Đề tài liệu pháp gene

trẻ em mắc bệnh này thuờng không chống lại đuợc sự lây nhiễm của bệnh tật và rất khó sống đến tuổi trưởng thành, tuổi thơ của chúng luôn mắc bệnh tật.Ashanti được lập một hành lang bảo v

Chủ đề: LIỆU PHÁP GEN

Nhóm thực hiện: 16

Nguyễn Thị Thu Thanh

Le Thị Như Thảo

Phạm Thị Huyền Trang

Phan Thị Anh Văn

NHŨNG NỘI DƯNG CHÍNH

I GIỚI THIỆU CHUNG

II LIỆU PHÁP GEN VÀ CÁC BƯỚC cơ BẢN CỦA LIỆU PHÁP GEN

III CÁC YẾU TÓ TRONG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN

IV ÚNG DỤNG VÀ TRIỂN VỌNG

I GIỚI THIỆU CHUNG:

Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khoẻ quốc gia Mỹ(Ư.S.National Instituse ò Helth) đã tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu phấp gen đầu tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên là severe combined immune deíĩciency (SCDI), cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và có thế bị tốn thưong khi mắt phải bất kì mầm bệnh nào trẻ em mắc bệnh này thuờng không chống lại đuợc sự lây nhiễm của bệnh tật và rất khó sống đến tuổi trưởng thành, tuổi thơ của chúng luôn mắc bệnh tật.Ashanti được lập một hành lang bảo vệ xung quanh, không tiếp xúc với những người ngoài gia đình, trong môi trường vô trùng tại nhà

và được điều trị thường xuyên với kháng sinh liều cao

Trong thủ tục liệu pháp gen của Ashanti, bác sĩ đã tách các tế bào máu trắng ra khỏi cơ thể cô ta, cho chúng phát triển trong phòng thí

Mặc dù sự giải thích đơn giản về liệu pháp gen này dường như có kết quả khả quan, nhưng nó mở đầu cho một cuộc tranh luận kéo dài; con đường để liệu pháp gen được chấp nhận chứa đầy những cuộc tranh luận Liệu pháp gen sinh học ở người là rất phức tạp, một số công nghệ cần được phát triển và những căn bệnh cần được hiểu biết cặn kẽ hơn trước khi liệu pháp gen có thế được sử đụng một cách thích đáng

Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng, ngày nay liệu pháp gen là một lĩnh vực khống lồ với cơ hội sinh lời lớn cho các nhà đầu tư có hiếu biết Bằng chứng là sự phát triển của các nghiên cứu về liệu pháp gen trong hơn một thập kỷ qua Lĩnh vực này có tiềm năng vô cùng to lớn, một số người đã so sánh tiềm năng đầu tư trong công nghệ sinh học đặc biệt là liệu pháp gen với kinh nghiệm về công nghệ những năm 1980

II LIỆU PHÁP GENE VẤ CÁC BƯỚC cơ BẢN TRONG LIỆU PHÁP GENE

1, Định nghĩa:

Trong các ứng dụng của sinh học phân tử vào y học, liệu pháp gen đối với các rối loạn di truyền mở ra nhiều triển vọng nhất, đồng thời cũng

là hướng ứng dụng khó thực hiện nhất Các định nghĩa về liệu pháp gen được thay đổi theo thời gian, ngày nay không có định nghĩa chung nào được chấp nhận cho khái niệm này Song định nghĩa sau đây được

sử dụng rộng rãi nhất trong các diễn đàn Quốc tế

Liệu pháp gen là kĩ thuật đưa gen lành vào cơ thế đế thay thế cho gene bệnh hay đưa gene cần thiết nào đó thay vào vị trí gene bị sai hỏng để đạt được mục tiêu của liệu pháp

2, Các loại gene trị liệu:

- Liệu pháp gene tế bào soma( Somatic Gene Therapy): là phương pháp điều trị thay hoặc sửa chữa các gen hỏng, gen gây bệnh của các

tế bào soma trong cơ thể bệnh nhân Liệu pháp gen soma có thể sử dụng một số loại tế bào như tế bào lympho, nguyên bào sợi, tế bào

- Chọn vector chuyển gen phù hợp với gen trị liệu và nối chúng lại với

nhau

-Tạo các vectơ tái tổ hợp và đua các vectơ mang gen trị liệu vào tế bào chủ và nhân lên

- Chọn lọc các trình tự quan tâm, theo dõi sự hoạt động và những biểu

hiện của gen trị liệu

+ ưu điểm

Mở ra một hướng mới để điều trị các bệnh nan y, mà không dùng hoá chất đế trị liệu nên không gây độc cho co thể

+ Nhược điểm

Khó thực hiện

Tổng quan:

Liệu pháp gen tiêu biểu cho sự mở rộng hợp lý của y sinh (Bio-medicine) Một ví dụ thường gặp là sử dụng ADN tái tổ họp sản xuất các phân tử có hoạt tính sinh học (như insulin) để chữa trị và kiềm chế bệnh tật Sự thành công của sinh học phân tử và các dự án về bộ gen người đã tạo bước đột phá trong việc tim ra các gen liên quan đến bệnh, liệu pháp gen từ lý thuyết trở thành thực tiễn Ngày nay, có trên

533 thử nghiệm y học tập trung vào liệu pháp gen với hon 8.000 người bệnh tham gia Một số hãng công nghệ sinh học nổi bật có các sản phẩm trong các thử nghiệm y học rất sớm, và một vài dự đoán phân tích rằng liệu pháp gen, như một lĩnh vục, có thể đem lại lợi nhuận trước năm 2005 Tuy nhiên, các yếu tố tích cực này cũng ngang bằng với sự không hiểu biết sinh học của chuyển gen (nhân tố phức tạp và không được biết đến hoàn toàn) và ảnh hưởng của các sự kiện hiện tại trong ý kiến cộng đồng về y học phân tử

2 Cơ sở của sinh học phân tử

qua đó các protein đặc hiệu được biểu hiện Các vùng khác của DNA không mang mã và là phần quan trọng để bảo tồn cấu trúc nhiễm sắc thể Thành phần này của của DNA vô cùng quan trọng trong các dự án

về bộ gen, tính tuần hoàn đoạn của DNA trong các vùng không mang

mã có thể được kết hợp với các gen đã biểu hiện, cho chúng ta phương pháp tìm kiếm các gen chưa biết

Tự nhiên đã phát triển một cách thức rất thông minh mà qua đó các protein đặc hiệu chỉ được biểu hiện trong các mô dặc hiệu DNA sắp thành các sợi dài gọi là nhiễm sắc thể Có hai bản sao của mỗi gen tồn tại trong tế bào Tuy nhiên có một số trường hợp ngoại lệ, các gen tồn tại trong các nhiễm sắc thể X và Y (nhân tố quyết định giới tính)

có thể chỉ có duy nhất một bản sao

Thông tin được truyền từ DNA đến các cơ quan phức tạp hơn Quá trình phiên mã được bắt đầu bởi các phân tử nhận biết đặc hiệu

có tên là các nhân tố phiên mã (nhân tố gắn với các chuỗi điều hoà của gen và cho phép sự sao chép được tiến hành) Bản sao được tạo thành từ phân tử ban đầu gọi là RNA trong nhân tế bào Bản sao sau

đó ra khởi nhân tế bào, chuyến đến lưới nội chất, nơi mà nó sẽ được dịch mã tống hợp thành protein

3 Cơ sở của liệu pháp gen:

Đe chuyến gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:

- Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà thích họp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện trong các mô mà thông thường chúng được biếu hiện

Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởi động, hoạt hoá trong tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngày nay) hoặc có thể kết nối với các trình tự có thể hoạt hoá hay bất hoạt như một công tắc Những thao tác như vậy có thể đạt được bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

