Giáo trình thực tập sinh học đại cương

Nêu được các thành phần cấu tạo của kính hiển vi quang học và sử dụng được kính hiển vi để quan sát tế bào.. - Cần kính: là chỗ cầm kính hiển vi khi di chuyển kính, ở đầu mang thị kính,

4 Sinh viên phải đọc bài thực tập trước khi đến phòng thực tập

5 Trong giờ thực tập, sinh viên phải đội mũ, mặc áo blouse (có gài nút), đeo

bảng tên và tắt chuông điện thoại Không tự ý sử dụng máy móc khi chưa có

sự cho phép của giảng viên

6 Sau mỗi buổi thực tập, sinh viên phải sắp xếp dụng cụ đúng vị trí, vệ sinh sạch sẽ phòng thực tập Tắt tất cả các thiết bị điện trước khi ra về

7 Sinh viên làm hư hỏng, bể vỡ dụng cụ phải đền trước khi môn học kết thúc

thì mới được dự thi hết môn

8 Sinh viên phải thực hiện đúng quy định phòng cháy, chữa cháy

MỤC LỤC

PHẦN A SINH HỌC TẾ BÀO 1

Bài 1 KÍNH HIỂN VI - QUAN SÁT TẾ BÀO NHÂN SƠ VÀ TẾ BÀO NHÂN CHUẨN 2

1 Kính hiển vi quang học 2

2 Phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi 5

3 Thực hành: Quan sát tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn 6

Bài 2 MỘT SỐ BÀO QUAN, CHẤT DỰ TRỮ VÀ CHẤT CẶN BÃ CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT 7

1 Các bào quan 7

2 Chất dự trữ 8

3 Chất cặn bã 9

Bài 3 TÍNH THẤM QUA MÀNG TẾ BÀO – NGUYÊN PHÂN 10

1 Màng tế bào 10

2 Nguyên phân 11

PHẦN B SINH HỌC PHÂN TỬ 12

Bài 1 KỸ THUẬT CƠ BẢN 13

1 Một số dụng cụ cơ bản 13

2 Cách cân pha hóa chất cần thiết 15

Bài 2 AN TOÀN THÍ NGHIỆM – CÁC PHƯƠNG PHÁP THANH TRÙNG 17

1 An toàn phòng thí nghiệm cơ bản 17

2 Xử lý chất thải 18

3 Phương pháp khử trùng 18

Bài 3 CHIẾT TÁCH PLASMID PBLUESCRIPT TỪ E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MẪU NHỎ (MINIPREP) 22

1 Nguyên tắc 22

2 Nguyên vật liệu 22

3 Thực hành 22

Bài 4 CHIẾT TÁCH ADN BỘ GEN TỪ TẾ BÀO MÁ Ở NGƯỜI 24

1 Vật liệu – hóa chất 24

2 Nguyên tắc 24

3 Phương pháp tiến hành 25

Bài 5 CHIẾT TÁCH ADN TỪ MÔ THỰC VẬT 26

1 Phương pháp MITSUI 26

2 Phương pháp CTAB 27

Bài 6 KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠN ADN 29

1 Vật liệu – hóa chất 29

2 Các enzyme cắt giới hạn 29

3 Phương pháp tiến hành 30

Bài 7 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 31

1 Nguyên vật liệu 31

2 Tiến hành 31

Bài 8 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN BẰNG ĐO MẬT ĐỘ QUANG 33

1 Nguyên tắc 33

2 Nguyên vật liệu 33

3 Tiến hành 33

Bài 9 PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN - PCR 34

1 Nguyên tắc chung 34

2 Thực hành 34

PHA CHẾ MỘT SỐ HÓA CHẤT DÙNG TRONG THỰC HÀNH 36

PHẦN A SINH HỌC TẾ BÀO

Biên soạn: PGS.TS Trương Thị Đẹp

Bài 1

KÍNH HIỂN VI - QUAN SÁT TẾ BÀO NHÂN SƠ VÀ

TẾ BÀO NHÂN CHUẨN

MỤC TIÊU HỌC TẬP

1 Nêu được các thành phần cấu tạo của kính hiển vi quang học và sử dụng được kính hiển vi để quan sát tế bào

2 Thực hiện được các tiêu bản hiển vi để quan sát bằng kính hiển vi quang học

3 Quan sát và vẽ được hình dạng và cấu tạo của tế bào nhân sơ và nhân chuẩn

1 Kính hiển vi quang học

Hình 1 Kính hiển vi 2 thị kính hiệu OLYMPUS

Thân kính

Chân kính

1.1 Cấu tạo của kính hiển vi

Các bộ phận cơ bản của một kính hiển vi quang học (Hình 1) như sau:

a Chân kính: Để giữ thăng bằng cho kính, có các hình dạng khác nhau

b Thân kính: Từ dưới lên trên gồm các bộ phận sau:

- Bộ phận lấy ánh sáng: là đèn chiếu sáng hoặc gương phản chiếu được gắn

trên chân kính Gương phản chiếu có hình tròn, gồm một mặt phẳng và một mặt lõm, có thể xoay theo nhiều hướng khác nhau; trong thực hành tại Bộ môn, sinh viên chỉ sử dụng mặt lõm của gương để hội tụ ánh sáng từ nguồn sáng là đèn néon hay ánh sáng mặt trời

- Bàn kính (bàn mang lam kính): Để đặt tiêu bản, có hình tròn hay hình vuông, ở giữa có một lỗ thủng để cho ánh sáng đi từ dưới lên Trên bàn kính có kẹp dùng để cố định lam kính Lam kính có thể di chuyển theo chiều ngang và chiều dọc nhờ các ốc di chuyển gắn trên bàn kính Bàn kính có thể được cố định hay di chuyển

lên xuống bằng ốc sơ cấp

- Ốc di chuyển vật kính: gồm ốc điều chỉnh lớn (ốc sơ cấp) và ốc điều chỉnh

nhỏ (ốc vi cấp) Ốc sơ cấp giúp nâng lên hoặc hạ xuống bàn kính hoặc vật kính; khi điều chỉnh bằng ốc sơ cấp khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản quan sát thì thay đổi mắt thường có thể nhìn thấy được Ốc vi cấp dùng điều chỉnh hình ảnh rõ nét hơn

- Tụ quang: có hình trụ, nằm ngay bên dưới bàn kính; đây là một hệ thống

thấu kính dùng để hội tụ ánh sáng từ gương phản chiếu để tạo thành chùm tia sáng mạnh hơn, có thể di chuyển nhờ một ốc gắn trên thân kính Phía dưới hệ thống sáng

có một cần gạt để mở hay đóng cửa sổ chắn sáng giúp ta điều chỉnh nguồn ánh sáng vào nhiều hay ít

- Cần kính: là chỗ cầm kính hiển vi khi di chuyển kính, ở đầu mang thị kính,

ở giữa có gắn một bàn xoay trên đó có gắn các vật kính có độ phóng đại khác nhau

- Vật kính: là bộ phận quan trọng và phức tạp nhất của kính hiển vi, bên

ngoài vỏ có ghi: loại vật kính, độ phóng đại, độ mở,…

Ví dụ: Vật kính có ghi 40X/0.65 và 160/0.17 thì có nghĩa là: vật kính có độ phóng đại là 40 lần, độ mở của tụ quang là 0,65, chiều dài ống kính phù hợp là 160 mm, chiều dày của phiến kính trung bình là 0,17 mm ( 0,02 mm)

Các kính hiển vi sử dụng tại Bộ môn thường có 4 loại vật kính có độ phóng đại là 4, 10, 40 và 100 lần (4X, 10X, 40X, 100X) Các vật kính trên có thể:

+ Di chuyển xoay tròn nhờ một bàn xoay, trong bàn xoay có một cái khớp Khi muốn quan sát ở vật kính nào thì xoay vật kính đó vào đúng khớp

+ Di chuyển lên - xuống nhờ ốc sơ cấp

- Thị kính: gồm 2 thấu kính có mặt lõm hướng xuống phía dưới, trên mặt có

ghi những độ phóng đại khác nhau thường là 10 lần (10X) Kính hiển vi có loại có

1 thị kính, có loại có 2 thị kính

Các bộ phận: chân kính, bàn kính, kẹp, ốc di chuyển vật kính là phần cơ học của kính hiển vi Các bộ phận: tụ quang, vật kính, thị kính, đèn chiếu sáng, gương phản chiếu là phần quang học

1.2 Cách sử dụng kính hiển vi

Mỗi buổi thực hành, trước khi sử dụng kính hiển vi, sinh viên phải kiểm tra các

bộ phận của kính, nếu thấy thiếu bộ phận hay bộ phận nào đó bị thay đổi thì báo cáo ngay cho giáo viên hướng dẫn Trước khi cắm điện cần phải kiểm tra công tắc ở

vị trí 0 và nút chỉnh cường độ sáng ở vị trí nhỏ nhất

a Điều chỉnh ánh sáng cho quang trường

- Đối với kính hiển vi có 2 thị kính và có đèn gắn trên chân kính

Làm tuần tự các bước sau đây:

+ Cắm điện

+ Bật công tắc đèn từ vị trí 0 sang I

+ Vặn nút chỉnh cường độ sáng tăng dần

+ Mở cửa sổ chắn sáng tối đa

+ Nâng tụ quang lên cho đến khi mặt kính tròn trên đầu tụ quang cách bàn mang vật khoảng 5 mm

+ Xoay vật kính nhỏ (10X) vào vị trí quan sát (vào khớp)

- Đối với kính hiển vi có 1 thị kính và có gương phản chiếu

+ Xoay mặt lõm của gương phản chiếu vào nguồn sáng (có thể là ánh sáng mặt trời hay ánh sáng điện)

+ Mở cửa sổ chắn sáng tối đa

+ Nâng tụ quang lên cho đến khi mặt kính tròn trên đầu tụ quang cách bàn mang vật khoảng 5 mm

+ Xoay vật kính nhỏ (10X) vào vị trí quan sát (vào khớp)

+ Nhìn vào thị kính, tay điều chỉnh gương phản chiếu hướng về nguồn sáng cho đến khi quang trường sáng tối đa

- Nhìn vào thị kính, tay vặn ốc sơ cấp để hạ từ từ bàn kính xuống (hoặc nâng từ

từ vật kính lên) cho đến khi nhìn thấy mẫu vật cần quan sát trong quang trường

- Dùng ốc di chuyển tiêu bản để quan sát sơ bộ toàn bộ mẫu vật

- Khi muốn chuyển sang quan sát ở vật kính lớn: ta giữ nguyên trạng thái của kính hiển vi, dùng tay xoay nhẹ nhàng đĩa mang vật kính để đưa vật kính cần quan sát (ví dụ vật kính 40X) vào khớp, sau đó vặn ốc vi cấp để thấy rõ nét mẫu vật

1.3 Những điều chú ý khi sử dụng kính hiển vi

- Khi di chuyển kính phải dùng cả hai tay để cầm kính, một tay cầm trên cần kính,

một tay đỡ dưới chân kính và luôn luôn để kính đứng thẳng

- Trong khi sử dụng kính hiển vi:

+ Không để dung dịch quan sát dính vào đầu vật kính hay nhỏ xuống dưới tụ quang + Vặn các ốc nhẹ nhàng Đặc biệt đối với ốc vi cấp, khi vặn theo một chiều mà thấy cứng thì lập tức phải vặn ngược trở lại, không bao giờ cố vặn tới (sẽ gãy

ốc vi cấp)

+ Nếu ngưng quan sát một thời gian thì phải giảm nguồn sáng (không cần tắt đèn)

- Sau khi sử dụng kính hiển vi:

+ Giảm tối đa ánh sáng của đèn chiếu sáng

+ Tắt đèn

+ Lau cẩn thận phần cơ học bằng vải mềm khô và sạch

+ Lau cẩn thận phần quang học bằng giấy lau kính của Bộ môn Tuyệt đối không được dùng khăn lau hay sờ tay vào các phần quang học

- Cất kính hiển vi vào tủ:

+ Xoay vật kính nhỏ nhất vào khớp

+ Rút dây điện khỏi ổ cắm và quấn tròn quanh cần kính

+ Cất kính vào tủ theo đúng vị trí của kính

2 Phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi

2.1 Phương pháp thực hiện

Làm tuần tự các bước sau:

- Cho 1 giọt dung dịch quan sát (nước cất, glycerin, KI, Soudan III…) vào giữa phiến kính dày (phiến kính mang vật, lame)

- Đặt mẫu vật cần quan sát vào giữa giọt dung dịch

- Đậy nhẹ nhàng phiến kính mỏng (phiến kính đậy vật, lamelle) lên mẫu vật sao cho không có bọt khí trong dung dịch

Lưu ý:

- Nếu dung dịch cho vào không đủ (không bao phủ hết mẫu vật), khi đó phải cho thêm dung dịch vào bằng cách dùng ống nhỏ giọt cho từ từ dung dịch vào một cạnh của phiến kính mỏng, dung dịch sẽ tự lan vào giữa 2 phiến kính

- Nếu dung dịch cho vào quá dư, trào ra ngoài phiến kính mỏng thì phải dùng giấy thấm lau hết phần dung dịch thừa bên ngoài phiến kính mỏng

