các phương pháp tách chiết nucleic acid

các phương pháp tách chiết nucleic acid

Các phương pháp tách

chiết nucleic acid

Phạm Hùng Vân

Tách chiết DNA

• Tách chiết thô, chưa tinh khiết được DNA

từ mẫu một cách hoàn toàn Phương pháp

áp dụng cho các mẫu có nhiều DNA đích (canh cấy vi khuẩn, tách chiết các mẫu

thuỷ sản )

• Tách chiết tinh sạch, tinh khiết được DNA

từ mẫu một cách hoàn toàn

Tách chiết DNA bằng proteinase K

 Là phương pháp tách chiết thô

 Phương pháp dựa trên nguyên tắc dùng

dung dịch proteinase K, chất tẩy và nhiệt

độ để làm tiêu hóa protein bám trên DNA

của virus cũng như vi khuẩn Ngoài ra

dung dịch cũng làm tiêu hóa các protein có mặt trong bệnh phẩm

Tách chiết DNA bằng nhiệt

 Là phương pháp tách chiết thô

 Phương pháp dựa trên nguyên tắc dùng

nhiệt để tách DNA từ các tế bào vi khuẩn hay KST (KSTRS) vào dung dịch, hay sử dụng shock nhiệt trong dung dịch kiềm và

có chất tẩy (tách chiết mẫu thuỷ sản)

Tách chiết DNA bằng silica

 Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau

 Phương pháp này do BOOM sáng chế ra Nguyên tắc là dùng Guanidine thiocyanate (GuSCN) để phá hủy hoạt tính các

nuclease, và các DNA trong mẫu sẽ bám vào các hạt Silica, nhờ đó tách chiết được DNA từ mẫu thử

 Được nhiều công ty áp dụng để chế các kit tách chiết sử dụng cột với màng lọc silica, hay dùng các hạt từ bọc silica.

Tách chiết DNA bằng P/C/I

 Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau

 Mẫu thử khi được trộn cùng với dung dịch

Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (P/C/I) 25:24:1 thì các protein trong mẫu thử sẽ bị phenol làm biến tính và vón cục lại Khi ly

tâm, nhờ có sự hiện diện của chloroform nên các vón cục này sẽ bị tách ra và tập trung

trong lớp phân cách giữa phase nước và

phase P/C/I Phase nước chứa DNA trong

phase lỏng sẽ lấy ra và được làm kết tủa bởi ethanol ở nồng độ muối cao

Tách chiết DNA bằng CTAB

 Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho tách chiết bộ gene tế bào vi khuẩn

 Đầu tiên vách tế bào vi khuẩn bị lysozyme

làm yếu đi, rồi bị SDS ly giải Sau đó các

protein vi khuẩn sẽ bị proteinase K tiêu hóa, rồi các protein bị tiêu hóa nầy cùng các mảnh

vỡ tế bào bị CTAB kết tủa lại dưới sự hiện

diện của nồng độ muối cao Các thành phần lipid của vi khuẩn lại bị chloroform/isoamyl

alcohol lấy đi, bộ gen DNA của vi khuẩn trong phase lỏng sẽ bị kết tủa nhờ isopropanol.

Tách chiết DNA bộ gene bạch cầu

 Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng

cho tách chiết bộ gene tế bàobạch cầu

 Phương pháp nầy dùng đệm

carbonat-ammonium lạnh có EDTA để ly giải các tế

bào trong mẫu máu, sau đó ly giải nhân

các tế bào bạch cầu bằng một dung dịch

đệm kiềm có thêm SDS Dùng thêm

proteinase K để làm tan protein tế bào để phóng thích hoàn toàn bộ gen DNA vào

dung dịch Cuối cùng tủa bộ gen DNA

bằng isopropanol.

Tách chiết RNA

• Không có phương pháp tách chiết thô

• Tách chiết tinh sạch, tinh khiết được RNA

từ mẫu một cách hoàn toàn

Tách chiết RNA bằng silica

 Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau

 Phương pháp này do BOOM sáng chế ra

Nguyên tắc là dùng Guanidine thiocyanate (GuSCN) để phá hủy hoạt tính các nuclease,

và các RNA trong mẫu sẽ bám vào các hạt Silica, nhờ đó tách chiết được RNA từ mẫu

thử Nếu muốn loại bỏ hoàntoàn DNA thì có thể dùng DNAse

 Được nhiều công ty áp dụng để chế các kit tách chiết sử dụng cột với màng lọc silica,

hay dùng các hạt từ bọc silica.

