Molecular characterization and developmental analysis of the TGF beta 3 gene in zebrafish

Our study has clearly demonstrated that zebrafish can be a suitable vertebrate model for studying human craniofacial development and disease, and the finding of an important role of tgf

GENE IN ZEBRAFISH 

CHEAH SIEW HONG FELICIA  (BSc Biochemistry/Microbiology (Hons.), University of 

Acknowledgements ……… ……. iii 

List of Figures ………  iv 

List of Tables …….………  vi 

List of Abbreviations ………  vii 

List of Publications ……….…… x 

Chapter 1  Introduction   1 

1.1 Background/Significance ……… ………   1 

1.2 Literature Reviews ……… ………  3 

1.2.1  Transforming Growth Factor b3 ……… …  3 

Overview of transforming growth factor b family ………  3 

TGF b  ligands ………  3 

TGF b  receptors ……… ………  5 

Smad proteins ……… ……. 7 

Recognition of Smad by the activated receptor complex ……… …  9 

Mechanism of Smad phosphorylation and activation ……… 10 

Mechanisms of TGF b  signalling from cell membrane to the nucleus ………  10 

TGF b  Subfamily and its isoforms ………  11 

Latent TGF b , latent TGF b  binding protein, and bone …  11 

Perturbation of TGF b  signalling in human diseases ………. 13 

TGF b 3, and expression patterns during early embryogenesis and in adult tissues   13 

TGF b 3 knockout mice studies ……… 17 

TGF b 3 mutations and diseases ………  19 

1.2.2  Zebrafish: An Animal Model for Craniofacial Development and Disease   21 

Overview of the zebrafish system ………  21 

Advantages and disadvantages of zebrafish ………  21 

Disease modelling in zebrafish ………  22 

Zebrafish as the animal model for craniofacial development and disease ………… 25 

1.2.3  Development of Pharyngeal Arches ………  27 

Overview of pharyngeal arches ………. 27 

Patterning the pharyngeal arches ………  27

Functions of the notochord in vertebrate development ……….………  37 

Relationship between notochord and cartilage ……….………. 39 

1.2.5  Cardiac Development in Zebrafish ……… 41 

Overview of zebrafish heart ………  41 

Formation of the heart ……… … 41 

1.2.6  Specific Aims ……… 47 

Chapter 2  Materials and Methods ……… 48 

2.1  Zebrafish maintenance ……… 48 

2.2  Verification of RZPD clone ………. 48 

2.3  DNA sequencing and cDNA analysis ………  49 

2.4  Genomic characterization ……….………  49 

2.5  Promoter analysis ……….… 50 

2.6  Embryonic expression pattern by RT­PCR analysis ………… ………. 53 

2.7  Embryonic expression pattern by in situ RNA hybridization analysis …… … 53 

2.8  Cryosection analysis ……….… 55 

2.9  Microinjection ……… ……… ……….………  56 

2.10  Knockdown studies using morpholino antisense oligonucleotides …… ………. 56 

2.11  RT­PCR analysis for detection of morphant transcripts ……… ……….… …. 57 

2.12  Real­time PCR analysis for efficacy of i1e2 splice modifying MO ……… 57 

2.13  Overexpression analysis ……….…………  58 

2.14  Alcian blue cartilage staining ……….……….………. 60 

2.15  Alizarin red bone staining ……… ….…… 61

2.17  Imaging and processing ………  62 

Chapter 3  Results ………  63 

3.1  Identification of Zebrafish tgf b3 cDNA ………. 63 

3.2  Genomic Organization of Zebrafish tgf b3 Gene ……….…  69 

3.3  Tgfb3 Promoter Analysis ………. 71 

3.4  Genetic Mapping of Zebrafish tgf b3 ………  75 

3.5  Embryonic Developmental Expression Pattern ……….…… 77 

3.6  Inhibition of Zebrafish tgf b3 with Splice Modifying Morpholino Ô ……… ……84 

3.7  Efficacy Assessment of Knockdown Morphant Phenotypes ……… 89 

3.8  Craniofacial Cartilage Phenotypes in tgf b3 Knockdown Morphant Embryos …92  3.9  Knockdown of tgf b3 Gene and Bone Development ……… 97 

3.10  Knockdown of tgf b3 Gene and Notochord Development ……….……  99 

3.11  Undulating Notochord and Heart Field Domain in tgf b3 Morphants …… … 102 

3.12  Knockdown of tgf b3 Gene and Heart Development ……….…….…  104 

3.13  Overexpression of tgf b3 in Zebrafish ……….…  110 

Capped sense mRNA synthesis and validation of mRNA integrity ………  110 

Overexpression of tgf b 3 and cartilage development ………  112 

Overexpression of tgf b 3 and notochord development ………. 112 

Overexpression of tgf b 3 and cardiac development ………. 112 

Chapter 4  Discussion ……….…. 118 

4.1  Genomic Analyses of tgf b3 ……… ………. 118 

4.2  Functional Analyses of tgf b3 ………. 119 

Embryonic expression of tgf b 3 ……… 119

Relationship between tgf b 3 and cardiac development ………… ………. 128 

Dosage sensitive and tissue specific effects of tgf b 3 ………  132 

Chapter 5  Conclusions   133 

Chapter 6  References ……… …  135 

Appendix ………. 148 

(A) Medium Preparation 

(B) Published articles

biological  processes  and  is  involved  in  mammalian  pulmonary  and  craniofacial 

development.    Homologs  of  human  TGF b 3  have  been  identified  in  several  vertebrate 

species.  A cDNA clone of zebrafish tgf b 3, consisting of a 271 bp 5’ untranslated region, 

a 1233 bp open reading frame that encodes a predicted 410 amino acid peptide, and a 527 

bp  3’  untranslated  region  was  sequenced.    Using  5’  rapid  amplification  of  cDNA  ends,  the transcription start site of this gene was determined to lie an additional 29 nucleotides  upstream.  This gene is composed of seven exons and maps to a segment of linkage group 

protein  (Sp1)  and  two  TATA  binding  protein  (TBP)  transcription  factor  binding  sites  were identified in the putative promoter segment upstream of the transcription start site. 

