Kiến thức về Lipid

Trang 1

I TỔNG QUÁT VỀ LIPID

1 Giới thiệu về lipid :

Lipid là một nhóm phân tử sinh học không tan trong nước và tan trong dung môi hữu cơ như hexane, diethyl ether hay chloroform… W W Christie, một chuyên gia thế giới về lipid định nghĩa như sau: lipid là những acid béo và những dẫn xuất của chúng và những chất liên quan về mặt chức năng hay sinh học đối với những hợp chất này.Sterol, tocopherol, và các carotenoid là những chất hợp thành thông dụng của lipid Triacylglycerol (hình 5.1a) là lipid tích lũy chính ( tích lũy năng lượng và tạo khung carbon) trong thực vật và động vật Triacylglycerol bao gồm mỡ (dạng rắn ở 200C) hay dầu (dạng lỏng ở 200C) Nói chung, hầu như mỡ được tìm thấy trong mô động vật và dầuđược tìm thấy trong mô thực vật

Lipid là một trong những thành phần sinh hóa cơ bản của động thực vật.Lipid chiếmđến 40% tổng nhu cầu năng lượng hằng ngày nên được cho là rất cần thiết đối với khẩu phần dinh dưỡng

Trang 2

2 Phân loại lipid: Có nhiều kiểu phân loại lipid, về cơ sở phân loại chủ yếu cũng dựa vào cấu tạo hóa học

Theo Lê Ngọc Tú, Plenikov,lipid có thể được chia ra 2 nhóm lớn :

Lipid đơn giản : về cấu tạo nó chỉ là ester của rượu và acid béo, không có thành phần khác tham gia Ví dụ như glyceride, sáp, steride (cholesterin) là ester của acid béo và rượu đa

vòng sterol

Lipid phức tạp : cũng là một ester nhưng khi thủy phân thu được ngoài thành phần chính là

rượu, acid béo còn có các thành phần khác như base nitơ, lưu huỳnh, acid phosphoric, glucid… Thuộc về nhóm này có một số nhóm lớn sau :

Phospholipid là ester của rượu đa chức với acid béo cao phân tử, trong thành phần còn có các gốc acid phosphoric, base có nitơ (phosphatid)

Glycolipid là ester của rượu và acid béo bậc cao, trong cấu tạo còn có glucid

(thường là galacto) hay dẫn xuất có nitơ của glucid

Lipoprotein : thành phần tham gia cấu tạo có acid béo, rượu và protein

3 Một số loại lipid thường gặp- Đặc điểm, cấu tạo, tính chất

“Chất béo thô” là một từ về liên quan đến thành phần cấu tạo hóa học, chúng bao

gồm tất cả những lipid không phân cực có thể tạo dẫn xuất được với diethyl ether

( thường là các triacylglycerol nhưng cũng có những lipid không phân cực khác như sáp,sterol, acid béo tự do và tocopherol)

Triacylglycerol (hình 5.1a) là những lipid có thể chứa một loạt những phân tử khác

nhau, mỗi phân tử có trọng lượng khác nhau, được quyết định bởi sự kết hợp trong từng trường hợp cụ thể của 3 acid béo (hình 5.1b) trong phân tử Ví dụ, loại phân tử

triacylglycerol nhiều nhất trong olive là triolein, bao gồm một khung glycerol và mỗi hydroxyl của glycerol được ester hóa với oleic acid (một acid béo có 18 carbon và 1 nối đôi giữa carbon 9 và 10) Khi phân tích thành phần cấu tạo hóa học của thực phẩm, mức độ no và không no của chất béo được đo thường xuyên Những chất béo no thì không chứa những nối đôi giữa các carbon trong phân tử (bao gồm chính là acid palmitic và stearic); những chất béo không no một nối đôi là những chất béo chỉ có một nối đôi duy nhất giữa hai phân tử carbon (chủ yếu là oleic acid); và những chất béo không no nhiều nối đôi chứa từ hai nối đôi trở lên (chủ yếu là linoleic và linolenic acid) Để phân tích những loại chất béo này, liên kết ester của triacylglycerol được thủy phân, những acid béo tự do chuyển thành acid béo với methyl ester (FAMEs, hình 5.1c), và FAMEs thì được phân tích bằng sắc kí khí

Những lipid không phân cực khác bao gồm sáp (chuỗi dài của alkane, rượu cao phân tử, và ester của acid béo và rượu cao phân tử), diacylglycerol, acid béo tự do, và sterol Trong mô động vật, cholesterol (hình 5.1d) là sterol nhiều nhất; và trong mô thực vật,

có vài loại sterol như (phytosterol, hình 5.1e) thường được tìm thấy Tỷ lệ chính xác của