2.2 Cách thay dung dịch quan sát

Khi cần quan sát một mẫu vật ở nhiều dung dịch khác nhau, có thể thay dung dịch bằng cách: dùng giấy thấm đặt ở một cạnh của phiến kính mỏng để rút dung dịch đang sử dụng, nhỏ 1-2 giọt dung dịch cần thay vào cạnh đối diện của phiến kính mỏng

3 Thực hành: Quan sát tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn

- Vật liệu: Bèo hoa dâu - Vi khuẩn lam, tế bào biểu mô miệng, củ Hành tây

- Hóa chất, dụng cụ:

+ Dung dịch iod, nước cất

+ Dao lam, bông gòn y tế

3.1 Tế bào nhân sơ

Vi khuẩn lam có cấu tạo là tế bào nhân sơ, có khả năng tự dưỡng nhờ quang hợp, sống cộng sinh trong bèo hoa dâu

3.2 Tế bào nhân chuẩn

3.2.1 Tế bào biểu bì Hành tây

Các bước thực hiện:

- Dùng dao lam rạch mặt trong vảy Hành tây một hình vuông cạnh 2 mm Bóc lớp biểu bì (lớp ngoài cùng) của hình vuông vừa rạch Úp mặt vừa bóc lên phiến kính dày có sẵn 1 giọt dung dịch iod Đậy phiến kính mỏng lên mẫu vật

- Quan sát: Hình dạng và các thành phần của tế bào biểu bì trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X

3.2.2 Tế bào biểu mô miệng

Các bước thực hiện:

- Dùng bông vô trùng quệt vào vòm họng, sau đó phết lên phiến kính dày trong

1 giọt nước và đậy phiến kính mỏng lên mẫu vật

- Quan sát: Hình dạng tế bào và các thành phần của tế bào biểu mô miệng trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X

BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào vi khuẩn lam

2 Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào biểu bì vảy Hành tây

3 Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào biểu mô miệng

Vật liệu: Quả Ớt chín, lá Lẻ bạn, lá Rong đuôi chồn, tinh bột Khoai tây, củ Thược

dược, hạt Thầu dầu, cuống lá Trầu bà, thân Rau sam, phiến lá Đa búp đỏ

Hóa chất, dụng cụ:

- Dung dịch iod, nước cất, dung dịch Soudan III, ethanol 900, ether

- Dao lam, giấy thấm

- Dùng dao lam tách một mảnh biểu bì dưới (mặt có màu tím) của lá Lẻ bạn

Úp mặt biểu bì vừa bóc lên phiến kính dày trong 1 giọt nước, đậy phiến kính mỏng

- Quan sát: Hình dạng, màu sắc và vị trí của vô sắc lạp trong tế bào trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X

1.3 Lục lạp và sự chuyển động của tế bào chất ở lá Rong đuôi chồn

Tế bào sống thì chất tế bào luôn chuyển động tạo thành dòng nội chất Tuy nhiên, ta không thể quan sát trực tiếp sự chuyển động này vì chất tế bào trong suốt Chất tế bào di chuyển sẽ lôi kéo các hạt lục lạp di chuyển theo Nhờ đó chúng ta có thể quan sát gián tiếp sự chuyển động của chất tế bào nhờ vào sự

Chú ý: Tìm những tế bào ở vùng gần gân lá của lá rong sẽ dễ tìm thấy sự chuyển động của chất tế bào hơn

2 Chất dự trữ

2.1 Glucid

- Tinh bột: là loại chất dự trữ phổ biến nhất trong tế bào thực vật (trong củ, thân,

rễ, hạt…) Mỗi loại cây có dạng tinh bột riêng, đặc sắc cho loại cây đó

Các bước thực hiện:

+ Dùng đầu kim lấy một ít tinh bột Khoai tây đặt lên phiến kính dày trong một giọt nước, đậy phiến kính mỏng

+ Quan sát hạt tinh bột trong nước ở vật kính 10X, 40X

+ Thay nước thường bằng 1-2 giọt nước iod Ghi nhận màu sắc của hạt tinh bột

- Inulin: là một đồng phân của tinh bột, tan trong nước nhưng kết tinh trong cồn

cao độ thành những tinh thể hình cầu

Các bước thực hiện:

- Bóc vỏ hạt Thầu dầu, dùng dao lam cắt ngang phôi nhũ hạt thành lát mỏng, đặt lên phiến kính dày Cho vài giọt ether lên lát cắt, để khô, sau đó cho một giọt nước iod vào lát cắt, đậy phiến kính mỏng

3 Chất cặn bã

Các bước thực hiện:

- Cắt ngang các mẫu: Cuống lá Trầu bà, thân Rau sam, phiến lá Lẻ bạn, phiến lá

Đa búp đỏ thành lát mỏng, đặt lên phiến kính dày đã có 1 giọt nước, đậy phiến kính mỏng

- Quan sát các vi phẫu ở vật kính 10X, 40X

3.1 Tinh thể calci oxalat

- Hình kim (cuống lá Trầu bà): các tinh thể có thể nằm riêng lẻ hay xếp thành bó

- Hình cầu gai (thân Rau sam): các tinh thể có hình cầu gai

- Hình khối (phiến lá Lẻ bạn): tinh thể có hình khối lăng trụ rải rác trong tế bào

3.2 Tinh thể calci carbonat (bào thạch, nang thạch) trong phiến lá Đa búp đỏ

Tinh thể có dạng một khối xù xì như quả Mít, treo bởi một cuống bằng cellulose có tẩm silic vào vách tế bào hạ bì chứa nó (thạch bào)

BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Hình vẽ tế bào mô mềm của thịt quả Ớt chín có sắc lạp

2 Hình vẽ tế bào biểu bì lá Lẻ bạn có vô sắc lạp

3 Hình vẽ tế bào lá Rong đuôi chồn có lục lạp và đánh dấu dòng chuyển động của

tế bào chất

4 Hình vẽ tinh bột, tế bào có các dạng chất dự trữ và chất cặn bã Các hình vẽ đều

có chú thích đầy đủ

Bài 3

TÍNH THẤM QUA MÀNG TẾ BÀO – NGUYÊN PHÂN

MỤC TIÊU HỌC TẬP

1 Giải thích được các hiện tượng xảy ra khi để tế bào thực vật trong dung dịch

ưu trương hay nhược trương

2 Thực hiện được thí nghiệm chứng minh chức năng của màng sinh chất và giải thích được kết quả của thí nghiệm

3 Quan sát và vẽ đúng các kỳ của phân bào nguyên nhiễm

Vật liệu: Lá Lẻ bạn, củ Dền đỏ, rễ Hành tím

Hóa chất, dụng cụ:

- Dung dịch NaCl 3%, nước cất, nước 30oC, 50oC, 70oC, 80oC, 100oC và ethanol 300, phẩm nhuộm orcein, dung dịch HCl 1N

- Dao, dao lam, cốc nhỏ, becher 500 ml, kẹp gắp

1 Màng tế bào

1.1 Hiện tượng thẩm thấu

Đối với tế bào sống, màng tế bào sẽ kiểm soát sự di chuyển của nước và các chất tan Sự khuếch tán nước qua màng sinh chất của tế bào thực vật được gọi là sự thẩm thấu Trong dung dịch không cân bằng áp suất thẩm thấu, nước sẽ di chuyển qua màng sinh chất từ nơi có áp suất thẩm thấu thấp (môi trường nhược trương) đến nơi có áp suất thẩm thấu cao hơn (môi trường ưu trương) cho đến khi áp suất thẩm thấu cân bằng giữa bên trong và bên ngoài tế bào

Tế bào biểu bì lá Lẻ bạn có chứa anthocyan nên có màu tím Ở điều kiện sống bình thường, màng sinh chất áp sát vách tế bào nên màu tím nhuộm đầy tế bào

Các bước thực hiện:

- Bóc biểu bì dưới của lá Lẻ bạn (mặt có màu tím) Quan sát tế bào biểu bì trong một giọt nước ở vật kính 10X Thay nước bằng dung dịch NaCl 3% Quan sát dưới kính hiển vi hiện tượng gì sẽ xảy ra trên các tế bào biểu bì?

- Thay nước muối bằng nước thường, lặp lại 2 lần Quan sát dưới kính hiển vi hiện tượng gì sẽ xảy ra trên các tế bào biểu bì?