Comparative  alignment  analysis  revealed  a  high  degree  of  tgf b 3  nucleotide  and  amino 

acid  identity  between zebrafish and other  species,  including a complete conservation of  the  cysteine  knot  structure that  facilitates  protein­protein  interaction.    Also,  9 out  of  10  amino acid residues critical for ligand/receptor binding in human TGFb3 are conserved in  zebrafish, suggesting a high degree of functional conservation even in lower vertebrates. 

Zebrafish  tgf b 3  expression  was  first  detected  in  the  notochord  (10  somite  to  high­pec 

stage),  subsequently  in  the  developing  pharyngeal  arch  and  neurocranial  cartilage  (18  somite to protruding mouth stage), lens and heart (21 somite to protruding mouth stage),  and pectoral fins (prim­25).

Both  cartilage  staining  and  molecular  marker  analysis  results  showed  that  morphant  larvae  had reduced pharyngeal  arches,  neurocranial cartilage and pectoral  fin, 

confirming that tgf b 3 is involved in the formation of cartilages of the pharyngeal arches, 

neurocranium, and pectoral fin appendages.  The quadrate bone that forms the main part 

of  the  upper  jaw  skeleton  and  lateral  part  of  the  larval  palate  was  also  absent  in  the 

morphants.  This observation is reminiscent of the cleft palate phenotype reported in the 

Tgf b 3­/­  null  mice,  suggesting  that  the  role  of  TGF b 3  in  palatogenesis  has  been 

conserved  throughout  vertebrate  evolution.    The  opercle  and  the  branchiostegal  rays  which  form  the  key  supportive  components  of  the  gill  chamber  of  zebrafish  were  also 

reduced in the morphants, suggesting that tgf b 3 is required for the proper assembly of the 

gill  chamber.  Tgf b 3  also  appears  to  be  essential  for  the  proper  formation  of  the  heart. 

Our studies have revealed that loss of tgf b 3 expression affects the heart field formation, 

cardiac  cone  formation,  heart  tube  elongation,  and  heart  tube  looping  in  cardiac 

morphogenesis.  Tgf b 3  may  regulate  the  cardiomyocytes  population  by  limiting  the 

expansion  of  heart  field  domain  in  the  midline  via  its  effect  on  the  notochord,  and  regulating the population of neural crest that would differentiate into cardiomyocytes. 

Our  study  has  clearly  demonstrated  that  zebrafish  can  be  a  suitable  vertebrate  model  for  studying  human  craniofacial  development  and  disease,  and  the  finding  of  an 

important role of tgf b 3 in cardiac development is novel and has not been reported in other 

model organisms.

I thank  my  supervisor, A/P  Samuel Chong  for his  invaluable guidance and patience, Yi  Zhou  (The  Children’s  Hospital  Zebrafish  Genome  Project  Initiative,  Boston,  MA)  for  performing  the  RH  mapping,  Vladimir  Korzh  (Institute of  Molecular  and  Cell  Biology,  Singapore)  for  invaluable  advice  and  technical  support,  Bill  Trevarrow  (University  of  Oregon  Zebrafish  Facility,  Eugene,  OR)  for  providing  breeding  stocks  of  the  AB  line, 

Karuna  Sampath  (Temasek  Life  Science  Laboratories,  Singapore)  for  nkx2.5  and  ntl  molecular markers, Yi­Lin Yan (University of Oregon, Eugene, OR) for sox9a molecular  marker,  Monte  Westerfield  (University  of  Oregon,  Eugene,  OR)  for  dlx2  molecular 

marker,  Bonnie  Ullmann  (University  of  Oregon,  Eugene,  OR)  for  alizarin  red  staining  protocol,  Jin  Ben  and  Gare  Hoon  Yeo  for  technical  assistance  and  motivation,  and  lab  members of A/P Chong’s lab for their constant encouragement and motivation.  Last but  not least, my beloved husband, Dennis Goh for his constant support, encouragement and 

love during the arduous six years of my part­time graduate studies. 

“The Sovereign LORD is my strength; he makes my feet like the feet of a deer, he enables 

me to go on the heights.”  Habakkuk 3:19

List of Figures  Fig. 1  The  relationship  between  hindbrain,  neural  crest  migration,  and 

Fig. 11  Zebrafish tgf b 3 expression in the notochord (A­D) and lens (E­H) 

Fig. 12  Zebrafish tgf b 3 expression in the presumptive pharyngeal arch primordia, 

pharyngeal arches, and neurocranial cartilage 

Fig. 13  Zebrafish tgf b 3 expression in the pectoral fins (A­C, F) and heart (D­H) 

Fig. 14  Inhibition of zebrafish tgf b 3 with splice modifying Morpholino Ô 

Fig. 15  Relative  quantitation  of  morphant  transcripts  in  uninjected  control  and 

Fig. 21  Expression  of  cartilage  marker  sox9a  in  the  pharyngeal  arches, 

neurocranial  cartilage,  and  pectoral  fins  of  48hpf  wild­type  (WT)  and 

tgfβ3 morphant (tgfβ3 MO ) larvae 

Fig. 22  Expression of neural crest marker dlx2 in 14­somite stage wild­type (WT) 

and tgfβ3 morphant (tgfβ3 MO ) embryos 

Fig. 23  Pharyngeal bones development in knockdown tgfβ3 morphant larva 

Fig. 24  Notochord phenotype in knockdown tgfβ3 morphant embryos 

Fig. 25  Notochord cross­sectional area in morphant embryos 

Fig. 26  Loss of tgf b 3 affects the organization and posterior extension of the heart 

field domain 

Fig. 27  Cardiac cones formation in tgfb3 MO embryos 

Fig. 28  Heart tubes elongation and looping in tgfb3 MO embryos 

Fig. 29  Morphogenesis of Kupffer’s vesicle (KV) is affected in tgfb3 MO embryos 

Fig. 30  Synthesis  and validation of tgf b 3 capped mRNA  used  for overexpression 

studies 

Fig. 31  Cartilaginous  head  skeleton  of  a  four­day  old  wild­type  zebrafish  larva 

(WT) and a four­day old overexpressed larva (tgfβ3 OE ) 

Fig. 32  Notochord phenotype in overexpressed tgfβ3 (tgfβ3 OE ) embryos 

Fig. 33  Cardiac cones formation in tgfb3 OE embryos 

Fig. 34  Heart tubes elongation in tgfb3 OE embryos

1.  Chong, S. S., Cheah,  F. S. H., and  Jabs, E.  W. (2002)  “Genes  implicated  in  lip and 

palate  development”  Chapter  3  of  Cleft  Lip  and  Palate:  From  Origin  to  Treatment 

(Wyszynski, D.F.) Oxford University Press, USA. 