+ DNA có thể được sử dụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển viras (viral transfer shuttle) Đây là phương pháp chuyến DNA hầu như chắc chắn nhất DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể xuyên qua lớp màng lipit kép, nhưng vector viras dễ dàng làm việc này

+ DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau

để khuếch đại khả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó

- Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh (như tế bào

tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh Trong tương lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi trường mô tế bào

và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng

Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng Khi chọn phương pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:

+ Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu

+ Sau đó, gen chuyến đối phải được điều hoà đúng đắn Nó phải được hoạt hoá đúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng

Những vấn đề này là rào cản to lớn cho sự phát triển và phổ biến của liệu pháp gen Hiện nay đích ứng dụng quan trọng nhất của liệu pháp gen là các bệnh hiểm nghèo, ở đó mô bệnh dễ dàng bị ảnh hưởng và những bệnh mà sự điều hoà chính xác của gen được chuyển là không cần thiết Đúng như mong muốn, hiệu quả của liệu pháp trong các trường hợp này dễ dàng quản lý

Sự tinh vi của chúng ta trong thiết kế vector và promotor ngày càng tăng, mở ra nhiều triển vọng mới cho những ứng dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo (như bệnh đái đường) thông qua sự tập họp thông tin của các dự án về bộ gen người mà ở đó sự điều hoà gen là phức tạp

Đạc cliém RetroviraJ

Vectors

Adenovirn]

Vectors

Hei pes Simpiex ViraJ Vectors

Đạc tinh Chì nhiễm trong

các tế bào Nhiễm các tế bàoỊrhOn g phân Neurotropic Hợp nhất trongcác tế bào Bien phap Ex vivo hoặc

nhiễm truc Ex vivo hoặcnhiễm trực Ex vivo hoặcnhiễm trực Chi ex vivo

Thoi gian

biêu hienTót Thởi gian ngắn Thời gian ngắn Khả nang t6t

Van de an

toan Nhiễm các genđột biến Phin úng viêm Nhiễm các gen

đột biến Tính độc củaProtein rep,

Nhiễm các

a Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng của nó

Sự sử dụng virus trong liệu pháp gen dựa trên các chức năng cơ bản của nó:

- Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào Virus chứa vật

chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein Đầu tiên, virus gắn tới các tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thế (hay một chuỗi các điếm thụ thể) trên bề mặt tế bào Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào

- Sự phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen được mang bởi virus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc thể và DNA nhân tồn tại Các gen đặc hiệu được mang và được tiếp hợp bởi virus sẽ phiên mã tổng hợp RNA và dịch mã tạo thành protein để tạo nên chức năng mong muốn hay sản phấm của liệu pháp

- Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen Hơn nữa, hiệu quả cuối cùng của chúng đối với các gen chức năng trong tế bào không giống nhau và có thể khác nhau từ tế bào này đến tế bào khác hoặc mô của cơ quan này đên mô cơ quan khác

Những vấn đề này hưởng lớn tới thuận lợi y học và thành công của chiến lược liệu pháp gen dựa trên vector virus

Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã được xác định Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để ngăn cản sự truyền đi không mong muốn của vector

r r

hAAT {genomic)

AdGS85

b Vector Adenovirus:

Một trong những vector liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng

là vector có cơ sở adenovirus Adenovirus gây bệnh khó thở ở người (cảm lạnh, nhiễm trùng dạ dày) và có 47 dạng khác nhau (gọi là kiểu huyết thanh) được tìm thấy ở người Kiểu 2 và 5 được sử dụng chung

Hình 1: Adenovirus có cấu trúc chung chứa capsid hai mươi mặt bao quanh bộ gen dsDNA dài xấp xí 36kbp vỏ capsid của virus chứa ba protein: hexon, fiber và base penton Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt hai mươi mặt, trong khi các penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 “chóp ” ngoài vỏ virus đỏng vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử.