Tách chiết RNA bằng Trizol

 Là phương pháp tách chiết RNA toàn phần, áp

dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau

 Phương pháp dựa trên phương pháp do

CHOMCZYNSKI và SACCHI sáng chế Nguyên tác

là dùng Guanidine 14M và urea, phối hợp với

phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein trong mẫu thử sẽ bị vón lại, DNA sẽ tan trong phase

phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và

sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâm lắng tách RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ

isopropanol với sự hổ trợ của tRNA và glycogen

Kiểm chứng độ nhạy của bộ thuốc

thử tách chiết nucleic acid

 Thực hiện tách chiết trên chứng [+] là mẫu thật

có chứa số copies biết rõ của rồi pha loãng các dịch tách chiết để thực hiện PCR để xác định LOD của phương pháp

 Thực hiện tách chiết trên chứng [-] là mẫu thật

có thêm vào nucleic acid vi sinh vật đích có lượng tương đương LOD của phương pháp

 Cho thêm vào mẫu thử nucleic acid của chứng nội

tại có lượng tương đương LOD của phương pháp rồi cùng tách chiết với mẫu thử Phương pháp này kiểm tra được độ nhạy của tách chiết trên từng mẫu thử

Kiểm chứng độ nhạy (LOD) của phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn đích, thực hiện hai lần liên tiếp

1,9: 100copies, 2,10: 10copies, 3,11: 1 copies

Kết quả kiểm tra chất lượng bộ thuốc thử NK DNAPREP-BOOM Đối tượng

dùng kiểm tra là huyền dịch M tuberculosis TB1 chứa 10.000 tế bào vi

khuẩn/ml được pha loãng để có 1,000 tế bào vi khuẩn/10ul (TB2), 100/10ul (TB3), 10/10ul (TB4), và 1/10ul (TB5) Kiểm tra bộ thuốc thử

NK DNAPREP-BOOM cần kiểm tra và bộ NK DNAPREP-BOOM được sản xuất trước đó Thể tích huyền dịch để tách chiết là 100ul, thôi ra 100ul rồi

lấy 10ul dịch tách chiết để chạy PCR phát hiện M tuberculosis trên PCR

mix đã biết độ nhạy đạt 1 copy/thể tích phản ứng

Mô hình phòng thí nghiệm real-time PCR

dành cho chẩn đoán

Mô hình phòng thí nghiệm PCR

dành cho chẩn đoán

Đảm bảo chất lượng khi

áp dụng PCR cho chẩn đóan

Phạm Hùng Vân*

*Giảng viên BM Vi Sinh-Khoa Y-ĐHYD, Phó PTN Y Sinh ĐHYD TP HCM, Trưởng Phòng Thí Nghiệm NK-BIOTEK

Tại Việt Nam, PCR và qPCR được sử dụng khá

rộng rãi và hữu dụng tại Việt Nam trong chẩn đóan, chỉ định

điều trị và theo dõi điều trị bệnh nhiễm HBV,

HCV, HIV, lao, CMV, Dengue…

PCR và real-time PCR là một hệ thống mở do vậy đã cho phép người sử dụng tiếp cận bằng cách thiết kế và chế tạo các thuốc thử hay bộ xét nghiệm dùng trong chẩn đóan Tuy nhiên vì phải áp dụng cho chẩn đóan

cho nên khi tiến hành thực hiện xét nghiệm PCR, người làm xét nghiệm phải chú ý các chuẩn mực kiểm soátt các sai lầm trong quá trình làm xét nghiệm và người cho chỉ định cũng như sử dụng kết quả cũng phải quan tâm đến các chất lượng này cũng như quan tâm đến các đánh giá ý nghĩa của xét nghiệm

Làm thế nào để áp dụng PCR

một cách chính xác và hiệu quả?