2.  Cheah,  F.  S.  H.,  Jabs,  E.  W.,  and  Chong,  S.  S.  (2002).  Expression  and  functional 

315 (838). 

3.    Cheah,  F.  S.  H.,  Jabs,  E.  W.,  and  Chong,  S.  S.  (2005).  Genomic,  cDNA,  and 

embryonic  expression  analysis  of  zebrafish  transforming  growth  factor  beta  3  (tgfb3). 

Developmental Dynamics 232: 1021­1030. 

4.    Cheah,  F.  S.  H.,  Jabs,  E.  W.,  and  Chong,  S.  S.  An  essential  role  of tgf b 3  in 

zebrafish pharyngeal arch and heart development (manuscript in preparation).

Chapter 1  Introduction 

1.1 Background/Significance 

The  anatomy  of  the  head  forms  the  most  sophisticated  part  of  the  vertebrate  body.    Generally,  the  skull  consists  of  two  major  entities,  the  neurocranium  and  the  viscerocranium  (Wilkie  and  Morriss­Kay,  2001).    The  neurocranium  surrounds  and  protects  the  brain  and  sensory  organs,  whereas  the  viscerocranium  forms  the  key  skeleton  of  the  face.    Craniofacial  malformation  occurs  when  there  is  an  abnormal  regulation  of  normally  coordinated  tissue  patterning,  cell  fate  determination,  and  differentiation of  specific cell types during early  embryogenesis (Nuckolls et al., 1999).  Craniofacial  anomalies  account  for  approximately  a  third  of  all  congenital  defects  (Waheed, RM, 1998).  These anomalies  include  disorders of the skull  vault, oral clefts,  and  abnormalities  associated  with  pharyngeal  apparatus  derivatives.    The  mechanisms  that control the epithelial­mesenchymal interactions which mediate facial outgrowth and  morphogenesis  are  unclear.    An  understanding  of  the  regulatory  mechanisms  involved  will  provide  us  with  the  fundamental  knowledge  about  the  genetic  control  of  normal  human  craniofacial  development,  and  more  importantly  it  may  aid  us  in  the  understanding on how a genetic mutation during embryogenesis can produce a particular 

counseling and risk assessment, and is the necessary initial step for translational research  towards improving patient management, and developing treatment. 

As we know, craniofacial development is a highly controlled and complex process  which  begins  with  the  formation  of  neural  crest  cells  in  the  brain  and  their  subsequent

et  al.,  1998).    The  outgrowth  of  these  facial  primordia  from  buds  of  undifferentiated  mesenchyme  into  intricate  series  of  bones  and  cartilage  structures,  muscles  and  other  tissues  that  form  the  face,  involves  a  hierarchy  of  growth  factors  and  their  downstream  transcription factors that regulate the expression of genes responsible for determining cell  phenotypes  during  embryogenesis.  In  recent  years,  key  important  components  of  this  hierarchy  that  regulate  craniofacial  morphogenesis  have  been  identified.    This  includes 

in  most of  the  human  gastrointestinal  cancers  with  microsatellites  instability,  the  TGFb  type  II  receptor  is  inactivated  by  mutation,  and  in  nearly  half  of  the  pancreatic 

interactions  between  the  monomers.    In  most  cases,  this  dimer  structure  is  further  strengthened by the presence of an intersubunit disulfide bond.  This ligand dimer forms 

a  complex  with  two  type  I  and  two  type  II  receptors.    A  family  of  proteins  known  as  ligand traps has been shown to modulate the accessibility of the ligands to the receptors 

by  blocking  the  ligand  surfaces  that  are  required  to  interact  with  type  I  and  type  II  receptors (Groppe et al., 2002). 

Generally,  there  are  two  distinct  modes  of  ligand­receptor  interaction  (Shi  and  Massague, 2003).  One of the modes is exemplified by  members of the BMP  subfamily  while  the  other  is  represented  by  TGFβs  and  Activins  subfamily.    In  the  former  mode,  BMP ligands like BMP2 and BMP4 display a high affinity for the extracellular domains 

on the BMPR­I (type I BMP receptors) and a low affinity for the BMPR­II (type II BMP  receptors).  These  ligands  bind  directly  to  the  ectodomain  of  the  type  I  receptor  first.  This binding leads to subsequent interaction of ligand­type I receptor complex with type 

II receptor.  Crystal structure of BMP2 ­ BMPR­IA ectodomain complex shows that the  receptor makes extensive contacts to BMP2 dimers by binding to the “wrist” epitope of  the dimers (Kirsch et al., 2000).  Most of the interactions are hydrophobic.  The aromatic  side  chain  of  Phe85  of  BMPR­IA  interacts  with  the  hydrophobic  pocket  formed  at  the  interface  of  the  two  BMP2  monomers.    This  type  of  hydrophobic  knob­  and­  pocket  binding  seems  to  be  essential  for  the  interactions  between  BMP  ligands  and  the  type  I  receptors.

The  latter  mode  of  ligand­receptor  interaction  is  characteristic  for  TGFβ  and  Activin.  Both TGFβ and Activin exhibit a high affinity for type II receptors and they do  not interact with the  isolated type I receptors (Shi and Massague, 2003).  These  ligands

bind  directly  to  the  ectodomain  of  the  type  II  receptor  first.    This  binding  leads  to  subsequent  interaction  of  ligand­type  II  receptor  complex  with  type  I  receptor.    This  results in the formation of a huge ligand­receptor complex comprising a ligand dimer and  four  receptor  molecules.    Recent  crystal  structure  of  the  human  TGFβ  type  II  receptor  ectodomain and TGFβ3 complex shows that interaction occurs at the “fingertips” of the  ligand dimer (Hart et al., 2002).  Each monomer of the dimeric TGFβ3 interacts with one  receptor.    Two  symmetrically  positioned  concave  surface  areas  are  created  by  this  interaction,  and  these  surface  areas  have  been  postulated  to  be  the  binding  site  for  the  ectodomain of the type I receptor. 

