Mục tiêu - Sinh viên hiểu được vai trò của enzyme DNA polymerase trong quá trình nhân đôi tế bào thông qua việc ức chế hoạt động của enzyme này bởi chất ức chế đặc hiệu.. - Sinh viên bi
Trang 1Bài 5 DNA POLYMERASE, SAO CHÉP DNA VÀ SỰ NHÂN ĐÔI CỦA TẾ BÀO
1 Mục tiêu
- Sinh viên hiểu được vai trò của enzyme DNA polymerase trong quá trình nhân đôi tế bào thông qua việc ức chế hoạt động của enzyme này bởi chất ức chế đặc hiệu
- Sinh viên biết cách nuôi cấy vi khuẩn E.coli, đếm số lượng tế bào bằng phương pháp đo
quang phổ và xác định tế bào sống bằng cách đếm khuẩn lạc
2 Cơ sở khoa học
Để nhân đôi tế bào (nguyên phân) tế bào phải nhân đôi DNA trong pha S (hình 1) Enzyme DNA polymerase thực hiện quá trình sao chép DNA Nếu DNA không được sao chép tế bào sẽ không thể phân chia Trong tự nhiên nhiều hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của enzyme DNA polymerase vì thế chúng sẽ ức chế phân chia tế bào
Hình 1 Chu kỳ tế bào
Một số hợp chất thuộc loại glycolipid ở thực vật bậc cao (hình 2) có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNA polymerase như: monogalactosyl diacylglycerol (MGDG), digalactosyl diacylglycerol (DGDG) và sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG)
Trang 2Hình 2 Các hợp chất có khả năng ức chế DNA polymerase ở lá cây spinach
Gần đây MGDG được sử dụng làm chất kháng viêm và ứng chế phát triển khối u ung thư dạ dày thông qua tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNA polymerase Khi tế bào đang tiến hành nhân đôi, MGDG ức chế làm cho tế bào dừng phân chia ngay ở kỳ G1, dẫn đến kích hoạt cơ chế tự chế của tế bào (apoptosis) (hình 3)
Hình 3 Cơ chế ức chế quá trình tái bản DNA bởi MGDG
Trong bài thực hành, sinh viên sẽ thực hiện thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng của MGDG lên hoạt động của enzyme DNA polymerase thông qua đánh giá sự nhân lên của
tế bào vi khuẩn E.coli tăng lên theo thời gian nuôi cây trong môi trường dinh dưỡng có bổ
xung MGDG
Trang 33 Vật liệu, hóa chất và thiết bị
- Dụng cụ:
o Bình nuôi cấy vi khuẩn 50 mL sạch, khử trùng: 10 bình
o Máy lắc ấm ở 37ºC: 1 máy có nhiều vị trí đặt bình nuôi
o Kính hiển vi + buồng đếm: 1 + 5
o Máy đo quang phổ: 1
o Cuvette
- Hóa chất:
o Môi trường nuôi cấy E.coli (Môi trường LB lỏng và đặc đã được pha sẵn)
o Monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) (C45H74O10) [MM29186, Carbosynth]
o NaCl 0.9%
- Trước buổi học 1 ngày, sinh viên tiến hành nuôi cấy vi khuẩn 1 bình có bổ sung 5µg/mL MGDG và 1 bình không bổ sung MGDG
4 Tiến hành thí nghiệm
Chia nhóm: Sinh viên chia thành 4-5 nhóm, mỗi nhóm 5 người
1 Chuẩn bị bình nuôi cấy: mỗi nhóm 2 bình ghi rõ ký hiệu
- Đổ 5 mL môi trường nuôi vào ống nghiệm
- Dùng pipet hút 0,25 ml dịch vi khuẩn E.coli cho vào mỗi bình
2 Bổ sung 5 µl MGDG nồng độ 5 µg/mL vào 1 bình (đánh dấu)
3 Nuôi cấy ở 37ºC, tốc độ lắc 200 vòng/ phút trong 24 giờ
4 Đánh giá sự phát triển (nhân lên) của vi khuẩn:
- Dừng máy lắc, hút 100 µl dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống eppendorf
- Pha loãng với nước cất theo tỉ lệ: 1/10, 1/100, 1/1000
- Đếm số lượng tế bào vi khuẩn bằng buồng đếm hoặc máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm và tính theo công thức 1 OD620 = 108 tế bào/mL
5 So sánh số lượng tế bào E.coli ở 2 bình để đánh giá hiệu quả ức chế enzyme DNA
polymerase của chất MGDG
5 Chú ý
- Sinh viên hiểu rõ mục đích bài thực hành và nắm được cách tiến hành thí nghiệm
- Sinh viên nuôi cấy được vi khuẩn E.coli và xác định được số lượng tế bào vi khuẩn
trong dịch nuôi cấy
6 Câu hỏi
1 Vai trò của enzyme DNA polymerase trong nguyên phân ở vi khuẩn?
2 Nêu tác dụng của chất ức chế monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) lên DNA polymerase và ứng dụng?
Trang 4KỸ THUẬT HỖ TRỢ:
Phương pháp định lượng tế bào vi khuẩn trong dung dịch
Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, định lượng gián tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục) bằng máy đo quang phổ -spectrophotometer UVvis, đếm số khuẩn lạc mọc trên một môi trường xác định
Trong bài 4, chúng ta sẽ tiến hành định lượng trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Quy trình có ưu điểm là nhanh chóng mật độ vi sinh vật trong mẫu nhưng có nhược điểm là không phân biệt giữa tế bào sống và tế bào chết
Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 - 3 mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh Đĩa đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô
là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có diện tích 1/400 mm2
Tiến hành
1 Chuẩn bị mẫu
- Pha loãng huyền phù tế bào với nước muối sinh lý 0.9%
- Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào vi sinh vật Để đạt được độ pha loãng như vậy cần phải ước lượng được số lượng vi sinh vật trong mẫu, đồng thời phải thử vài lần trong quá trình pha loãng
2 Đếm trên kính hiển vi
Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ) Đếm
số tế bào hiện diện trong 1 ô lớn Sau đó, chỉnh thị trường tìm 1 ô lớn khác Đếm số tế bào của ít nhất 5 ô lớn Công thức tính mật độ tế bào:
