LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH ENZIM HỌC

Năm 1833: Payen và Persoz chứng minh avoine tạo vị ngọt từ tinh bột Năm 1897: Eduard Buchner tách chiết enzim từ tế bào nấm men Năm 1907: Boidin chứng tỏ vi khuẩn Bacillus subtilis thuỷ phân được tinh bột

PHẦN MỞ ĐẦU

LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH ENZIM HỌC

•Năm 1833: Payen và Persoz chứng minh avoine tạo vị ngọt từ tinh bột

•Năm 1897: Eduard Buchner tách chiết enzim từ tế bào nấm men

•Năm 1907: Boidin chứng tỏ vi khuẩn Bacillus subtilis thuỷ phân được

tinh bột

•Từ năm 1900:

Kuhne đưa ra tên enzim

Fischer chứng minh enzim có tinh đặc hiệu xúc tác

Michaelie Menten đặt nền tảng cho động học enzim

•Nhật Bản sản xuất chế phẩm enzim đầu tiên vào những năm 1960:

Takamin, Hỗn hợp amilase và protease từ Asp Oryzae.

MỘT SỐ KHÁI NIỆM CHUNG

• Định nghĩa:

xúc tác sinh học; bản chất protein; hoà tan trong nước và dung dịch muối loãng; phân tử lượng lớn.

• Đặc tính sinh học:

 Bị biến tính dưới tác dụng của các yếu tố làm biến tính protein

 Tính đặc hiệu xúc tác cao.

 Các enzim nguồn gốc tự nhiên không độc

 Cường lực xúc tác lớn

 Tác dụng trong điều kiện êm dịu

• Nguồn nguyên liệu thu enzim

 Nguồn động vật: dạ dày lợn (pepsin); dạ dày bê (renin); tuỵ tạng

(pancreatin)

 Nguồn thực vật: nhựa đu đủ (papain); lá và vỏ dứa (bromelin);

 Nguồn vi sinh vật: vô cùng phong phú; thay đổi hệ enzim VSV

bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy; VSV sinh sản & phát triển

và STH enzim với vận tốc rất lớn; enzim có hoạt tính rất mạnh

công nghiệp

 Chế phẩm enzim thô: nhận được sau lên men không qua tinh chế

 Chế phẩm enzim kỹ thuật: Chế phẩm nhận được sau khi đã tinh

chế sơ bộ tách một số protein và enzim tạp

 Chế phẩm enzim tinh khiết: Chế phẩm enzim đã được loại bỏ

hoàn toàn protein và enzim tạp

• Đơn vị hoạt độ (IU)

Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1µM cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

• Đơn vi Katal

Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1IU = 1/60 µkatal = 16,67 nkatal

• Hoạt độ riêng

Số đơn vị hoạt độ enzim trên đơn vị khối lượng protein của chế phẩm

IU hoặc katal / 1 mg protein

• Hoạt độ phân tử

Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một phân tử enzim trong 1 phút

• Hoạt độ tâm xúc tác

Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một trung tâm hoạt động

ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘ ENZIM CỦA CHẾ PHẨM

Những điều lưu ý khi xác định hoạt độ

enzim

• Tránh những yếu tố có thể gây biến tính

protein enzim

• Enzim tồn tại bền vững và ổn định trong điều

kiện phản ứng

• Lượng cơ chất được chuyển hoá khoảng 20

– 30%

• Thời gian xác định hoạt độ ngắn, nếu dài cần

có các giải pháp tránh sự phát triển của VSV

• Làm mẫu kiểm chứng với enzim bị vô hoạt

trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất

Xác định thông số động học của chế

phẩm enzim

Một enzim cấu tạo gồm 2 dưới đơn vị giống nhau về trọng lượng phân

tử 50kDa Enzim xúc tác phản ứng:

Ta có chế phẩm enzim chứa 3 mg protein/ml và độ tinh khiết của enzim là 80% Xác định hoạt độ được thực hiện bằng hấp thụ ánh sáng ở 512 nm Đây là chiêu dài bước sóng mà sản phẩm phản ứng hấp thụ Hệ số hấp thụ

phân tử của sản phẩm là ε = 5000 mol -1 L cm -1 Môi trường phản ứng bão hoà cơ chất được điều chỉnh tới pH = 7,0 và duy trì nhiệt độ ở 30 o C Thể tích dịch là 3ml Người ta sử dụng 100ml tách chiết enzim đã được pha loãng 500 lần Để xác định dùng phương pháp 2 điểm, bằng cách bổ sung 2ml chất dừng phản ứng vào môi trường phản ứng sau

2 phút tiến hành Sự thay đổi hấp thụ đọc được là 0,6uA.

Đơn vị enzim được định nghĩa là lượng enzim có thể xúc tác thuỷ phân 1 µ M

cơ chất trong 1 phút ở 30 o C và pH = 7,0.

Tính toán Tính nồng độ hoạt độ xúc tác (theo đơn vị/ ml tách chiết)

2 6

3

1 , 0

1 10

2

1 10 5

10 5

1

2

1

A

Thể tích dịch đọc 5ml

Chất dừng phản ứng 2ml

Dịch chiết enzim 100 à l (đã pha loãng 1/500) Môi trường phản ứng 3ml

Hoạt độ chế phẩm =

Hoạt độ chế phẩm =

faloang enzim

V

HSCD V

2

1

1 2

1

ε

Hoạt độ chế phẩm = 750 đơn vị/ ml chế phẩm

Tính hoạt độ đặc hiệu của chế phẩm

Hoạt độ tâm xúc tác của enzim

250 3

750

=

Hoạt độ đặc hiệu = đơn vị/ mg protein

Số à mol cơ chất được thủy phân/ phút/ mg protein

Hoạt độ phân tử của enzim

80

100

10 10

AS - 6 - 3

(1) : mol cơ chất được thủy phân/ phút/ mg protein

(2) : mol cơ chất được thủy phân/ phút/ g protein

(3) : mol cơ chất được thủy phân/ phút/ g enzim

(4) : mol cơ chất được thủy phân/ phút/ mol enzim

Qui trỡnh xin phộp sử dụng chế phẩm

enzim mới

 Nhà sản xuất, Nhà hoàn thiện sản phẩm và Nhà kinh doanh

 Hoạt độ enzym chính, các hoạt độ enzym phụ, cách thức tác dụng lên cơ chất, chất thải trao đổi chất

 Đặc tính hoá chính xác tổ chức sản xuất hay các tế bào động vật, thực vật sử dụng, dữ liệu về taxonomiques và nhận biết chính xác chủng sản xuất

 Trong trường hợp biến đổi gen: nguồn gốc gen, đoạn codantes hay diều

chỉnh, vectơ, sự có mặt của gen đánh dấu…

 Qui trình thu nhận chế phẩm enzim, kỹ thuật tách chiết và tinh chế

 Thành phần của chế phẩm, những đặc điểm riêng, phù hợp hay không với luật 5.09.89

 Tính chất không độc của chế phẩm và các sản phẩm tạo ra do tác dụng của enzim (hay các enzim được sử dụng trong chế phẩm) và xác định được hệ số

Nội dung của hồ sơ xin giấy phép