Trang 3

những phytosterol này tùy thuộc vào loài cụ thể Sterol có thể tồn tại ở dạng hoặc với nhóm hydroxyl tự do (trong trường hợp này chúng thường được kết hợp trong những membrane sinh học cùng với phospholipid) hoặc như là ester, liên kết với những acid béo (trong trường hợp này chúng thường kết hợp với triacylglycerol) Ở thực vật, phần lớn sterol được tìm thấy dưới dạng glucoside, thường ở dạng liên kết với glucose Vitamin E (αqtocopherol, hình 5.1f và những đồng phân tocopherol khác) và carotenoid (hình 5.1g) là những là những thành phần của hầu hết các chất trích từ lipid.

Trang 4

Phospholipid (hình 5.2a) là những lipid cấu trúc chính của mô động và thực vật 5 loạichính của nhóm phospholipid được tìm thấy, mỗi loại chứa nhóm đầu phosphoryl riêng biệt, bao gồm phosphorylcholine, phosphorylethanolamine, phosphorylinositol,

phosphorylglycerol và phosphorylserine Phosphatidlycholine là một phospholipid với một nhóm đầu là phosphorylcholine Giống như triacylglycerol, phospholipid có một khung glycerol và mỗi nhóm phospholipid ( ví dụ như phosphatidylcholine) có thể bao gồm nhiều đơn vị phân tử khác nhau (sự kết hợp khác nhau của hai phân tử acid) Mặc dù phospholipid là lipid cấu trúc chính trong biomembrane, cholesterol và sterol thực vậtcũng bắt buộc phải có để ổn định cấu trúc membrane Những chất chính hợp thành

Trang 5

membrane là sphingomyelin (trong động vật, hình 5.2b), glycosphingolipid (trong cả thực và động vật, hình 5.2c) và galactolipid (chỉ ở thực vật, hình 5.2d).

II.PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU

Trong bài báo cáo này chủ yếu chỉ xét lipid ở dạng lỏng.Việc lấy mẫu lipid dạng rắn tương đối đơn giản hơn nên không trình bày ở đây

Lipid phần lớn ở dạng lỏng và chứa trong các loại bao bì khác nhau (có khi phải lấy mẫu trên đường ống vận chuyển)

Việc lấy lipid tuân theo 2 nguyên tắc chủ yếu:

 Lấy mẫu theo số lượng thùng chứa (khoảng 10q30% số lượng đơn vị)

 Trong mỗi thùng chứa căn cứ vào thể tích của nó mà định ra các điểm lấy mẫu tươngứng với độ cao và bề rộng của lớp chất lỏng

 Nếu lấy mẫu trên đường ống phải lấy theo từng thời điểm qui định trong suốt thời gian dầu chảy

 Các mẫu thu được trộn đều và rút gọn thành mẫu đem phân tích và mẫu lưu đối chiếu

Một số lưu ý khi bảo quản mẫu:

 Phải bảo quản trong điều kiện nghiêm ngặt để hạn chế sự oxihóa lipid

 Nên tiến hành phân tích trong khoảng thời gian cho phép

 Các chai lọ đựng mẫu phải khô sạch, sau khi cho dầu vào phải nút kín và bảo quản cẩn thận trong suốt quá trình phân tích

II PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA NHANH

Hầu hết các phương pháp kiểm tra nhanh đều là các phương pháp cảm quan.Thông qua việc xác định màu sắc, mùi vị, độ trong suốt giúp ta đánh giá sơ bộ về chất lượng của lipid trong mẫu

Ph ươ ng pháp so sánh với dung dịch iôt tiêu chuẩn

Đem dầu so sánh với dung dịch iôt tiêu chuẩn và biểu thị chỉ số màu bằng số mg iôt trong 100 ml dung dịch

Dụng cụ:

Bộ ống so màu đựng dung dịch iôt tiêu chuẩn đường kính trong của ống 10mmỐng thủy tinh không màu để đựng mẫu dầu đường kính trong của ống 10mm

Thuốc thử:

Iôt thăng hoa hai lần

KI (không chứa KIO3)

Dung dịch Na2S2O3 0,01N

Trang 6

Cách xác định :

Pha dung dịch iôt tiêu chuẩn: Cân 0,26q0,27g iôt thăng hoa 2 lần (độ chính xác 0,0002g) và 0,5g KI hòa tan trong nước cất rồi cho vào bình định mức 250ml, pha loãng đến vạch Dùng dung dịch Na2S2O3 0,01N để xác định nồng độ Từ kết quả chuẩn độ, dùng nước cất điều chỉnh nồng độ của dung dịch iôt cứ 10ml dung dịch có chứa 100g iot