1.2.1.3 TGF b  receptors 

Members  of  TGFβ  family  signal  through  a  family  of  transmembrane  protein  serine/threonine kinases called the TGFβ receptor family (Shi and Massague, 2003).  The  TGFβ  receptor  family  is  classified  into  two  subfamilies,  namely  the  TβR­I  (type  I  receptors) and the TβR­II (type II receptors) (Massague, 1998; Shi and Massague, 2003).  There  are  12  members  found  in  the  human  TGFβ  receptor  family,  of  which  seven  are 

glycoproteins  of  approximately  55  kDa  and  70  kDa,  respectively  (Massague,  1998).  Both  types  of  receptors  consist  of  about  500  to  570  amino  acids  including  the  signal  sequence  (Massague,  1998).    They  are  organized  sequentially  into  (a)  the  extracellular  domain, (b) the GS domain, and (c) the kinase domain. 

Generally, the extracellular domain resembles the so­called three­finger toxin fold  structure  (Greenwald  et  al.,  1999).  Each  finger  is  formed  by  a  pair  of  anti­parallel  β

strands.    The  extracellular  domain  consists  of  a  relatively  short  extracellular  region,  a  transmembrane region and a cytoplasmic juxtamembrane region (Massague, 1998).    The  extracellular  region  comprises  of  150  amino  acids  and  is  N­glycosylated.    The  general  fold of the extracellular region is determined by the presence of 10 or more cysteines in  this  region.    On  the  other  hand,  the  transmembrane  region  and  the  cytoplasmic  juxtamembrane region display no singular structural features except for (a) the Ser213 of  TβR­II is phosphorylated by the receptor kinase in a ligand­independent manner and this  phosphorylation  is  required  for  its  signalling  activity,  and  (b)  the  Ser165  in  the  juxtamembrane  region  of  TβR­I  is  phosphorylated  by  TβR­II  in  a  ligand­dependent  manner.    The  phosphorylation  state  of  Ser165  appears  to  selectively  modulate  the  intensity of different TGFβ responses. 

The  GS  domain  is  an  unique  feature  of  the  TβR­I,  but  not  TβR­II  (Massague,  1998).  This domain is a highly conserved region consists of 30 amino acids and is found 

The kinase domain  found  in  both TβR­I and TβR­II is a typical serine/threonine  protein  kinase  (Massague,  1998).    The  TβR­II  kinase  domain  is  capable  of

phosphorylating  TβR­I  on  the  serine  and  threonine  residues  and  thus  results  in  the  activation of TβR­I.  In addition, the TβR­II kinase domain can also phosphorylate itself.  The kinase domain of TβR­I phosphorylates its substrates on the serine residues only and  this domain also contains a region known as L45 loop which has been known to interact  with  the  L3  loop  of  receptor­regulated  Smad  during  signal  transduction  (Shi  and  Massague, 2003). 

1.2.1.4 Smad proteins 

The  Drosophila  gene  product  Mad  (mothers  against  decapentaplegic)  was 

identified  as  the  first  intracellular  mediator  of  TGFβ  signalling  (Sekelsky  et  al.,  1995). 

Subsequently, many orthologues in C.elegans and vertebrates were identified and named 

as SMADs (unification of “SMA” in C. elegans and “MAD” in Drosophila) (Derynck et 

al.,  1996;  Sekelsky  et  al.,  1995).    There  are  eight  distinct  Smad  proteins  identified  in  human,  mouse,  and  frog  (Massague,  1998;  Shi  and  Massague,  2003).    Based  on  their  structural and functional features, SMADs are generally classified into three classes, (a)  R­Smads  (receptor­regulated  Smads),  (b)  Co­Smads  (co­mediator  Smads),  and  (c)  I­  Smads (inhibitory Smads). 

Among  these  three  classes,  the  R­Smads  are  the  ones  that  are  directly  phosphorylated  and  activated  by  TβR­I  kinase  (Massague,  1998;  Shi  and  Massague,  2003).  Smad 1, 2, 3, 5 and 8  form the R­Smads class.  Smad 1, 5 and 8 are known to  respond to signalling by the BMP subfamily, and Smad 2 and 3 are the mediators of the  TGFb/Activin  subfamily.    To  date,  the  only  known  member  of  the  Co­Smads  class  is  Smad  4  (Massague,  1998).    Smad  4  associates  with  phosphorylated  R­Smads  to  form

active  Smad  complexes.    These  active  complexes,  together  with  bound  transporter  (importin b),  translocate  into  the  nucleus  to  activate  specific  target  genes  transcription. 

On  contrary,  the  I­Smads  are  a  structurally  divergent  class  of  Smads  (Massague,  1998;  Shi  and  Massague,  2003)  They  are  known  to  inhibit  the  TGFb  signal  transduction  by  competing with R­Smads in binding to the phosphorylated TGFb receptors.  The I­Smads  interaction  and  subsequent  binding  of  both  E3  ubiquitin  ligases  and  the  Smurfs  (Smad  ubiquitination  regulatory  factors)  to  the  complex  lead  to  the  ubiquitination  and  degradation of the receptors.  In human, Smad 6 and 7 form the I­Smad class.  The Smad 

7 can inhibit both the TGFb/Activin and BMP signalling whereas Smad 6 preferentially  inhibits the BMP signalling. 

Generally,  the  Smad  proteins  have  highly  conserved  N­terminal  and  C­terminal  domains  known  as  MH1  (MAD­homology  1)  domain  and  MH2  (MAD­homology  2)  domain,  respectively,  and  an  intervening  linker  region  (Massague,  1998;  Shi  and  Massague, 2003).  The MH1 domain is made up of approximately 130 amino acids and is  extremely conserved in both R­Smads and Co­Smad (Smad 4) but not in I­Smads.  In the  active state, the MH1 domain displays sequence­specific DNA binding activity and may 

be  involved  in  nuclear  import.  In the basal state, the MH1 domain  negatively regulates  the function of MH2 domain by physically interacting with the MH2 domain.   The MH1  domain of I­Smads exhibits weak sequence homology with the MH1 domain of R­Smads  and  it  does  not  bind  to  DNA.    On  contrary,  the  MH2  domain  is  extensively  conserved  among  all  Smad  proteins.    It  is  about  200  amino  acids  long  and  contains  receptor  phosphorylation  sites  and  a  characteristic  SXS  motif  in  R­Smads.    It  is  involved  in  (a)  receptor interaction, (b) formation of homomeric and heteromeric Smad complexes, and

In contrast, the intervening linker region is highly diverse in length and sequence, but it  contains  (a)  multiple  phosphorylation  sites  which  permit  specific  crosstalks  with  other  existing  signalling pathways, and (b) a PY  motif  which directs specific  interaction with  the Smurfs. 

1.2.1.5 Recognition of Smad by the activated receptor complex 

How  is  a  specific  Smad  recognized  by  the  activated  receptor?    From  previous  structural comparison and  sequence analysis,  it  has  been postulated that the basic patch  adjacent to the L3  loop of R­Smad  is responsible  for the  binding of the phosphorylated 

GS  region  of  the  TβR­I  (Wu  et  al.,  2000).    This  postulation  is  further  supported  from  results  obtained  in  a  study  in  which  one  of  the  invariant  residues,  His331  in  the  basic  patch  of  Smad  2  was  mutated  and  this  led  to  a  reduction  in  its  binding  affinity  for  phosphorylated TβR­I (Huse et al., 2001).  The corresponding specificity determinant in  the TβR­I lies in the L45 loop of the receptor kinase domain, which is found immediately  next to the GS domain, and is specifically involved in the interaction with the R­Smads  (Chen  et  al.,  1998;  Feng  and  Derynck,  1997).    In  addition,  the  presence  of  auxillary  proteins may facilitate the recognization of R­Smads by the receptors.  For instance, both  Smad 2 and Smad 3 can be immobilized near the cell membrane surface by SARA (Smad  anchor  for  receptor  activation),  through  an  interaction  between  a  peptide  sequence  of  SARA and the extended hydrophobic surface area on Smad 2 and Smad 3 (Tsukazaki et  al., 1998).  The SARA possesses a phospholipids binding FYVE domain which can target  the molecule to the membrane of the early endosomes.  The efficient recruitment of the

Smad 2 and Smad 3 to the activated receptors for phosphorylation is facilitated by these  interactions. 

1.2.1.6 Mechanism of Smad phosphorylation and activation 

The  R­Smads  are  directly  phosphorylated  by  activated  TβR­I  at  10  residues  inclusive of the SXS motif present in the MH2 domain of R­Smads (Shi and Massague,  2003).  Phosphorylation destabilizes the interaction of Smad and SARA, and causes the  Smad to dissociate from the complex.  This dissociation exposes a nuclear import region 

on  the  Smad  MH2  domain.    The  phosphorylation  of  Smad  also  increases  its  affinity  to  Co­Smad,  Smad  4.    The  association  of  these  two  proteins,  together  with  importin b  protein, will translocate into the nucleus to elicit genes transcription. 

The  active  form  of  TGFb  ligand  transduces  its  signal  by  first  binding  to type  II  receptor  serine/threonine  kinase  on  the  cell  surface.    Ligand  bound  type  II  receptor  serine/threonine  kinase  then  recruits  and  phosphorylates  the  GS  domain  of  the  type  I  receptor  serine/threonine  kinase.    This  leads  to  the  activation  of  the  type  I  receptor  serine/threonine  kinase.    Activated  type  I  receptor  serine/threonine  kinase  uses  its  GS  domain  and  L45  loop  to  interact  with  the  basic  pocket  and  L3  loop  of  R­Smad.    This  results  in  the  phosphorylation  of  the  SXS  motif  at  the  C­terminal  of  R­Smad.    The  phosphorylated  R­Smad  undergoes  homotrimerization  and  formation  of  heteromeric  complexes  with  the  Co­Smad.    The  activated  Smad  complexes  together  with  bound  importin b  translocate  into  the  nucleus.    Inside  the  nucleus,  the  importin b  dissociates

from  the  complex  and  the  translocated  Smad  complexes  cooperate  with  other  nuclear  cofactors to form an activation complex that co­operatively  binds  in a precise geometry 

to  regulatory  sequences  of  the  target  gene  and  initiate transcription (Shi  and  Massague,  2003).  This TGFb signal transduction can be negatively regulated by I­Smad through (i)  competing  with  R­Smads  for  receptor  or  co­Smad  interaction  and  (ii)  targeting  the  receptors for degradation. 

1.2.1.8 TGF b  Subfamily and its isoforms 

The TGFb  subfamily  has  been  implicated  in  numerous important physiological and  developmental processes (Alliston et al., 2001; Cohen, 2002; Massague, 1998; Opperman 

et al., 2002).  There are three TGFb isoforms in mammals.  They are TGFb1 (GenBank  accession  number  BC022242),  TGFb2  (GenBank  accession  number  NM_003238),  and  TGFb3  (GenBank  accession  number  NM_003239).    All  isoforms  exhibit  very  similar  sequence to the prototype TGFb1, particularly the active domain where the spacing of the  seven  cysteines  is  most  conserved  (Hinck  et  al.,  1996).  In  mammals,  TGFb1,  TGFb2,  and TGFb3 are  highly conserved.   Each of them  has different binding affinities to their  receptors and elicits different biological effects.  For  instance,  both TGFb1 and TGFb3  are  expressed  in  tissue  structures  that  are  undergoing  morphogenesis  and  TGFb2  is  expressed in differentiating and mature epithelium (Taipale et al., 1998). 

1.2.1.9 Latent TGF b , latent TGF b  binding protein, and bone

Members  of  the  TGFb  are  known  to  be  involved  in  bone  remodelling.    They  stimulate  osteoid  formation  but  inhibit  mineralization  process  (Cohen,  2003).    Latent  TGFb is found abundantly in bone.  The latent TGFb is a 100 kDa homodimer complex. 