Đảm bảo chất lượng của việc

áp dụng PCR trong chẩn đoán

Chỉ định xét nghiệm PCR Lấy và chuyên chở mẫu thử đến phòng xét nghiệm

Thực hiện xét nghiệm PCR tại phòng thí nghiệm

Phúc trình kết quả xét nghiệm đến lâm sàng

Phân tích các kết quả xét nghiệm

Sử dụng các kết quả trong chẩn đoán và điều trị

Đảm bảo chất lượng PCR chẩn đoán

trước khâu xét nghiệm

 Chỉ định xét nghiệm: Đúng

 Lấy mẫu thử: đúng thời điểm, đúng cách, đúng

vật chứa, đúng bảo quản và chuyên chở

→ Phải có qui trình chỉ định xét nghiệm và lấy mẫu

→ Phải được cung cấp phương tiện lấy, lưu và chuyển mẫu

→ Phải có sổ giao mẫu với đủ thông tin ngày giờ giao mẫu

→ Phải có thông tin kèm với mẫu

Lấy, lưu trữ và chuyên chở mẫu thử

Để đảm bảo có mặt nucleic acid của tác nhân vi sinh vật cần phát hiện và nucleic acid này không bị ly giải hay bị ức chế

Tránh ức chế

Vật liệu lấy mẫu

Các kiểm soát chất lượng tại phòng xét nghiệm

Phát

hiện

 Tất cả các thuốc thử được pha chế hay cung cấp phải

được kiểm tra chất lượng và phải có bằng chứng kiểm tra chất lượng cho thấy phương pháp kiểm tra như thế nào, cách đánh giá thế nào là đạt, và kết quả kiểm tra chất lượng của thuốc thử đó

 Phải có đủ các chứng ở dạng bền vững để giúp người

sử dụng kiểm soát độ nhạy của các thành phần trong

bộ thử nghiệm và qui trình thử nghiệm

 Người sử dụng các thuốc thử này phải kiểm tra khi nhận thuốc thử và lưu lại cho đến khi dùng xong

Các thuốc thử làm xét nghiệm phải được

kiểm soát chất lượng

Kết quả kiểm tra chất lượng bộ thuốc thử NK DNAPREP-BOOM Đối tượng

dùng kiểm tra là huyền dịch M tuberculosis TB1 chứa 10.000 tế bào vi

khuẩn/ml được pha loãng để có 1,000 tế bào vi khuẩn/10ul (TB2), 100/10ul (TB3), 10/10ul (TB4), và 1/10ul (TB5) Kiểm tra bộ thuốc thử

NK DNAPREP-BOOM cần kiểm tra và bộ NK DNAPREP-BOOM được sản xuất trước đó Thể tích huyền dịch để tách chiết là 100ul, thôi ra 100ul rồi

lấy 10ul dịch tách chiết để chạy PCR phát hiện M tuberculosis trên PCR

mix đã biết độ nhạy đạt 1 copy/thể tích phản ứng

Một ví dụ kết quả kiểm tra chất lượng PCR mix dành cho

PCR phát hiện HBV và PCR phát hiện M tuberculosis

Đối với người làm xét nghiệm thì cũng phải có các

chứng và chuẩn để kiểm tra chất lượng của các khâu làm xét nghiệm bao gồm cả kiểm tra chất lượng của các thuốc thử đang dùng có còn giữ được chất lượng hay không, kiểm tra các bước xét

còn phải đánh giá độ chính xác của định lượng

Bệnh phẩm Chuẩn bị Tách chiết nucleic acid

Chạy PCR

Phát hiện sản phẩm PCR

Kiểm sóat độ nhạy của khâu tách chiết NA

Kiểm sóat nguy

cơ ngọai nhiễm

trong quá trình

tách chiết NA

Kiểm sóat độ nhạy của quá trình khuếch đại

Kiểm sóat nguy cơ

ngọai nhiễm và ức

chế trong quá

trình khuếch đại

Kiểm sóat độ chính xác của định lượng (qPCR

Chứng nội

(IC)

Mẫu

Tách chiết DNA

Chứng nội (IC)

Mẫu chứng [-]

Tách chiết DNA

Chứng nội (IC)

Mẫu nội kiểm

Tách chiết DNA

Chứng [+]

1-10uL 1-10uL 1-10uL 1-10uL

Kiểm tra độ nhạy và kiểm tra ngoại nhiễm

Kiểm tra độ nhạy PCR mix

Kiểm tra ức chế khi các

mẫu cho KQ âm tính

Kiểm tra độ lặp lại

của XN

Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực

Kiểm soát chất lượng xét nghiệm bằng thực hiện nội kiểm thường xuyên

Mẫu nội kiểm là các mẫu chuẩn hay mẫu thật đã biết trước kết quả, lưu giữ đúng điều kiện để bảo đảm chất lượng không đổi