Điểm đầu tiên trong sản xuất vector liệu pháp gen là lấy đi gen điều khiển tái bản (sự phát triển) của virus trong mô Sự sinh sản và phát triển của một lượng nhỏ virus mới là nguyên nhân chung cho những hiệu ứng độc do nhiễm virus

Bộ gen của adenovirus đã được nghiên cún khá kỳ, chứa DNA xoắn kép gồm 50 gen, dài 36 kilobase (KB) Gen E1 điều hoà phiên mã trong khi gen E2 và E3 điều hoà quá trình dịch mã của bộ gen Các vector đã tách gen này cho phép mang gen dài 8kb Trước đây, sự phát triển của các vector này dựa trên việc sử dụng virus giúp đỡ (helper virus) để cung cấp các chức năng của gen bị huỷ Tuy nhiên, ngày nay một dòng tế bào có giá trị thương mại đã được tạo ra để mang các gen bị xoá dạng vector Sự phát triến của các dòng tế bào này có thể làm adenovirus có giá trị thương mại và an toàn hơn Khi

đó rủi ro của việc sử dụng virus kiểu hoang dại được giảm bớt

Trên hết, sản phẩm vector này có hiệu quả, với nồng độ 1x1012 đoạn virus/ml đang được sản xuất Phép đo hoạt tính vector thực tế rất quan trọng trong liệu pháp gen Việc đo các phần tử vector đơn độc không bao hàm rằng tất cả các đoạn là nhiễm và do đó, có hoạt tính Hiện nay, có những cố gắng tiêu chuẩn hóa liều lượng và hoạt tính của các vector virus

DNA trên tế bào chủ Các tác động trở lại của vector adenovirus cũng

có thể gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh trên vật chủ, có nguy cơ dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng Trọng tâm nghiên cún hiện nay nhằm cải tiến vector adenoviras đích và giảm các phản ứng miễn dịch do virus gây ra, mang tới thành công đầy hứa hẹn trong việc sự sử dụng các vector phá huỷ bên trong (gutted vector) chỉ sử dụng vỏ ngoài của adenovirus

Sự phát triến thú vị khác là khả năng điều khiển vector adenovirus đích tới các nhóm tế bào đặc hiệu Công nghệ “retargeting” bao gồm việc sản xuất kháng thể cho protein thụ thể có vỏ adenovirus, nhân tố đuợc sử dụng đế gắn kết và gia nhập tế bào Kháng thể này được hợp nhất với kháng thể đơn dòng (monoclonal) chống lại protein đặc hiệu tồn tại trên bề mặt của tế bào Vector sau đó hoà trộn với kháng thế dung hợp Khi được sử dụng, chỉ những tế bào biểu hiện protein đặc hiệu được chữa trị bàng vector này Một số công ty (ví dụ: GenVec) sản xuất vector adenovirus đã biến đổi bề mặt điểm thụ cảm, điểm sẽ kết hợp với các tế bào khác nhau Việc phân loại của các vector khác nhau này cho phép adenovirus đích tới những mô khác nhau khi sử

hCMV promoter / hAAT cDNA AdSTK129 M HPRT l C 346 ►

Hình 2: Sơ đồ cấu trúc của vector adenovirus hiệu năng cao (high-capacity adenoviral) HC-Ad Tất cả các gen của virus HC-Ad bị xoá, chỉ còn đầu bên trải và phải của Ad5 và DNA thêm vào (stujfer DNA)

thu được từ gen C346 và HPRT AdSTK109 chứa bộ gen hAAT bao gồm liver và promoter macrophage đặc hiệu, trong AdGS85, hAAT cDNA được biếu hiện từ promoter cytomegalovirus của người ((hCMVpromoter) AdSTK129 chỉ chứa DNA thêm vào và không biếu hiện bất cứ gen chuyến nào.