It consists of mature TGFb and a precursor known as LAP (latency­associated protein).  Two  forms  of  latent  TGFb,  one  associating  with  a  190  kDa  LTBP  (latent  TGFb  binding protein) and the other  does not, are produced by the osteoblasts (Cohen, 2003).  The  associating  LTBP  seems  to  direct  the  latent  TGFb  for  storage  in  the  bone  matrix.  The  latent  TGFb  can  be  released  from  the  bone  matrix  by  a  matrix  remodelling  agent  known  as  plasmin,  which  acts  on  the  protease­sensitive  hinge  region  of  LTBP.    This  cleavage releases a 130 kDa portion of the LTBP and leaves the 60 kDa amino terminal  portion  of  LTBP  attached  to  the  matrix.    The  tethered  latent  complex  containing  the  cleaved  LTBP  portion  and  its  latent  TGFb  attaches  to the  putative  binding  sites  on  the  cell surface via the cleaved LTBP portion and is activated by the cell­surface associated  plasmin.  This activation causes the mature TGFb homodimer to dissociate from LAP to  become biologically active.  The biologically active TGFb homodimer binds to the TβR­ 

II  and  elicits  downstream  signalling  process.    The  activity  and  level  of  active  TGFb  is  maintained  by  Decorin  which  present  on  the  bone  extracellular  matrix  surface  and  the  circulating a2­macroglobulin. 

In  contrast,  latent  TGFb  without  LTBP  exists  as  free  circulatory  form  of  latent  TGFb.  The function of these latent TGFb without LTBP is unknown.  It may form free  pools available for activation.

1.2.1.10 Perturbation of TGF b  signalling in human diseases 

Perturbation  of  the  TGFb/Smad  signalling  pathway  underlies  many  human  disorders  such  as  embryonic  anomalies,  cancer,  autoimmune  disease,  atherosclerosis,  hypertension,  osteoporosis,  fibrotic  diseases,  hereditary  hemorrhagic  telangiectasia,  and  Camurati­Engelmann  disease  (Cohen,  2003;  Massague,  1998).  This  is  summarized  in  Table 1. 

1.2.1.11  TGF b 3,  and  its  expression  patterns  during  early  embryogenesis  and  in  adult  tissues 

Three different forms of TGFb exist in the mouse and human, of which TGFb3 is 

known  to  play  a  distinct  role  in  development.    Human  TGF b 3  gene  is  located  at 

chromosome  14q24.    It  is  synthesized  as  a  pre­promonomeric  protein  and  is  cleaved  to  form a 112 amino acid mature polypeptide (Derynck et al., 1988; ten Dijke et al., 1988a;  ten Dijke et al., 1988b). TGFb3 shares approximately 80% sequence identity with TGFb1  and TGFb2 at its C­terminal 112 amino acids. 

Three  embryonic  expression  studies  of  Tgf b 1­3  were  performed  in  mouse,  of 

the  lung,  and  some  muscles  (Millan  et  al.,  1991;  Pelton  et  al.,  1991;  Schmid  et  al.,  1991a).    The  Tgfb3  protein  is  detected  in  cardiac  muscle,  heart  myocytes,  lens  fibers,  cochlear epithelium, cartilage, bone, bronchi of the lung, cuboidal epithelial lining of the  kidney tubules, liver capsule, and smooth muscle of oesophagus and intestine. Table 2 is 

early mouse embryogenesis. 

Examination  of Tgf b 3  mRNA  transcripts  in  adult  mouse  tissues  using  Northern 

Blot  analysis  show  that  Tgf b 3  transcripts  are  predominantly  present  in  placenta,  lung, 

brain, heart, testis, adipose tissue, and male submaxillary gland (Miller et al., 1989).

TGFb signalling components Disease  TGFb  TGFb 

precursor a  Endoglin 

b 

ALK1 c  Type II receptor  Type I 

receptor  SMAD 2  SMAD 3  SMAD 4 Cancer d  Enhanced tumor 

invasion and 

metastasis 

Colorectal cancer (30%) Gastric cancer (15%) Other neoplasms 

Breast cancer (16%) Other neoplasms 

Colorectal cancer (11%) Lung cancer (7%) Haptocellular cancer 

Colorectal cancer Multiple endocrine neoplasia type 

1 

Pancreatic cancer (50%) Colorectal cancer (30%) Lung cancer (10%) Other neoplasms Causal 

factors 

Increased TGFb 

expression 

Somatic mutations 

Somatic mutations 

Somatic mutations 

Loss of heterozygosity Inactivation of menin disrupts Smad 3 binding to DNA, hence block TGFb signalling 

Somatic mutations 

Hereditary hemorrhagic telangiectasia type 1 

Hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2 

juvenile polyposis (subset) Causal 

factors 

TGFb 

polymorphisms 

Germline mutations 

Germline mutations 

Germline mutations 

Table 2.  Expression patterns of Tgfb3 mRNA transcripts and its protein during early 

+ + 

1.2.1.12 TGFb3 knockout mice studies 

Mouse  knockout  studies  suggest  that  Tgfb3  is  important  in  pulmonary development  and  palatogenesis  (Kaartinen  et  al.,  1997;  Kaartinen  et  al.,  1995; 

Proetzel et al., 1995).  It is found that all Tgfb3 homozygous (Tgfb3­/­) mutant mice 

die  shortly  after  birth  and  they  display  only  two  major  phenotypes,  abnormal pulmonary histopathology and cleft palate. 

1.2.1.12.1 Abnormal pulmonary histopathology 

Immediately  after  birth,  all  Tgfb3­/­  null  pup  mice  present  abnormal 

pulmonary  histopathology  (Kaartinen  et  al.,  1995).    Their  terminal  air  spaces  are grossly abnormal.  Their lungs have atelectic, pseudoglandular histology.  The alveoli are  hypoplastic,  lacked  of  alveolar  septal  formation,  and  show  mesenchymal thickening and hypercellularity.  These features suggest that there is a developmental 

delay in the lungs of Tgfb3­/­ null mice.  This lung phenotype also resembles the lung 

appearance  of  extremely  premature  human  infants,  who  are  at  risk  for  developing broncho­pulmonary  dysplasia.  In  addition,  extensive  intrapulmonary  and  pleural haemorrhages are observed in these null mice. 