Huyết thanh nội kiểm HBV và HCV được chuẩn bị từ các huyết thanh dương tính

trộn lại với nhau, đồng khô và đậy nắp dưới chân không

Mục đích của nội kiểm

Kiểm soát chất lượng của thiết bị, thuốc thử, qui trình

và con người làm xét nghiệm

 Nội kiểm nên được thực hiện mỗi ngày trước khi bắt đầu

tiến hành thử nghiệm (xét nghiệm sinh hoá, huyết học)

 Nội kiểm cũng nên được thực hiện mỗi khi vận hành thiết

bị mới, mới sửa chữa, phương pháp mới

 Nội kiểm cũng nên được thực hiện trên các lot thuốc thử

mới (vd: môi trường hay thuốc thử vi sinh)

 Nội kiểm cũng nên được thực hiện đối với một nhân viên

mới thực hành xét nghiệm

 Nội kiểm cũng có khi phải thực hiện cùng lúc với xét

nghiệm trên bệnh phẩm (nội kiểm xét nghiệm qPCR chẩn đoán)

CV HBV = 5%

CV HCV = 3%

Kiểm soát chất lượng xét nghiệm

qua tham gia ngoại kiểm

 Ngoại kiểm là nhận các mẫu thử từ các tổ chức kiểm

chuẩn, để thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán mà phòng thí nghiệm đăng ký được ngoại kiểm.

 Ngoại kiểm giúp phòng thí nghiệm: (1) kiểm soát

được chất lượng của tất cả các yếu tố tham gia xét nghiệm, và (2) phát hiện các sai sót hệ thống của xét nghiệm nhờ so sánh được kết quả các phòng xét

nghiệm với nhau

Nếu làm xét nghiệm PCR chẩn đoán với

 Các thuốc thử đã được kiểm tra chất lượng với

các bằng chứng được lưu giữ, và

 Khi làm xét nghiệm PCR chẩn đoán có thực

hiện được các chứng kiểm sóat chất lượng và kết quả cho thấy các chuẩn kiểm sóat chất lượng đều vượt qua được

 Thường xuyên thực hiện nội kiểm, và có tham

gia ngoại kiểm

Thì kết quả xét nghiệm chẩn đoán luôn đảm bảo được sự chính xác từ lúc bệnh phẩm được đưa vào xét nghiệm

Đảm bảo chất lượng xét nghiệm PCR trong trả lời kết quả đến lâm sàng

 Phải đủ các thông tin về kết quả

 Phải có các ý kiến bàn luận

 Phải kịp thời để lâm sàng có thể sử dụng

Sử dụng kết quả PCR

Kết quả PCR [+] có cho là bn đang bị bệnh không?

• Xác định được bệnh nhân bị nhiễm tác nhân gây bệnh

• Không khẳng định bệnh nhân bị bệnh mà còn tùy thuộc nhiều yếu tố:

Vd: Bệnh lao cần thêm X-quang, lâm sàng

Viên gan B mạn tính cần thêm số lượng HBV-DNA

và men gan

Sử dụng kết quả PCR

Kết quả PCR [-] có cho là bn không bị nhiễm?

• Xác định được tác nhân gây bệnh không có mặt trong bệnh phẩm thử nghiệm

• Không khẳng định bệnh nhân không nhiễm tác nhân gây bệnh:

Vd: HBV-DNA [-] mà HbsAg [+]

HCV-RNA [-] mà anti-HCV [+]

HIV-RNA [-] mà anti HIV [+]

Sử dụng kết quả PCR

Kết quả định lượng nên phân tích như thế nào?

