl sản phẩm lai (sử dụng vector pCR2.1) hoặc 5 µl sẩn phẩm lai (sử dụng vector pJET1.2/blunt) vào 50 µl tế bào khả biến, trộn đều
- Để trong đá lạnh từ 20-30 phút
- Sốc nhiệt 45 giây ở nhiệt độ 420C
- Bổ sung ngay 500 µl môi trường S.O.C và nuôi lắc 200rpm ở 370C trong 1 giờ
3.4 Nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường chọn lọc
- Lấy 50, 100, 150 µl dịch vi khuẩn nuôi cấy trải trên môi trường chọn lọc:
LB + 100 mg/L Ampicillin (sử dụng vector pJET1.2/blunt)
LB + 100 mg/L Ampicillin + 0.5 mM IPTG + 80 mg/L X-gal (sử dụng vector pCR 2.1)
- Nuôi cấy ở 370C qua đêm (12-16 h)
3.5 Quan sát kết quả