Proetzel  et  al.,  1995).    During  palatogenesis,  Tgfb3  is  localized  in  the  epithelial 

component  of  the  vertical  palatal  shelves,  predominantly  in  the  MEE  (medial  edge

epithelium)  (Fitzpatrick  et  al.,  1990).    Its  expression  is  lost  as  the  epithelial  seam 

disrupts,  soon  after  the  palatal  shelves  fuse.    In  Tgfb3­/­  null  mice,  basement 

membrane  degradation  and  MEE  transdifferentiation  are  found  to  be  disrupted, leading to  cleft palate (Kaartinen et al., 1997;  Kaartinen et al.,  1995; Proetzel  et al., 1995). 

Subsequent  culture  analyses  performed  using  mouse  and  chick  palates demonstrate  that  CSPG  (chondroitin  sulphate  proteoglycan)  is  present  on  the  apical surface of MEE cells immediately prior to palatal shelves adhesion (Gato et al., 2002). 

This suggests that CSPG is required for palatal adhesion.  It is found that Tgfb3­/­ null 

palates  lack  CSPG  on  their  MEE  surface  and  addition  of  TGFb3  is  able  to  restore palatal  shelves  adhesion  via  the  stimulation  of  CSPG  production  by  the  MEE cells. This provides a direct role of TGFb3 for palatal shelves adhesion.  It has been found that  Tgfb3  can  also  induce  filopodia­like  structures  formation  on  the  outer  cell 

membrane of wildtype (Tgfb3+/+) mouse palatal MEE prior to adhesion (Taya et al., 

1999).    These  filopodia­like  structures  are  absent  in Tgfb3­/­  mouse  palatal  shelves. 

When  exogenous  recombinant  TGFb3  is  added  into  culture  medium  of  Tgfb3­/­ 

mouse palatal shelves, it can restore the fusion of these palatal shelves.   In addition, Tgfb3 is known to be involved in tissue remodelling during palatal fusion (Blavier et al.,  2001).    Tissue  remodelling  during  palatal  fusion  involves  a  combination  of basement membrane degradation and epithelial­mesenchymal transformation.  Studies have  shown  that  this  remodelling  process  is  under  the  control  of  MMPs  (matrix metalloproteinases)  and  TIMPs  (tissue  inhibitors  of  metalloproteinases)  (Blavier  et 

al.,  2001).      In  the  Tgfb3  null  mice,  the  expression  level  of Timp2  and  Mmp13  are 

markedly reduced  in the degrading MEE seam during  fusion process  (Blavier et al.,

2001).    This  suggests  that  the  expression  of  MMPs  and  TIMPs  is  dependent  on 

TGFb3. 

Not much is known about the molecular mechanism control of TGFb3 during 

palatogenesis.  However, two recent studies show that Tgfb3­induced palatal fusion is mediated by Alk5/Smad2 signaling pathway (Dudas et al., 2004) and Tgfb3 activates 

transcription  of  Lef1  (lympoid­enhancing  factor  1)  gene  in  MEE  cells  to  induce 

epithelial  mesenchymal  transformation  during  mouse  palate  development  (Nawshad and Hay, 2003). 

1.2.1.13 TGFb3 mutations and diseases 

1.2.1.13.1 Potential candidate gene for non­syndromic oral clefts 

TGFb3  has  been  proposed  as  one  of  the  potential  candidate  genes  for  non­ 

syndromic oral clefts.  The  strong supporting evidences are  derived  from previously 

reported expression studies in mouse and animal knockout model.  Tgfb3 is expressed 

in  the  MEE  of  the  palatal  shelves  during  palatal  fusion,  and  is  required  for  the adhesion  of  the  MEE  and  the  disruption  of  midline  epithelial  seam  of  the  palatal shelves  (Fitzpatrick  et  al.,  1990;  Kaartinen  et  al.,  1997;  Kaartinen  et  al.,  1995; 

Proetzel et al., 1995).  The Tgfb3 knockout mice  also  show  developmental defect of 

the  secondary  palate  and  delayed  pulmonary  histopathology (Kaartinen  et  al.,  1995; Proetzel et al., 1995). 

In human, the association of TGFb3 and oral clefts is controversial.  Some of 

the previously described population studies reported significant association of TGFb3 

with  non­syndromic  oral  clefts  in  the  Caucasian  (Beaty  et  al.,  2002;  Lidral  et  al., 1998;  Vieira  et  al.,  2003),  Japanese  (Ichikawa  et  al.,  2006;  Sato  et  al.,  2001)  and Korean  populations  (Kim  et  al.,  2003).    In  contrast,  there  are  some  reports  that

et al., 2004),  and Japanese populations (Tanabe  et al., 2000).   When TGFb3 gene  is 

screened for the presence of mutations in the entire coding and promoter regions, no mutations  are  identified  in  the  coding  regions  (Bayat  et  al.,  2003).    However,  21 polymorphisms  are  detected  in  the  promoter  region.    These  polymorphisms  may  be 

important in contributing the disease pathogenesis associated with the TGFb3 gene. 

1.2.1.13.2 The disease gene for ARVD1 

Recently, TGFb3 has been identified as the disease gene involved in ARVD1 

(arrhythmogenic right ventricular dysplasia type 1) (Beffagna et al., 2005).  Three key 

evidences  supported the  association  of TGFb3  with  ARVD1.   First,  the  mapping  of 

ARVD1  to  chromosome  14q23­q24  coincides  with  the  chromosomal  location  of 

TGFb3 gene (Rampazzo et al., 1994).  Second, two regulatory mutations (­36G>A in 

the 5’ UTR and 1723C>T in the 3’ UTR) in TGFb3 gene have been identified in nine 

family members with proven ARVD and 40 asymptomatic members, and an unrelated proband, respectively (Beffagna et al., 2005).  Third, ARVD is characterized by fibro­ 

fatty  replacement  of  the  right  ventricular  myocardium,  and  coincidently  TGFb3  is 

also expressed in the myocardium

1.2.2 Zebrafish: An Animal Model for Craniofacial Development and  Disease 

1.2.2.1 Overview of the zebrafish model system 

The  zebrafish,  Danio  rerio,  was  introduced  20  years  ago  by  George 

Streisinger as a model for genetics of vertebrates (Streisinger et al., 1981).  Zebrafish 

is tropical  freshwater fish that belong to the  family of cyprinid (Detrich et al., 1999; Wixon,  2000).    They  are  small,  approximately  3cm  in  length,  and  are  commonly found in the streams of India.  The females are usually fat when laden with eggs and have  few  or  none  gold  colouration  on  their  undersides.    On  contrary,  the  males  are slender and torpedo­shaped.  They have black longitudinal stripes running along their length and usually have gold colouration on their bellies and fins. 