Viral Ne*-Virai DMA G«ne DMA I- -1 " I I

Vectot

bmC9 to

cell

Moditied ONA mjected mto vector

ư.s N3tiori3l Lĩbr3P,«

Gene therapy using

an adenovỉrus vector

Cell makes using

Vêctor IS packaged

In veeicle

Vesicle break9 dov/n relea&mg

c Vector Adeno-associated Virus (AAV):

AAV là một parvoviras không xuất hiện trong các bệnh do vi sinh vật

ở người Viras này có thể chuyển DNA tới các tế bào không phân chia

và hoà nhập với DNA của tế bào chủ Điều này mở ra khả năng ứng dụng của một vector chống lại các bệnh kinh niên Trong dài hạn, sự biểu hiện của liệu pháp gen đã được chứng minh Virus này nhỏ do đó chỉ có thế mang những gen có kích thước giới hạn Nó cũng khó sản xuất hơn các vector khác nên tính thương mại hiện nay bị hạn chế

Có 6 kiểu huyết thanh (serotype) của AAV, kiểu 2 thường được sử

1 ĩkõ 1 y/

không thể chuyển được các gen phức tạp với kích thước lớn Một số phương thức được đề ra đế giải quyết vấn đề này

Một trong số đó là kỹ thuật liên kết bộ gen vector để phân cắt một số gen hợp nhất (cooperating gene) và phân phối chúng tới đích, sử dụng hai vector phân cắt

Một cách trung gian là sự nhân bản của các vector dung hợp sử dụng lóp vỏ của adenovirus kết hợp với bộ gen của vector AAV Điều không thuận lợi của phương pháp là vector này đòi hỏi sự giúp đỡ của adenovirus để được tổng hợp Điều này có thể dẫn đến sự hợp tác mạo hiểm với vector adenovirus (phản ứng miễn dịch) Gần đây, 3

I - -1 VP3 -E

B Vector Genome

'LR Promoter Transgene PA'ĩs

|~1 3CZZĨIZZZZZ}-I-|

c

ụ Inverted Terminal Repeat

aas

r «*■ -d A ;r-A ;v- >- > Ayq _t 5'

TRS

ã c

ọ ?

c ã

c

- (A) bản đồ bộ gen của AAV hoang dại chứa các khung đọc (reading frames) Rep và Cap, các promoter (p5, pl9, và p40), polyadenylation site (pA), và inverted terminal repeats (ITR) Quá trình phiên mã của virus mã hoá các protein Rep và Cap (VP1-3) khác nhau đuợc vẽ duới bộ gen Các protein Rep nhỏ hơn được dịch mã từ các điếm khởi đầu nội tại (internal initiation sites)

- (B) bản đồ của vector AAV, cho thấy sự thay thế các gen Rep và Cap của virus với băng chuyển gen (promoter, transgene cDNA và polyadenylation site)

- (C) Cấu trúc bậc hai của AAV ITR, với các vùng gắn Rep (RBS)

Thuận lợi chính của hệ thống vector AAV là nó hoà nhập với nhiễm sắc thể của tế bào chủ Điều này cho phép các vector được chuyển biểu hiện một cách ổn định và lâu hơn Nhưng thật không may, nếu AAV kiếu hoang dại hoà nhập tại điếm đặc hiệu trong nhiễm sắc thế

19 thì các vector tái tổ hợp lại mất tính đặc hiệu này và hoà nhập tuỳ tiện Cho dù vậy, một vài thành công trong nghiên cún trên động vật

và người đã cho thấy rằng, sự biểu hiện ổn định có thể đạt được với

Hình 4: Quả trình phiên mã của vector AA V Các bước khác nhau cần cho quá trình phiên mã của vector AA V bao gồm: đầu tiên AA V tương tác với các receptor đa dạng và các phân tử coreceptor trên bền mặt tế bào, sự tiếp thu vỉrion, nhân vào trong tế bào và giải phóng bộ gen mạch đơn vua vector, sự lai của bộ gen đưa vào bo sung (complementary input genomes) và sự hoà nhập nhiêm sắc thế trước biếu hiện gen có thế xảv ra từ khuôn xoắn kép DNA cấu trúc bậc hai tiềm tàng của bộ gen vector bô sung (episomaỉ) xuất hịên như các phân tử vector RNA đã được mã hoả.