Chú ý: Không nên kéo dài thời gian quan sát trong dung dịch NaCl 3% quá 5 phút,

vì tế bào có thể bị chết, khi đó không thể thực hiện được giai đoạn tiếp

1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và dung môi hữu cơ lên tính thấm của màng sinh chất

Màng sinh chất là màng lipo-protein, các phức hợp này có thể bị tổn thương do nhiệt độ hay hóa chất, làm phá vỡ cấu trúc chuyên biệt và làm cho màng mất khả năng kiểm soát hoạt động sinh lý bình thường Khi màng sinh chất bị tổn thương,

nó không còn khả năng giữ các chất tan trong tế bào và do đó các chất này khuếch tán ra ngoài tế bào theo nguyên lý cân bằng áp suất thẩm thấu

Các bước thực hiện:

- Cắt củ Dền đỏ thành 6 miếng đều nhau, có kích thước 1 x 5 x 2 cm, rửa dưới dòng nước chảy cho đến khi nước rửa không còn màu tím Ngâm các miếng củ Dền trong nước sạch

- Cho 1 miếng Dền khác vào cốc đựng nước 50oC trong thời gian 2 phút Sau

đó, chuyển miếng Dền vào cốc số 2 và để yên trong 30 phút

- Tiếp tục thực hiện như trên đối với 3 miếng Dền khác ở các nhiệt độ xử lý là

70oC, 80oC và 100oC Sau 2 phút xử lý, chuyển các miếng Dền vào các cốc tương ứng là cốc 3, cốc 4, cốc 5 và để yên 30 phút

- Cho miếng Dền còn lại vào cốc đựng ethanol 30o trong thời gian 2 phút Sau

đó, chuyển miếng Dền vào cốc số 6 và để yên trong 30 phút

- Sau 30 phút, gắp các miếng Dền ra khỏi cốc, ghi nhận màu sắc của dung dịch trong 6 cốc

2 Nguyên phân

Các bước thực hiện:

- Trồng củ Hành ta trong dung dịch Knop ½ 24 giờ Khi rễ có chiều dài 0,5-1 cm thì cắt chóp rễ một đoạn dài khoảng 2 mm, nhuộm với 0,5 ml orcein và 1 giọt dung dịch HCl 1N trong 2 giờ Vớt chóp rễ đặt trên phiến kính dày trong một giọt glycerin, đậy phiến kính mỏng rồi đè bẹp mẫu vật bằng đầu que diêm

- Quan sát ở vật kính 10X và 40X các tế bào mô phân sinh rễ Hành ta ở các giai đoạn: Gian kỳ (interphase), kỳ đầu (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ sau (anaphase) và kỳ cuối (telophase)

BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Hình vẽ hiện tượng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh

2 Đánh giá kết quả của thí nghiệm trên các miếng Dền đỏ bằng các dấu + để chỉ mức độ màu của dung dịch Giải thích kết quả

3 Hình vẽ các kỳ của phân bào nguyên nhiễm và gian kỳ ở tế bào mô phân sinh rễ Hành ta Các hình vẽ phải có chú thích đầy đủ

PHẦN B SINH HỌC PHÂN TỬ

Biên soạn: TS Lê Nguyễn Uyên Chi

kèm theo tip tương ứng: 0,1→ 10 µl (trắng), 10→ 200 µl (vàng), 100→ 1000 µl

(xanh) Khi sử dụng chọn cỡ pipet và tip phù hợp với thể tích cần lấy để tránh sai số Cấu tạo micropipet thay đổi tùy theo kiểu thiết kế nhưng nhìn từ bên ngoài đều

gồm; cần bơm, bộ phận điều chỉnh thể tích, số chỉ thể tích được chọn, bộ phận đẩy

tip (có thể tháo rời), đầu hút (nơi gắn tip)

Sử dụng: cầm chắc pipet trong lòng bàn tay sao cho ngàm tựa tì lên đốt đầu tiên

của ngón trỏ, dùng ngón cái để bấm cần bơm

và núm đẩy tip Có 2 cách sử dụng cụ thể:

Hút một lần: điều chỉnh thể tích cần lấy,

lấy tip, bấm cần bơm (một nấc) rồi giữ luôn,

nhúng đầu tip vào dung dịch cần lấy, thả cần

bơm từ từ để lấy thể tích, đặt đầu tip vào nơi

cần cho vào, bấm cần bơm để đẩy thể tích cần

lấy ra Nếu cần thiết thì bấm tiếp nấc thứ hai để

tống hết phần chất lỏng còn dính ở đầu tip

Hút nhiều lần cùng một thể tích: điều

chỉnh thể tích cần lấy, lấy tip, bấm cần bơm 2

nấc rồi giữ luôn, nhúng đầu tip vào dung dịch

cần lấy, thả cần bơm từ từ cả 2 nấc để lấy thể

tích, đặt đầu tip vào nơi cần cho vào, bấm cần

bơm 1 nấc để đẩy thể tích cần lấy ra rồi giữ

luôn (khi đó trong đầu tip vẫn còn một thể tích

thừa), nhúng đầu tip vào dung dịch cần lấy, thả

cần bơm từ từ 1 nấc để lấy thể tích,

Lưu ý: Không dùng đầu hút để hút mà phải dùng đầu tip, tip phải được gắn chặt vào

