Đồ án nghiên cứu tìm hiểu ứng dụng chitin, chitosan

Hàng năm các nhà máy chếbiến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm[1].Việc sản xuất chitosan có nguồi gôc từ vỏ tôm đã mang lại hiệu quả kinh tế cao.Với kh

MỞ ĐẦU

Chitosan là polysacharid nhiều thứ hai sau cellulose tìm thấy trong tựnhiên.Sản phẩm chitin - chitosan đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụngtrong thực tế [2,3,6,8 ] Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệutrung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trịkhác Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, ydược và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốckem, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường[11]…Với khả năng ứngdụng rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã

và đang nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này.Giáp xác là nguồn nguyên liệuthủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam.Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đônglạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suất chế biến Hàng năm các nhà máy chếbiến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm[1].Việc sản xuất chitosan có nguồi gôc từ vỏ tôm đã mang lại hiệu quả kinh tế cao.Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin – chitosan trong cuộc sống như vậy.Từnhững vấn đề trên nhóm nghiên cứu chúng tôi quyết dịnh chọn đề tài “Nghiên cứutìm hiểu ứng dụng chitin, chitosan”làm đồ án tốt nghiệp

Chương1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử và nguồn gốc chitin, chitosan:

1.1.1 lịch sử phát hiện chitin, chitosan:

Danh từ “chitin” bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “tunic” hay “envenlopen” đó

có nghĩa là lớp vỏ ngoài hay sự bao bọc

Chitin đã được phát hiện bởi Henri Braconnot vào năm 1811[5] Lần đầutiên ông phân lập được chitin như một hợp chất không tan trong kiềm của một số

loại nấm Hợp chất do Braconnot phân lập được còn lẫn rất nhiều tạp chất nhưngông khẳng định đây không phải là gỗ.

Đến năm 1823, Odier đã cô lập được chitin từ cánh cứng của con bọ cánhcứng và cũng phân lập được chitin khi loại khoáng vỏ cua Từ đó, Odier chorằng đây là hợp chất cơ bản trong vỏ giáp xác và côn trùng

Vào năm 1834, Children phát hiện sự có mặt của nitơ trong chitin, 9 nămsau đó tức năm 1843 sự tồn tại của nitơ trong chitin đã được Lassaigne chứngminh một lần

Đến năm 1859, C.Rouget phát hiện ra một hợp chất mới khi đun hoàn lưuchitin trong dung dịch KOH đặc, có tính chất khác với chitin, ông gọi nó là

Năm 1912, Brach và Furth nhận thấy tỉ lệ acid acetic và glucosamin là 1:1,ông gọi nó là “polyme mono acetyl glucosamin”

Năm 1928, Meyer và Mark dựa trên phổ nhiễu xạ tia X kết luận rằng chitin

và chitosan nằm ở dạng liên kết β(1 4) giữa các mắc xích pyranoz

Từ những năm 1930 đến 1940 có rất nhiều nghiên cứu vế chitin vàchitosan, khoảng 50 phát minh được đăng ký Với những nghiên cứu của mình,Purchase và Braum chứng minh được chitin là một polysaccharide củaglucossamime bằng cách thuỷ phân chitin theo nhiều cách khác nhau, hay vớinghiên cứu của Rammelberg đã xác định một cách chính xác nguồn gốc củachitin.

Vào năm 1948, Matsusshima cũng đã có một phát minh sản xuấtglucossamine từ vỏ cua

Năm 1950, người ta đã sử dụng tia X để phân tích nhằm nghiên cứu sâuhơn sự hiện diện của chitin trong nấm và trong thành tế bào

Và đến năm 1951, quyển sách đầu tiên viết về chitin đã được xuất bản Bấygiờ, người ta đã phát hiện tiềm năng của các polyme thiên nhiên này

Nhưng sự cạnh tranh của các loại polyme tổng hợp nên đã kìm hãm sự pháttriển thương mại của chitin và chitosan Cho đến năm 1970, hàng loạt nghiêncứu về chitin và chitosan được tiến hành với mục đích ban đầu là tận dụng nguồnphế liệu dồi dào từ việc chế biến thuỷ sản (vỏ tôm) nhằm tránh gây ô nhiễm môitrường Tuy nhiên, các nhà khoa học đã phát hiện ra các tính chất đặc biệt củachitin và các dẫn xuất của nó không những giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường

mà còn mở ra một triển vọng rất lớn trong việc ứng dụng chitin và các dẫn xuấtcủa chúng vào sản xuất

Vào năm 1978, một hội nghị đầu tiên nói về chitin và chitosan diễn ra tại

Mỹ và thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới

Hiện nay, những nghiên cứu về chitin và chitosan đã đạt những thành côngnhất định Tại Nhật, một chương trình nghiên cứu dài hơn 10 năm cũng bắt đầu

Bảng 1.1 Thành phần chất hữu cơ trong loài động vật chân đốt.

khởi động Trung Quốc, tuy là nước bắt đầu nghiên cứu chậm hơn so với nhữngnước khác nhưng lại đang phát triển rất nhanh trong lĩnh vực này

1.1.2 Nguồn gốc của Chitin:

Chitin được tìm thấy chủ yếu ở hai nguồn sau đây:

và bướm

Chitin thường có khoảng 25 đến 50% trên lượng khan của lớp cutin, thành

phầnkhácchủ yếu là protein và calci carbonat

23,7

35,0

68,161,8

76,3

55,8

13,331,0

Từ thực vật bậc thấp Nguồn gốc của chitin trong thực vật giới hạn ở một số loài nấm và tảo Trong nấm chitin đóng vai trò như cenlulose trong các loài cây

Người ta đưa các giả thiết khác nhau về sự hiện diện của chitin hoặccenlulose làm cơ sở cho mối quan hệ phát sinh giữa các nhóm của giống nấmđặcbiệt làphycomecetus Qua phân tích bằng tia X, Frey đã xác nhận rằng chitin

và cenlulose không hiện diện đồng thời

Chitin hiện diện trong tảo xanh, bằng phương pháp vi hóa học Roelofsen

và Hoette đã tìm thấy chitin trong nấm men, Kreger cũng thu được chitin trongmột số loài nấm men bằng nhiễu xạ tia X

Chitin không hiện diện một mình trong lớp vỏ ngoài của loài nấm mà nóđược liên kết với những thành phần khác Lượng chitin được tinh chế từ một sốloài nấm thồng thường từ 3% - 5%

1.2 khái niện chitin, chitosan:

Chitin là một polyme sinh học rất phổ biến trong tự nhiên và đứng hàng thứhai chỉ sau celluloze Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo của vách tế bàonấm, cấu tạo nên bộ khung xương của vỏ tôm, cua, côn trùng, các động vật giápxác Trong các loại nguyên liệu này, chitin liên kết chặt chẽ với protein, lipid,các muối vô cơ (CaCO3) và các sắc tố màu (astarene, astaxanthin, canthaxanthin,lutin ).

Chitosan là dẫn xuất của chitin, nó được tạo thành bởi phản ứng deacetylhoá chitin Khi chitin được xử lý với các chất kiềm đậm đặc ở nhiệt độ cao(1200C) trong dung dịch, nó sẽ bị loại nhóm acetyl và bị phân huỷ khác nhau đểcho ra một sản phẩm là chitosan Vậy chitosan không phải là một đơn chất mà nó

là một nhóm sản phẩm của chitin bị loại nhóm acetyl từng phần (Attila E,Pavlath and Dominic W S Wong, 1996)

1.3 Cấu trúc của chitin, chitosan:

1.3.1 Cấu trúc của chitin:

Chitin là một dạng polysaccharide gồm các tiểu phân N-acetyl-D– Glucosaminekết hợp lại với nhau theo liên kết β(1 4) Liên kết của chitin là poly[β-(1→ 4)-2-acetamido-2- deoxy- D- glucopyranose] Chitin có cấu trúc tinh thể và nó cấutạo thành một mạng lưới sợi hửu cơ Vì thế mà chitin làm tăng độ bền , độ cứng

và là điểm tựa cho các sinh vật (Riccardo, 1996)

Chitin có công thức phân tử là: (C8H13O5N)n

Trong đó có chứa

39,37%O và 6,89%N

Hình1.1 Cấu trúc mạch polyme của chitin và cellulose

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử chitin trong không gian

Hình 1.3 Cấu trúc của chitosan

Về cấu trúc hoá học của chitin cũng tương tự như celluloze ngoại trừ nhómhydroxyl thứ hai trên nguyên tử carbon alpha (Cα) trên phân tử celluloze đượcthay thế bằng nhóm acetoamide Cũng nhờ vào cấu trúc này mà việc ứng dụngcủa chitin vào xử lý nước thải nhà in nhuộm là một việc rất có triển vọng

1.3.2 Cấu trúc của chitosan:

Chitosan là một poly[β-(1→ 4)- 2-amino-2- deoxy- D- glucopyranose] Cảchitin và chitosan đều là copolymer, tỉ lệ giữa 2 nhóm monomer này cũng là tỉ lệgiữa nhóm amino và nhóm acetamido và được gọi là độ deacetyl (DD) của sảnphẩm Nếu DD>60%, đó là chitosan, ngược lại là chitin

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử chitosan trong không gian

Cấu trúc của phân tử chitosan trong không gian có hình xoắc ốc, mỗi đơn vị

cơ bản có 2 mắc xích D- glucosamin Chiều dài mỗi đơn vị cơ bản là 10,34 A0(theo http://www.dalwoo.com)

1.4 Điều chế chitin, chitosan:

1.4.1 Điều chế chitin:

Hình1 5 Thành phần hóa học của vỏ tôm

Chitin trong tự nhiên thường không tồn tại ở dạng tự do mà kết hợp với những

chất khác như: protein, khoáng chất, lipit, màu Do đó, cần phải dùng những tác

nhân mạnh để tách các chất này ra khỏi chitin Những phương pháp này có thể

gây ra sự phân hủy một phần chitin, khó mà thu được sản phẩm nguyên vẹn,

không bị phân huỷ

27.2

23 45.16

3.64

Chitin Protein Khoáng Nước và các chất khác

Có rất nhiều phương pháp khác nhau để tinh chế chitin nhưng thông dụng

nhất là: phương pháp cô lập chitin của Hackman, phương pháp Wistler –

Beniller và phương pháp Roscman[1] Nhưng không có một chuẩn mực nào

Bảng 1 2 Hàm lượng chitin trong vỏ một số loại giáp xác ở nước ta

chung cho các quá trình, thường người ta đi qua các bước: loại khoáng, loạiprotein, khử màu Trong đó thì quá trình loại khoáng và loại protein có thể đổitrật tự cho nhau tuỳ theo nghiên cứu

Nguyên liệu Khối lượng

Hàm lượng(%)

2 H+ + CaCO3 (r)  Ca2+ + CO2 + H2O

 Loại protein

Rất nhiều tác nhân đã được sử dụng để loại protein như NaOH,NaHCO3, KOH, K2CO3 Tác nhân ưa chuộng nhiều nhất là NaOH do tính phổbiến của nó Hiện nay, do yếu tố môi trường được chú ý nhiều hơn nên người tađang phát triển các qui trình sử dụng men và vi sinh vật

Phương trình thủy phân Protein

 Khử màu

Trong vỏ của các loại giáp xác có chứa các phần tử mang màu, chủ yếu

là carotenoid Các phần tử này không liên kết với protein hay khoáng chất nênkhông bị loại trong các quá trình loại khoáng và protein Để trích màu, người ta

dùng ethanol hay aceton hoặc dùng các chất oxy hoá như H2O2, KMnO4 để

3 lần, sau đó phần rắn được thu hồi và rửa nhiều lần với nước cho đến khi trungtính Cuối cùng rửa với ethanol và ether, rồi sấy khô, chitin thu được có khốilượng 37,4g, hiệu suất là 17%, có dạng bột màu vàng, Hàm lượng N đo được là6,8% so với lý thuyết là 6,89%

Sơ đồ 1.1 Quy trình điều chế chitin bằng phương pháp Hackman

1.4.1.2 Phương pháp WISTLER và BENILLER

Lọc vỏ tôm được rửa sạch, sấy khô trong lò sấy chân không ở 50oC Dùng 500gxây nhuyễn rồi ngâm trong dung dịch NaOH 10% ở nhiệt độ phòng trong 3ngày, dung dịch kiềm được thay đổi hang ngày Những hạt đã được loại proteinđược rửa với nước rồi nghiền với ethanol 95%, cho đến khi phần nước lọc gầnnhư không màu ( thao tác này dung khoảng 6 L ethanol 95%)

Phần rắn lại tiếp tục đem nghiền với khoảng 1 L acetone, 2,5 L ethanol và0,5 L ether, sau đó lọc những hạt thu được gần như không màu, sấy khô ở áp

Vỏ tôm xử lý lần 1

Vỏ tôm xử lý lần 2

Vỏ tôm xử lý lần 3

Chitin (37,4g)

Rửa bằng ethanol rồi đến ether.

Sấy khô đến trọng lượng không đổi.

Sơ đồ 1.2: Quy trình điều chế chitin theo phương pháp Wistler và Beniller

suất kém và được ngâm trong dung dịch HCl 37%, ở 20oC trong 4 ngày Nhữnghạt trương phồng được ly tâm tách ra ở 0oC và rửa với nước ở 0oC cho đến khihết acid Hiệu suất là 20% (100g) hàm lượng N là 7,1%

1.4.1.3 Phương pháp ROSEMAN

Vỏ tôm được khử Ca giống như phương pháp Hackman ở trên Cân 100gđược lắc rung cơ học trong 18 giờ với 100mL dung dịch acid formic đặc (90%) ởnhiệt độ phòng Lọc lấy phần bã, rửa kỷ với nước và được xử lý trong 2 giờ vớidung dịch NaOH 10% Đem lọc, phần bã thu được có màu trắng, rửa dưới vòi

Sấy khô dưới áp suất kém

Ngâm trong HCl 37%, 20 oC, trong 4 ngày

Ly tâm lấy phần rắn và rửa cho đến khi trung tính

Sơ đồ1.3 Quy trình điều chế chitin theo phương pháp Roseman

nước đến khi trung tính, sau đó rửa vài lần với ethanol và ether, rồi sấy khô dưới

áp suất kém, hiệu suất khoảng 50% - 60%, hàm lượng N là 8,5%, hàm lượngacetyl là 19,2%

1.4.2 Điều chế chitosan:

Phương pháp điều chế chitosan bao gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Những phần tử vô cơ thường bị loại do tác dụng của acid vô

cơ loãng hoặc enzyme hòa tan muối vô cơ

Giai đoạn 2: Protein và các hợp chất hữu cơ khác bị loại do tác dụng củakiềm hoặc enzyme protease

(Rửa sạch, sấy khô, được khử Ca theo phương pháp Hackman.)

Rửa kỹ phần bã với nước

Ngâm trong dung dịch NaOH 10%, trong 2,5h, ở nhiệt độ phòng.

Rửa đến khi trung tính.

Rửa với ethanol rồi ether.

Sấy khô dưới áp suất kém.

Hình1 6 Phổ IR của Chitin (A) và Chitosan (B)

Giai đoạn 3: Dùng dung dịch NaOH 40% - 60% và các muối của nó hoặcenzyme protease để deacetyl hóa thu được chitosan

Độ tinh khiết của Chitosan có thể được kiểm tra bằng cả hai phương pháphóa học (Cho Chitosan hòa tan hoàn toàn trong dung dịch CH3COOH 1%, nếuChitosan tan càng nhiều thì chứng tỏ nó có độ tinh khiết càng cao) và phươngpháp vật lí (Đo phổ IR, H-NMR).Sau đây là một số phương pháp điều chếchitosan

1.4.2.1 Phương pháp của Nguyễn Hoàng Hà[9]:

Vỏ tôm được làm sạch, nghiền nhỏ, cho vào lò nguyên liệu cùng với nướctheo tỉ lệ 1:1, nấu sôi trong 1 – 2 giờ, lọc thu được vỏ tôm sơ chế Vỏ tôm sơ chếđược để nguội 60 – 65oC rồi thủy phân đạm bằng dung dịch HCl 10% theo tỉ lệ 2

kg nguyên liệu: 1 L dung dịch HCl, trong 2 – 5 giờ, hoặc enzyme protease (1 kgnguyên liệu : 0,3 – 0,5g protease) ở 40oC – 70oC, trong 0,5 – 3 giờ Sau đó chovào dung dịch HCl 10%, ở nhiệt độ phòng, trong 2–6 giờ thu được phức chitinprotein Tiếp theo tiến hành thủy phân phức chitin protein bằng dung dịch NaOH10% theo tỉ lệ 5 kg nguyên liệu: 1 L NaOH ở nhiệt độ thường, trong 2 – 3 ngàythu được chitin thô Chitin thô được tẩy màu bằng nước Javel công nghiệp theo tỉ

Đun với nước theo tỉ lệ 1 :1, trong 1-2 giờ, lọc.

Dung dịch HCl 10%, t o phòng, trong 6 – 12 giờ lọc, rửa, sấy khô.

Dung dịch NaOH 10%, t o phòng, trong 2-3 ngày Lọc, rửa, sấy khô.

Nước javel công nghiệp tỉ lệ 1:1, trong 30 phút.

Dung dịch NaOH 40%, ở 110 – 130 o C, trong 5-8 giờ Lọc, rửa, sấy khô.