Tiến hành pha chế thang màu bằng cách lấy ống thủy tinh không màu đường kính 10mm rồi căn cứ theo bảng sau để pha nước và dung dịch iôt tiêu chuẩn

Sau khi cho dung dịch iôt tiêu chuẩn và nước vào ống đem hàn kín lại và ghi số iôt trong 100ml lên nhãn của ống tức là chỉ số màu của các ống

Tiến hành so màu bằng cách đem dầu trộn đều và lọc cho vào ống so màu bằng thủytinh Ở nhiệt độ 20°C tiến hành so sánh với thang dung dịch iôt qua ánh sáng mặt trời hoặc ánh sáng phản xạ Kết quả so sánh ứng với các ống tiêu chuẩn được biểu thị bằng các chỉ số màu tương

Nếu không có điều kiện đun nóng (ví dụ xem xét tại kho hay bể chứa) có thể nhỏ ít giọt dầu vào tay, dùng hai bàn tay xoa mạnh và ngửi

Việc phán đoán các mùi dầu nói chung cần có nhiều kinh nghiệm, thông thường mùi hôi và cay là do dầu để lâu bị biến chất, mùi chua, mùi mốc là do dầu sản xuất từ nguyên liệu xấu, mùi khét là do quá trình gia công ép dầu bị quá lửa Dầu nành do có hàm lượng photpholipid cao nên thường có mùi gum (mùi tanh cá)

III PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU CƠ BẢN CỦA DẦU BÉO

1 Xác định tỷ trọng

Định nghĩa: Tỷ trọng của một chất là tỷ số giữa khối lượng riêng của chất ấy so với khối lượng riêng của nước cất có cùng một thể tích, ở cùng một nhiệt độ

Các phương pháp đo tỷ trọng:

a) Đo tỷ trọng bằng cân MO -Vesphal(Mohr_Wesphal)

Trang 7

Tiến hành thử : Để cân thăng bằng trên mặt phẳng bằng cách điều chỉnh bọt nước Đổ dầu vào ống đong và điều chỉnh nhiệt độ của dầu mỡ đến nhiệt độ qui định Thả phao (vừa dùng làm nhiệt kế) vào dầu, phao bị một sức đẩy ở phía dưới lên làm cho cân mất thăng bằng Điều chỉnh cân lại vị trí thăng bằng bằng cách treo các quả cân lên các vạch ở đòn cân Có 4 quả cân:

q Quả a và a’ cùng một trọng lượng, quả a khi cần thiết sẽ treo ở móc treo nhiệtkế, chỉ số nguyên; quả a’ treo ở các vạch khác, chỉ số lẻ thứ nhất

q Quả b trọng lượng bằng 1/10 trọng lượng của a, chỉ số lẻ thứ hai

q Quả c trọng lượng bằng 1/10 trọng lượng của b, chỉ số lẻ thứ ba

q Quả d trọng lượng bằng 1/10 trọng lượng của c, chỉ số lẻ thứ tư

Khi nhiệt lượng kế chỉ đúng nhiệt độ qui định, xác định vị trí thăng bằng và đọc kết quả

b) Đo trọng l ư ợng bằng bình đo tỷ trọng (picnomet)

Tiến hành thử: Rửa bình đo picnomet thật sạch bằng nước cất, tráng với cồn rồi với ete Để ete bay hơi hết và bình đã thật khô, cân bình không (theo nguyên tắc cân kép):

Bì = Bình không + Pg

Cho nước cất đã làm lạnh ở nhiệt độ cao hơn qui định và điều chỉnh thể tích bằng cách cho mức nước đến vạch đúng lúc nhiệt độ đến nhiệt độ qui định Cân

Bì = Bình có nước ở thể tích nhất định + P’g

Chú ý đừng để nước dính ở phía ngoài bình đo làm cho trọng lượng tăng lên và sai kết quả Đổ nước, tráng bằng cồn, rồi ete, để ete bay hơi hết và khi bình đo đã thật khô, chodầu vào bình đo đến thể tích qui định và nhiệt độ qui định Cân

Bì = Bình có dầu (cùng thể tích với nước) + P”g

Tính kết quả:

Tỷ trọng 20

20

d = (PqP’’)/(PqP’)