The  zebrafish  has  25  pairs  of  chromosomes  and  these  chromosomes  contain about 1.7 x 10 9 base pairs of DNA, which is about half the size of the human genome (Driever and Fishman, 1996; Postlethwait et al., 1994; Postlethwait et al., 1998). 

1.2.2.2 Advantages and disadvantages of zebrafish as the animal model 

For  over  100  years,  the  laboratory  mouse  Mus  musculus  is  the  predominant  model  animal  for  studying  genetics  of  development  and  disease.    However,  Mus 

musculus  has  several  disadvantages  as  an  animal  model,  which  includes  its 

intrauterine  development,  high  maintenance  cost,  and  it  is  more  costly  to  generate knockout mice using ES (embryonic stem) cell gene targeting technology. 

Since the zebrafish was introduced 20 years ago, it has emerged rapidly as an excellent model organism to bridge the gap between fly/worm and mouse/human for the study of vertebrate development and diseases.  As an model system, it has several advantages  (Detrich  et  al.,  1999;  Dodd  et  al.,  2000;  Penberthy  et  al.,  2002).      (1)

Embryos  develop  externally  and  they  are  optically  transparent.    This  allows  easy observation  of  embryogenesis  and  organogenesis  processes  under  a  dissecting microscope.    In  addition,  the  external  fertilisation  enables  the  ease  of  external manipulation of the live embryos.  (2) They are relatively small.  Therefore, they can 

be  maintained  in  high  densities  in  laboratory.    (3)  They  have  short  generation  time, approximately 2­3  months.  This will expedite  the generation of  mutant  fish  line  for study.  (4) High fecundity as hundreds of embryos can be  laid from each female per week.  This allows large  scale genetic screenings to be carried out.  (5)  The cost of maintaining a fish facility is relatively lower than for the mouse. 

There  are  several known  disadvantages  of zebrafish as a  model  system.  For examples, (1) The  lack of ES cells  for gene  targeting.   Therefore, knock­out studies cannot be performed.   (2)  Duplication of zebrafish genome.   This results  in genetic redundancy  that  may  complicate  the  comparison  of  homologous  developmental pathways with other vertebrate species, in particular human.  However, some authors consider the duplication of some genes as an advantage because it helps to understand the developmental roles of genes that cause early lethality in knockout mice. 

1.2.2.3 Disease modelling in zebrafish 

Presently,  two  approaches  are  available  in  modelling  human  diseases  in zebrafish  (Dodd  et  al.,  2000).    One  approach  involves  analysis  of  mutant  models derived  from  chemical  mutagenic  screens,  and  another  involves  the  candidate  gene approach.    In  the  former  approach,  a  number  of  mutants  with  phenotypes  that resembles  human  disease  states  are  observed.    However,  to  identify  the  causative genes  underlying  the  disease  phenotypes  presents  a  technical  challenge.  To  date, there  are  340  entries  from  the  PUBMED  search  of  the  NCBI  database

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) that use zebrafish to model human diseases.  Some of these examples are illustrated in Table 3.  The candidate gene approach can be used in parallel to complement the mutant models derived from mutagenic screens approach. Basically, this approach isolates and identifies zebrafish orthologues of human disease causing genes in order to model human disorders.  This is usually by BLAST searches 

or  keyword  searches  containing  the  name  of  the  disease  against  the  zebrafish  EST database.  The disease phenotype is then established by knocking down the particular gene product

Table 3.  Zebrafish models of human disease* 

Human disease  Mutated gene  Zebrafish 

mutant 

Zebrafish mutant  defect 

Beta­spectrin  reisling  Anaemia.    Defects  in 

cytoskeleton  of  red  cell  membrane 

(Sun  and  Hopkins,  2001) 

Usher  1B 

syndrome 

Myosin VIIA  mariner  Inherited deafness caused 

by defects in sensory hair  cell functions 

In recent years, the zebrafish has emerged as an alternative model organism to study  craniofacial  development  and  disease.    Despite  being  quite  different  from mammals,  many  principles  and  features  that  govern  craniofacial  development  in higher  vertebrates  are  conserved  in  zebrafish  (Yelick  and  Schilling,  2002).    Cell lineage studies conducted in zebrafish show that cranial neural crest cells are  formed 

at  the  dorsal  and  lateral  regions  of  the  neural  ectoderm  at  12  hpf  (Schilling  and Kimmel,  1994).    After  gastrulation  stage,  they  begin  to  migrate  in  three  distinct streams  to  populate  each of  the  seven  pharyngeal  arches.    It  is  also  found  that  each arch  is  made  up  of  unique  set  of  neural  crest­derived  cartilages  and  bones  that resemble those of other vertebrates (Schilling, 1997).  The zebrafish cranium is made 

up  of  six  different  types  of  cartilage,  and  two  types  of  bone  (dermal  and  cartilage replacement  bone)  (Benjamin,  1990;  Cubbage  and  Mabee,  1996).    Cartilage  bones form  the  majority  of  bones  of  the  zebrafish  skull,  approximately  43  out  of  74,  and they will undergo either endochondral or perichondal bone formation. 

As  it  is, the  early head  skeleton  in zebrafish possesses several attributes as a simple  system  for  understanding  the  genetic  control  of  craniofacial  development (Kimmel et al., 2001).  First, the development of the larval skeleton takes only a few days.    Second,  zebrafish  contains  craniofacial  skeletal  elements  and  muscle  tissue types similar to their vertebrate counterparts.  Third, their early skeletal elements are very  small  and  mostly  made  of  cartilages,  with  simple  monolayered  and  spatial arrangements.    Fourth,  their  craniofacial  development  process  has  been  successfully examined  at  single­cell  level  in  living  embryos  using  lineage­tracing  techniques. High resolution fate maps are also produced and are extremely similar to those of the