Sơ đồ1 4 Quy trình điều chế chitosan theo phương pháp

của Nguyễn Hoàng Hà

1 L nước Javel công nghiệp Sau 30 phút thu được chitin tinh khiết Cuối cùngchuyển hóa chitin thành chitosan bằng dung dịch NaOH 40% ở 110 – 130oC,trong 3 – 8 giờ, rửa, lọc, sấy khô thu được chitosan

1.4.2.2 Phương pháp của Đặng Văn Luyến

Vỏ tôm được nghiền nhỏ, phơi khô, cho vào dung dịch NaOH 3% (tỉ lệ 1

kg nguyên liệu: 4 L NaOH) tiến hành phản ứng ở 90oC trong 2 – 4 giờ, sau đórửa sạch, sấy khô Tiếp tục cho vào dung dịch HCl 0,6N ( theo tỉ lệ 1 kg nguyênliệu: 4 L dung dịch HCl ) phản ứng tiến hành ở 20 – 30oC, trong 4 – 6 giờ Tiếnhành lọc, rửa, sấy khô vỏ tôm ( quá trình này được lặp đi lặp lại 3 – 4 lần để táchhết Ca và protein) Hiệu suất tách chitin là 10 – 15% so với vỏ tôm khô

Sơ đồ 1 5 Quy trình điều chế chitosan theo phương pháp

của Đặng Văn Luyến

Tiếp theo cho chitin vào dung dịch NaOH 40% ( theo tỉ lệ 1 kg chitin: 1 L

NaOH) thay đổi đột ngột nhiệt độ của huyền phù chitin trong dung dịch

NaOH 40% từ 5 – 100oC bằng cách tăng rồi giảm đột ngột nhiệt độ từ 2 – 3

lần Sau đó để huyền phù chitin ở 30oC trong 2 – 5 ngày Cuối cùng, tiến

hành phản ứng chuyển hóa chitin thành chitosan ở 70oC – 100oC, trong 1 –

3 giờ, Lọc, rửa, sấy khô Dung dịch NaOH thu hồi để xử lý vỏ tôm ban

đầu.

4L HCl 0,6N, ở 20 – 30 o C, trong 4 giờ (lặp lại 3 lần).

Lọc, rửa, sấy khô.

1,5L NaOH 40% (thay đổi nhiệt độ từ 5 – 90 o C) Tiến hành

ngâm trong 4 L NaOH 3%, 90 o C, trong 2 – 4 giờ.

Lọc, rửa, sấy khô.

Vỏ tôm (1000g)

Sơ đồ1.6 Quy trình điều chế chitosan theo phương pháp bán thủy nhiệt

1.4.2.3 Phương pháp bán thủy nhiệt của Nguyễn Hữu Đức[11]:

Vỏ tôm được rửa sạch, loại bỏ phần thịt thừa, sấy khô và xay nhỏ, sau đó ngâm trong dung dịch HCl 12% trong 6 giờ, lọc, rửa sạch và sấy khô Tiếp tục cho nó vào dung dịch NaOH 15 M trong 1 giờ, sau đó lọc rửa kỷ, sấy khô Hiệu suất đạt khoảng 70%.

1.4.2.4 Điều chế chitosan theo phương pháp hóa sinh

* Nguyên liệu

 Vỏ tôm: Được rửa sạch, sấy khô và đem xay thành bột.

 Vi sinh vật: Có 2 loại giống chính là Bacillus và Pseudomonas Ngoài ra còn có một số loài vi khuẩn khác như: Micrococus radiatus, Flavobacterium aurantiacus, Mycobacterium cyaneum…

 Enzym protease tư nhiên như Bromelin.

dung dịch HCl 12%, ở nhiệt độ phòng, trong 6 giờ.

lọc, rửa, sấy khô.

dung dịch NaOH 15M, trong 1 giờ.

Lọc, rửa, sấy khô.

Sơ đồ1.7 Quy trình điều chế chitosan theo phương pháp hóa sinh

Quá trình điều chế thực hiện qua 2 giai đoạn:\

 Giai đoạn 1: Dùng vi khuẩn giống bacillus để hòa tan muối vô cơ nhưcalci carbonat

 Giai đoạn 2: Dùng bromelin để phân giải nối peptid của chitin và protein

 Hiệu suất điều chế là 28,2%

1.5 Tính chất của chitin, chitosan:[10]

1.5.1 Tính chất của chitin:

Chitin là một chất rắn vô định hình, màu trắng, có cấu trúc tương tự nhưcenlulose Trong tự nhiên, chitin tồn tại dưới 3 dạng cấu hình: α, β, γ- chitin;nhưng phổ biến nhất là α-chitin, β-chitin Do cấu hình của chitin khác nhau, dẫnđến chúng có một số tính chất khác nhau nhưng nhìn chung chitin có các tínhchất sau:

Dùng 4g chế phẩm bacillus trộn với vỏ tôm, pha nước

đến độ ẩm 50% Chỉnh pH đến 7, giữ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, trong 36 giờ.