2 Xác định hàm l ư ợng n ư ớc và chất bốc h ơ i

Phương pháp tủ sấy dựa trên nguyên tắc tiến hành sấy dầu trong tủ sấy ở nhiệt độ

100 q105°C trong một thời gian vừa đủ Lượng nước và chất bốc hơi được xác định bởi sự giảm khối lượng của mẫu thử sau khi sấy Phương pháp này chỉ áp dụng cho các loại dầu mỡ không thuộc nhóm khô Các loại dầu khô như dầu chẩu và những dầu có chứa nhiều axit béo có tính bốc hơi (như dầu dừa) áp dụng phương pháp này sẽ làm cho kết quả bị sai lệch nhiều

Cách xác định: Cân 5g chất béo trong cốc đã biết khối lượng và đã sấy khô ở nhiệt độ 100q105 oC, cho cốc dầu vào tủ sấy trong 30 phút rồi cho vào bình hút ẩm để nguội đem cân

Tiến hành sấy lại vài lần nữa vào khoảng 30 phút đến khi sự chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân không quá 0,05% là được

w a

Trang 8

a_ khối lượng mất khi sấy (g)

w_khối lượng mẫu thử (g)

N_hàm lượng nước của dầu (%)

3 Xác định hàm l ư ợng tạp chất không tan trong dung môi

Đem hòa tan dầu mỡ bằng dung môi hữu cơ, phần còn lại không tan gọi là tạp chất (bao gồm chủ yếu là tạp chất cơ học và một số thành phần không tan) Dung môi thường dùng là ete etylic, ete dầu hỏa, cacbon disunfua (CS2)

Cách xác định: Cân 10q20g mẫu dầu cho vào 50ml dung môi để hòa tan Lọc hỗn hợp qua giấy lọc kép, tiếp tục dùng dung môi rửa lớp cặn trên giấy lọc cho đến khi trên giấy không còn vết chất béo Giấy lọc chứa cặn cho vào chén cân (chén và giấy lọc đã biết trước khối lượng) và sấy ở nhiệt độ 100q105°C cho đến khối lượng không đổi

T a b w100 %

a_khối lượng chén, giấy lọc và cặn sau khi sấy (g)

b_ khối lượng chén, giấy lọc (g)

w_khối lượng mẫu thư û(g)

T_hàm lượng tạp chất (%)

4 Xác định hàm l ư ợng chất không xà phòng hoá

Chất không xà phòng hoá bao gồm những thành phần trong dầu mỡ không tác dụng với kiềm khi xà phòng hoá và dựa vào tính tan trong dung môi của các chất không xà phòng hoá để phân tích xác định

Hoá chất cần thiết:

+Dung dịch KOH 2N pha trong cồn

Hỗn hợp ete thu được cho vào 1 phễu chiết, rửa bằng cồn 50 % cho hết xà phòng, sau đó thử với chỉ thị phenolphtalein không còn màu đỏ

Lọc hỗn hợp qua giấy lọc vào trong 1 bình cầu khác (sấy khô ở 100 – 105 oC đã biết khối lượng) trên giấy lọc có khoảng 1 – 2 g Na2SO4 khan , dùng ete rửa lớp Na2SO4

Trang 9

Cất loại ete , sau đó sấy ở nhiệt độ 100 – 105 oC đến khối lượng giữa 2 lần sấy không sai lệch quá 0,0002g

KX a b w100 %

KX q hàm lượng không xà phòng hoá (%)

aq khối lượng bình và mẫu (g)

bq khối lượng bình (g)

wq khối lượng mẫu thử (g)

Chú ý : Nếu trong khi chiết có hiện tượng nhũ tương hoá, có thể khắc phục bằng cách cho vào dung dịch vài giọt KOH 3 % hay tốt hơn là cho đioxan vào

5 Xác định hàm l ư ợng xà phòng còn lại trong dầu mỡ tinh luyện

a Ph ươ ng pháp định tính : Cho 50 ml nước cất vào bình nón dung tích 250 ml, đun sôi và cho vài giọt chỉ thị phênolphtalêin Sau khi để nguội, nước này cần không màu Tiếptục cho vào 10 ml dầu tinh luyện và đun sôi 5 – 10 phút, trong khi đun cần lắc đều Khi đunxong để bình lên 1 tờ giấy trắng hoặc đá men trắng, quan sát màu của lớp nước phía dưới, nếu lớp nước có màu hồng chứng tỏ trong dầu có lẫn xà phòng

b Ph ươ ng pháp định l ư ợng : Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự thủy phân của xà phòng trong điều kiện đun nóng với nước và dùng axit để chuẩn độ lượng bazơ sinh