đầu hút nếu không sẽ mắc sai số

Hình 2 Cấu tạo micropipet

Núm chỉnh thể tích Ngàm tựa Cần bơm Núm chỉnh thể tích Núm đẩy tip

Số chỉ

Ống (cần) đẩy tip Đầu hút Tip

Máy cấu tạo cơ bản gồm 1 rotor có tâm sai với bán kính tâm sai nhỏ, được

sử dụng để lắc trộn các dung dịch hay để phân tán các cắn trong tube

Máy thường có 2 chế độ vận hành:

- Liên tục: rotor quay liên tục

- Kích hoạt: khi ta đặt tube vào rotor rồi nhấn xuống

rotor mới quay

Khi sử dụng các tube phải được đậy nắp kỹ để tránh

dung dịch bắn ra ngoài và điều chỉnh tốc độ để có

lực rung phù hợp với yêu cầu

1.4 Máy ly tâm nhỏ (Microcentrifuge)

Dùng để lắng các cặn lơ lửng như tế bào hay tủa Các rotor của máy thuộc loại rotor góc và có thể thay đổi tùy theo kích thước ống sử dụng Máy ly tâm có 2 chế độ sử dụng:

- Pulse (spin): Nhấn và giữ luôn nút pulse, khi muốn dừng lại thả tay ra,

áp dụng để dồn các thành phần đang dính trên thành ống xuống

- Ly tâm: để lắng cặn Chọn tốc độ và thời gian thích hợp rồi nhấn nút

ly tâm Lưu ý: một số tube, eppendorf có thành mỏng (tube PCR) không chịu được tốc độ ly tâm cao nên có thể bị thủng Sau khi ly tâm tủa sẽ lắng ở đáy ống phía đối diện với trục, do đó nên đặt ống vào rotor sao cho quai nắp hướng ra ngoài (xem hình minh họa), khi đó ta có thể dễ dàng hút phần dịch nổi mà không ảnh hưởng đến cặn

Lực ly tâm của máy tỷ lệ với tốc độ và độ dài của bán kính rotor

Hình 4 Máy vortex

Hình 5 Máy ly tâm

1.5 Máy luân nhiệt

Máy tạo ra các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

theo chương trình định trước, dùng để thực hiện

phản ứng PCR hay các phản ứng có nhiệt độ thay đổi

theo chu kỳ

1.6 Máy điện di

Là thiết bị dùng để tách và phân tích các hỗn hợp

chất có điện tích bằng dòng điện

2 Cách cân pha hóa chất cần thiết

Các hóa chất sử dụng thường được pha thành dung dịch mẹ và tồn trữ, khi dùng mới pha loãng thành nồng độ mong muốn

2.1 Công thức cân - pha

- Cân chính xác khoảng:

Thể tích dung môi cần lấy (ml) =

Hay Thể tích dung môi cần lấy (ml) =

- Cân chính xác và pha trong thể tích cố định: Lượng cần cân (mg) = thể tích dung môi (ml) x nồng độ muốn pha (mg/ml) - Cân và pha theo nồng độ mol: Cần phân biệt mol là đơn vị chỉ hàm lượng: cho biết số phân tử gam (MW) chất cần có; và M là nồng độ phân tử gam: cho biết có bao nhiêu mol chất trong 1 lít dung dịch Khi cân pha các chất theo nồng độ mol, ta có thể tham khảo giá trị

phân tử gam được ghi trên nhãn của hóa chất tinh khiết Ví dụ: dung dịch KCl 5 M nghĩa là trong 1 lít dung dịch có 5 mol KCl, và trong 100 ml dung dịch trên thì hàm lượng KCl là 0,5 mol

Hình 6 Máy luân nhiệt

Lƣợng cần cân (g) = thể tích dung dịch (l) x nồng độ muốn pha (M) x MW (g) Hay:

Lƣợng cần cân (mg) = thể tích dung dịch (l) x nồng độ muốn pha (mM) x MW (g)

Ví dụ: pha 200 ml dung dịch NaOH 1,5 M:

Số gam NaOH nguyên chất cần cân = 0,2 x 1,5 x 40 = 12 g

Ví dụ: pha 250 ml dung dịch NaOH 150 mM:

Số gam NaOH nguyên chất cần cân = 0,2 x 150 x 40 = 1500 mg = 1,5 g

2.2 Công thức điều chỉnh nồng độ pha loãng

Sau đó thêm dung môi vừa đủ thể tích cần pha

Ví dụ: pha 100 ml TAE 0,5x từ TAE 10X

Bài 2

AN TOÀN THÍ NGHIỆM – CÁC PHƯƠNG PHÁP

THANH TRÙNG

MỤC TIÊU HỌC TẬP

1 Hiểu biết về các quy tắc đảm bảo an toàn trong phòng thí nghiệm và khi làm việc

2 Nắm vững và vận dụng các phương pháp khử trùng khi làm thí nghiệm sinh học

1 An toàn phòng thí nghiệm cơ bản

sử dụng, tháo bỏ găng tay đúng cách và phải rửa tay

- Người làm việc trong PTN phải rửa tay sau khi thao tác với các vật liệu có khả năng gây nhiễm trùng, gây bệnh, các hóa chất độc hại và trước khi ra khỏi khu vực làm việc của PTN

- Luôn đeo kính bảo hộ, mặt nạ hoặc các thiết bị bảo hộ khác để không bị các dung dịch nhiễm trùng bắn vào mắt và mặt cũng như tránh được các vật có sức ép lớn và tia cực tím nhân tạo

- Cấm ăn uống, hút thuốc trong khu vực làm việc của PTN

1.2 Khu vực làm việc

- PTN phải ngăn nắp, sạch sẽ và chỉ để những gì cần thiết cho công việc

- Vào cuối buổi thực hành, mặt bàn ghế phải được làm sạch và khử nhiễm sau khi làm đổ các vật liệu nguy hiểm

- Tất cả các vật liệu, vật phẩm và môi trường nuôi cấy vi sinh vật phải được khử trùng trước khi thải bỏ

- Nghiêm túc và cẩn thận khi làm thí nghiệm

- Trật tự trong PTN: tuân thủ các quy định làm việc, quy định về an toàn tại PTN Giữ vệ sinh PTN

- Bảo quản các dụng cụ, thiết bị của phòng: sinh viên cần giữ gìn các dụng cụ được nhận và sử dụng cẩn thận các thiết bị của phòng Những hư hỏng mất mát phải chịu bồi thường tương xứng

- Khi ra về: phải kiểm tra tắt điện, nước, máy móc không sử dụng

2 Xử lý chất thải

2.1 Chất thải là tất cả các vật liệu cần thải bỏ

Trong PTN, việc khử trùng chất thải và thải bỏ chúng sau này có liên quan chặt chẽ với nhau Trong khi sử dụng hằng ngày, chỉ một số ít vật liệu nhiễm trùng thật sự cần thải bỏ hoặc tiêu hủy Hầu hết các vật liệu thủy tinh, dụng cụ và áo quần bảo hộ sẽ được sử dụng lại hoặc tái sinh Nguyên tắc hàng đầu là tất cả các vật liệu nhiễm trùng phải được khử trùng, thanh trùng hoặc thiêu hủy trong PTN

2.2 Khử nhiễm

Hấp tiệt trùng là phương pháp được ưu tiên cho tất cả các quá trình khử nhiễm Các vật liệu để khử nhiễm hoặc thải bỏ cần được đặt trong hộp như túi nhựa tổng hợp được mã hóa màu theo nội dung công việc là thanh trùng hay thiêu hủy

Đối với tác nhân nhiệt, các tế bào dinh dưỡng của vi sinh vật có thể bị giết dễ dàng

1) Nhiệt khô (lò Pasteur hay tủ sấy)

Khử trùng bằng nhiệt khô là do sự làm khô vi trùng và oxy hóa các cấu tử của chúng Nhiệt khô dùng để khử trùng các dụng cụ bằng kim loại hay thủy tinh: ống nghiệm, hộp lồng, ống hút, các bột khô

Sự diệt trùng bằng nhiệt khô được thực hiện trong tủ sấy, đó là một phòng kín bằng kim loại, được đốt nóng bằng chất khí hay điện trở Nhiệt độ trong lò có thể lên đến

180oC và khí nóng phải được quạt đều trong lò để tránh sự sai biệt về nhiệt độ

a) Khi dùng tủ sấy:

- Các dụng cụ phải được làm khô và gói giấy để đảm bảo tính vô trùng sau khi sấy

- Khi cho dụng cụ vào lò sấy xong, đậy nắp lại

- Điều chỉnh nhiệt độ lên từ từ 175-180oC trong 30 phút (hoặc 160oC trong