Rửa sạch, ly tâm tách hết nước.

ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.

Rửa sạch, sấy khô ở 100 o C

Cả celluloze và chitin đều là những tinh thể cao, chúng chỉ tan trong một sốdung môi đặc biệt Chitin bị phân hủy trước khi nóng chảy, đây là đặc tính tiêubiểu của polysaccharid có liên kết hydrogen Điều này cần thiết để hoà tan chitin

và chitosan trong một hệ thống dung môi riêng biệt để truyền tính năng

- Trong dung dịch HCl, chitin có độ triền quang thay đổi từ [α]20 = -1407đến [α]26 = +560 bởi sự thủy phân

- Chitin là một polymer rất kỵ nước, không tan trong nước và trong hầu

hết các dung môi hữu cơ, acid loãng Nhưng nó lại tan tôt trong HCl đặc, H2SO4đặc, H3PO4 78 – 97%, axit formic khan và tan trong hexafluoro isopropanol,hexafluoro aceton, chloro alcol dưới sự có mặt của dung dịch acid vô cơ vàdimetylacetamid chứa 5% litiumchlorid (George A.F Roberts, 1992)

* Sự thủy giải chitin

 Sự thủy giải bằng acid

Ledderhose thu được từ sự thủy giải chitin trong dung dịch acid một sảnphẩm dạng tinh thể mà ông gọi là glusosamine vào năm 1876

Năm 1902, một phương pháp thủy giải nhẹ nhàng hơn tạo nên 2 –acetamiddo–deoxy–D–glucose Như vậy cấu trúc và thành phần chính của chitin

đã được cô lập 2–acetamiddo–2– deoxy–D–glucose hydrochloride đã được táchrời với hiệu suất 60 – 70% do sự thủy phân chitin từ cua với acid chlohidric đặc

 Sự thủy giải bằng enzyme

Với chế phẩm enzyme từ một ốc sên, Hackman đã thu được một lượng 44% tinhthể 2 – acetamido – 2 – deoxy – D – glucose và chỉ 0,5% 2 – amino – 2 – deoxy– D – glucose từ chitin

Trong thí nghiệm tương tự với một enzyme H Pomatia, tinh thể 2 – acetamido –

2 deoxy – D – glucose thu được từ chitin của nấm men và tôm hùm với lượngtương ứng là 50% và 80%

Từ đó các nhà nghiên cứu đưa ra nhiều công thức thực nghiệm tính DDcủa sản phẩm Các công thức này khá lặp lại về kết quả và phù hợp với kết quảcủa phương pháp chuẩn độ keo

DD = 100 – (A1655/A3450) x 115

Trong đó:

A1655: diện tích phần phổ hấp thu do dao động của nhóm amide I

A3450: diện tích phần phổ hấp thu do dao động của nhóm -OH

 Phương pháp phản ứng với ninhydrin

Nhóm amino của chitin và chitosan có khả năng phản ứng với ninhydrin tạo

ra hợp chất khử và amoni Hai hợp chất này phản ứng với nhau tạo hợp chấtmang màu Định độ hấp thu màu bằng phương pháp quang phổ UV, từ đó xácđịnh DD

 Phương pháp xác định độ keo

Phương pháp này dựa trên phương pháp định lượng độ keo do Terayamadùng để phân tích các hợp chất đa điện tích trong dung dịch nước Dung dịch củamột anionic đã biết nồng độ được mang đi tác dụng với dung dịch chitosan trongHCl, dùng methylen blue để xác định điểm cuối

 Phương pháp chưng cất với acid phosphoric

Khi tác dụng với acid phosphoric ở nhiệt độ cao, gốc acetyl trong chitosan

sẽ bị tách ra dưới dạng acid acetic và định lượng bằng NaOH theo phương phápchuẩn độ thể tích

Cách tiến hành như sau: cho 0,3g vào dung dịch chứa 50ml H2O và 50mlH3PO4 85%, tiến hành chưng cất với nhiệt độ tăng dần 10C trong 1 phút cho đến

1600C, duy trì nhiệt độ này trong 60 phút, định lượng dịch chưng cất bằng ddNaOH 0.1N với chất chỉ thị màu PP.

Độ deacetyl được tính theo công thức:

DD = 100 – 2.03V/m

Với 2.03: hệ số liên quan đến phân tử lượng của chitin tính theo lý thuyết V: thể tích thực chuẩn độ mẫu

m: khối lượng mẫu thử đã dung

 Dựa vào Nitrogen toàn phần

DD = Trong đó :

c là N toàn phần (được xác định bằng phương pháp kjeldahl)

d là hàm lượng N của chitin theo lý thuyết

a là độ giảm khối lượng

Ngoài các phương pháp trên người ta còn sử dụng các phương pháp khác

để xác định DD như: phổ NMR, định phân acid-base, sắc ký khí, phương phápthuỷ phân bằng acid và phân tích bằng HPLC,…

1.5.2.2 Dung môi và tính tanChitosan là một bazơ, dễ tạo muối với các acid, hình thành những chấtđiện ly cao phân tử (polyelectrolyt) có tính tan phụ thuộc vào bản chất của cácanion có liên quan Quá trình hoà tan chitosan có thể xảy ra hai giai đoạn : hìnhthành muối và hoà tan muối Tuy nhiên, thường cho acid và chitosan đã ở dạnghuyền phù trong nước để hai quá trình xảy ra đồng thời Tính tan của muốichitosan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, mức độ deacetyl hoá, tổng lượngacid có mặt và nhiệt độ dung dịch

a.Trong acid vô cơ

Chitosan tan được trong HCl, HBr, HI, HNO3, và HClO4 loãng nhưngcũng có thể tách riêng được trong dung dịch HCl hoặc HBr khi tăng nồng độacid Chitosan tan rất ít trong H3PO4 đậm đặc, sự hoà tan xảy ra song song với sựsulfat hoá và thuỷ phân chitosan

Chitosan tan được trong các dung dịch axit loãng là do sự proton hoá củanhóm amin tự do Hằng số phân ly Kb của một nhóm amin được xác định dựatrên cân bằng sau:

Khi α = 1, polymer trở nên trung hoà điện tích và thế năng tĩnh điện bằng

0 Ngoại suy giá trị pKa tại α = 1 sẽ giúp chúng ta ước lượng được hằng số phân

ly riêng của các nhóm ion, pK0 Giá trị này ước tính được khoảng 6,5, giá trị nàyhoàn toàn độc lập với độ DA, trong khi giá trị pKa thì phụ thuộc rất lớn vào yếu

tố này pKa được gọi là pKariêng của chitosan Như vậy, tính tan của chitosanphụ thuộc vào mức độ phân ly và phương pháp deacetyl hoá của nó

b Trong acid hữu cơ

Chitosan hình thành muối tan được trong nước với phần lớn các acid hữu

cơ Các muối của monocarboxylic acid như chitosan benzoat, aminobenzoat (chitosan antranilat), chitosan aminobenzoat, chitosan phenylacetat tan tốt nhưng chitosan hydrocinnamat tan rất ít và chitosan -p-methonycinnamat thì không tan Còn muối của chitosan và acid formic, acidacetic tan rất tốt trong nước

chitosan-o-Ngoài ra, chitosan còn tan rất dễ dàng trong hỗn hợp DMF- N2O2 với tỷ lệN2O4 : chitosan là 3:1, cho dung dịch có độ nhớt nhỏ Đây là dung môi hữu cơduy nhất của chitosan được biết đến

c Tính tương hợp với các dung môi

Chitosan tan tốt trong một số rất ít các dung môi hữu cơ, chitosan trongdung dịch acid acetic có thể thống nhất với các dung môi phân cực mà khônggây ra một sự tạo tủa nào Dung dịch của acid acetic – chitosan có tính tươnghợp tốt với các rượu như methanol, propanol, butanol, ethylenglycol,dietylenglycol, aceton và formalamid

Những dung dịch acid của chitosan đều hoà lẫn được các nhựa tan trongnước không ion, hồ, dextrin, saccaro, sorbitol và các loại dầu mỡ, các parafin,hydrochloric, nitric, formic, citric, acid lactic nhưng không tan trong acidsulfuric và các sulfat

1.5.2.3 Thuỷ phân bằng acid

Trong môi trường acid, chitin – chitosan đều bị thuỷ phân Khả năng bịthuỷ phân phụ thuộc vào các nhóm thế trong chitin theo thứ tự sau:

-NHCOCH3 < -OH < -NH2Mức độ thuỷ phân phụ thuộc vào loại acid, nồng độ acid, nhiệt độ và thờigian phản ứng Các kết qủa nghiên cứu cho thấy trong môi trường H2SO4, sựthuỷ phân chitosan luôn kèm theo quá trình O<N – sulfate hoá, cho sự cắt mạchphân tử chitosan một cách ngẫu nhiên

Trong dung dịch HCl, chitosan bị cắt mạch nhưng không như trong dungdịch H2SO4 HCl thủy phân chitosan sản phẩm cuối cùng chủ yếu là monomer,dimer, trimer Trong môi trường khác như HF, H3PO4 chitosan vẫn bị thủy phânnhưng ở mức độ khác nhau Trong dung dịch CH3COOH, sự thuỷ phân chitosan

ở nhiệt độ thường xảy ra là không đáng kể

1.5.2.4 Phản ứng nitrat hoá

Chitosan tương tự celluloze có đặc tính tạo nitrat Tuy nhiên, hỗn hợpHNO3 – H2SO4 được dùng làm tác nhân để điều chế celluloze nitrat lại khôngthích hợp cho chitosan vì H2SO4 gây phản ứng cắt mạch chitosan Có hai hướngđiều chế chitosan nitrat như sau:

- Chitosan phản ứng với HNO3 loãng

- Chitosan tác dụng với hỗn hợp của acid acetic loãng: anhydric acetic: acid nitricnguyên chất ở nhiệt độ thấp hơn 50C theo tỉ lệ 1:1:1:3

Sản phẩm thu được từ hai quá trình trên đều là muối acid của chitosannitrat, có mức độ thế là 1.65 dưới tác dụng của kiềm loãng sẽ chuyển sang

chitosan nitrat có hàm lượng O-nitrat không đổi, thường thực hiện trong aceton50%

1.5.2.5 Phản ứng photphat hoá

Phản ứng photphat hóa xảy ra khi cho chitosan tác dụng với 15 phầnpyridine và 5 phần phosphorus axychlorid ở 400C trong 5 giờ Sản phẩm có hàmlượng P là 24% Có hai phương pháp điều chế ester phosphat của chitosan:

- Dựa trên phương pháp điều chế celluloze phosphat, gia nhiệt chitosan với hổnhợp acid phosphoric và ure Thường dùng một chất lỏng trơ để xúc tiến phản ứngnhư DMF, toluen

- Thực hiện phản ứng của chitosan với pentoxid P ở nhiệt độ từ 0 → 50C Trong

đó, chitosan đã được hoà tan trước trong methan sulphonic acid

1.5.2.6 Phản ứng sulfat hoá

Quá trình sulfat hoá xảy ra bằng cách xử lý chitosan, tái tạo tủa, chuyểnhoá dung môi thông qua chuỗi: nước → ethanol → ethanol nguyên chất → diethylether → DMF và phức SO3- DMF trong lượng thừa DMF, phản ứng đượcduy trì ở nhiệt độ phòng Sản phẩm tạo thành một nhóm N-sulphate và O-sulphate

Chitosan–NH2 +O3S-O-CH = N(CH3)2 → Chitosan–NH–SO2OH + HCON(CH3)2

Tuy nhiên để thực hiện tốt phản ứng deamin hoá chitosan, người ta thay bằng

anhydrid N2O3 Cơ chế phản ứng như sau: trước hết hình thành ion diazonium,ion này phân hủy tạo ion carbonium, gây ra sự cắt mạch

1.5.2.9 Tính tạo phức

Trong môi trường acid, chitosan bị proton hoá nên nó phản ứng được vớicác polyanion tạo phức Khi pH > 4, nó tạo phức được với các hợp chất màu vàkim loại nặng Các nhà khoa học giả thuyết rằng do đôi electron tự do của nhómamin đã giúp chitosan tạo được liên kết cho nhận với các đối chất Tuy nhiên,còn phải xem xét tới các hiện tượng đơn giản như hấp phụ, tương tác tĩnh điện

Bảng 1.3: Một số thông số đặc trưng của chitin

là Og nối giữa 2 vòng D – Glucoz

Theo Tanja Becker, Michael Schlaak và Henry Strasdeit (2000), khả nănghấp phụ của chitosan đối với từng ion kim loại như sau: Cu(II) > Cd(II) ≈ Ni(II)

> Pb(II)[18]

Tên hoá học Polyacetylaminglucoza Polyaminoglucoza