• Không so sánh số copies mà chỉ nên so sánh giá trị Log

vì chỉ khảng định khác biệt định lượng có ý nghĩa khi kết quả hai lần thử chênh nhau 100 lần

• Vd: 425,379,000 copies so với 117,318,000 copies 4.25 x 8Log10 copiesso với 1.17 x 8Log10 copies

• Nhận định như vậy sẽ tránh lạm dụng xét nghiệm định lượng

Có một khoảng cách rất xa giữa

xét nghiệm dùng trong nghiên cứu và xét

nghiệm dùng trong chẩn đoán

Các vấn đề phải giải quyết trước khi đưa xét

nghiệm nghiên cứu vào chẩn đoán

 Thử nghiệm xác định độ nhạy và độ đặc hiệu

bằng thử nghiệm trên các mẫu biết rõ [+] và [+]

 Thử nghiệm trên các mẫu thật sự lấy từ bệnh

nhân so với chuẩn vàng (một xét nghiệm được thừa nhận hay các tiêu chuẩn chẩn đoán xác

định được thừa nhận)

 So với các xét nghiệm đang được sử dụng chẩn đoán để xem độ khác biệt và độ không khác biệt

 Phải giải quyết các khâu kỹ thuật để có các thuốc

thử bền vững

 Phải có phương pháp kiểm tra và phải kiểm tra

chất lượng xem có đạt

 Phải kèm các chứng để người làm thử nghiệm

kiểm tra được chất lượng chất lượng

 Phải đơn giản trong thao tác xét nghiệm và kết

quả nhanh

Các vấn đề phải giải quyết trước khi đưa xét nghiệm nghiên cứu vào chẩn đoán

Chìa khóa cho chất lượng PCR

áp dụng trong chẩn đoán

Chứng nội tại

(Internal Control)

Phạm Hùng Vân

Vai trò của chứng nội tại

 Kiểm soát được sự tách chiết trên mẫu mẫu thử tốt

hay không nếu được cho vào mẫu thử ở lượng tối

thiểu vừa đủ hay có sẵn trong mẫu thử

 Kiểm soát được ức chế để xác định được kết quả là

âm tính thật hay âm tính giả do có ức chế còn hiện diện trong các mẫu tách chiết

 Kiểm soát được hệ thống khuếch đại DNA đích có

đạt được độ nhạy hay không nếu chứng nội tại dùng chung mồi với DNA đích và hiện diện trong mẫu thử hay trong PCR mix với lượng tối thiểu vừa đủ

 Kiểm soát được hệ thống tách chiết đang dùng có

tốt hay không và thao tác có ngoại nhiễm không nếu có sẵn trong mẫu chứng âm hay được cho vào mầu chứng âm để được tham gia tách chiết cùng với mẫu thử

Chứng nội tại là DNA bộ gen vật chủ

 Ví dụ β globin gene nếu mẫu thử là mô lấy từ người,

hay myoglobin gene của tôm nếu mẫu thử

 Để có thể khuếch đại được DNA chứng nội tại,

chúng ta cho thêm vào trong PCR mix một cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội tại và nên thiết kế mồi sao cho nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ bắt cặp của mồi dành cho DNA đích, và không tạo ra các

dimer primer với mồi của DNA đích

 Sử dụng DNA bộ gene vật chủ nên kiểm soát được

mẫu thử có đủ không, kiểm soát được hệ thống tách chiết nucleic acid trên mẫu thử có tốt không, kiểm soát được ức chế có hay không

 Không kiểm soát được hệ thống khuếch đại DNA

đích vì dùng mồi khác biệt và chỉ dùng cho một số mẫu thử có chứa đủ lượng tế bào mô vật chủ

Chứng nội tại là DNA bộ gen vật chủ

DNA chứng nội tại có

nguồn gốc DNA bộ gen

vật chủ

Chứng nội tại là DNA tổng hợp có nguồn

gốc là DNA đích

 Là DNA được tổng hợp bằng cách dùng đúng sản

phẩm khuếch đại của DNA đích nhưng cắt ngắn đi

hay chèn một đoạn DNA nhỏ để làm cho nó dài hơn

 Sử dụng cùng mồi với DNA đích nên không cần thiết

kế mồi để cho thêm vào PCR mix

 Nếu cho vào mẫu thử trước khi tách chiết với lượng

vừa đủ thì đạt được cả 3 mục đích kiểm soát: (1) kiểm soát được hệ thống tách chiết nucleic acid có tốt

không, (2) kiểm soát được ức chế có hay không, và

(3) kiểm soát được độ nhạy của PCR mix khuếch đại DNA đích

 Nếu cho vào mẫu chứng âm với lượng tối thiểu vừa đủ

để được tách chiết cùng với mẫu mẫu thử thì khiểm

soát được (1) hệ thống tách chiết nucleic acid có tốt không, (2) kiểm soát được độ nhạy của PCR mix

khuếch đại DNA đích, (3) thao tác có ngoại nhiễm

không