ra trong quá trình thủy phân

RCOONa + H2O RCOOH + NaOH

+ Chỉ thị mêtyl đỏ 0,2 %

qCách xác định : Cân chính xác 10 g dầu tinh luyện cho vào bình nón đã sấy khô, thêm vào 5 ml cồn 95% và 30 ml ête, lắc cho tan đều; thêm vào 5 ml nước cất đun nóng ở 80°C, lắc kỹ sẽ tạo nên hỗn hợp vẩn đục; cho vào 2 giọt chỉ thị metyl đỏ Dùng ống nhỏ giọt vi lượng chứa dung dịch H2SO4 0,1 N và tiến hành chuẩn độ Trong khi chuẩn độ phải giữ nhiệt độ nóng, và sau mỗi giọt axit nhỏ xuống phải lắc mạnh rồi để lắng , quan sát màu củalớp nước ở dưới, tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch có màu đỏ nhạt

Tiến hành 1 thí nghiệm không mẫu trong điều kiện tương tự :

 

w

N V V

X 1 2  0,304100

X – hàm lượng xà phòng của dầu

V1 – số ml H2SO4 dùng chuẩn độ thí nghiệm (xác định nồng độ bằng natri ôlêat mẫu) V2 – số ml H2SO4 dùng chuẩn độ thí nghiệm không mẫu

N – nồng độ của H2SO4

Trang 10

Wq khối lượng mẫu thử tính bằng g

0,304q mg đương lượng của natri oleat

6 Xác định chỉ số acid

Chỉ số acid : là số mg KOH cần thiết để trung hoà hết lượng axit béo tự do có trong 1g dầu mỡ Chỉ số acid của dầu mỡ không cố định, dầu mỡ càng biến chất thì chỉ số acid càng cao.Các dầu mỡ thực phẩm chỉ số acid càng thấp càng tốt Từ chỉ số acid (acid value qAV) có thể tính ra phần trăm acid béo tự do, thường tính theo phần trăm acid ôleic:

% axit béo tự do = AV 0,503

Nguyên tắc : dựa vào phản ứng trung hoà giữa acid béo và kiềm trong môi trường hỗn hợp gồm rượu ethylic và ether ethylic:

RCOOH + KOH RCOOK + H2O

Hoá chất cần thiết :

+ dung dịch KOH 0,1 N trong cồn 96%

+ chỉ thị phênolphtalêin (C20H14O4) 1% trong cồn 96%

+ hỗn hợp dung môi gồm 1 thể tích ête êtylic và 3 thể tích cồn 95%

Dụng cụ & máy móc :

+buret 10 ml

+2 bình cầu 200ml

+ống đong 50ml

+nồi cách thủy

Cách xác định : cân chính xác 3q5g dầu mỡ (nếu chỉ số axit thấp có thể đến 10 g ) cho vào bình cầu 200ml, thêm 50 ml dung môi hỗn hợp , lắc đều (nếu chưa hoà tan có thể đun nhẹ trên nồi cách thủy đến khi hoà tan, lắc đều, làm nguội), cho 2 giọt chỉ thị phênolphtalêin rồichuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1 N trong cồn (dùng dung dịch KOH trong cồn để tránh xảy ra sự xà phòng hóa trong trường hợp hỗn hợp chứa 20% trở lên) cho đến khi dung dịchxuất hiện màu hồng tươi và màu không mất đi sau 30 giây (trường hợp chất béo có màu thẫm thì dùng chỉ thị tymolphtalein 1% trong cồn (dầu màu đỏ) chuẩn độ cho đến màu xanh hay ankaliblơ B0,75% (dầu màu thẫm) chuẩn độ cho đến màu hồng nhạt)

c

x b a

AV  5 , 611  

a : số ml dung dịch KOH 0,1N chuẩn độ ở bình thí nghiệm

b : số ml KOH 0,1N dùng chuẩn độ ở bình kiểm tra

c :số gam chất béo

5.611: số mg KOH trong 1 ml KOH 0,1N

hoặc dùng công thức :

c

f a

AV   5,61

Trang 11

Có thể biểu thị bằng độ axit, tức là số phần trăm axit béo tự do trong dầu mỡ tính theo 1 loại axit béo nào đó Thông thường người ta tính theo axit ôleic vì nó có nhiều trong hầu hết các loại dầu

Độ axit = % axit béo tự do = AV 0,503

7 Xác định chỉ số xà phòng hoá (ester value-EV)

Chỉ số xà phòng hoá :là số mg KOH cần thiết để trung hoà axit béo tự do và axit béo kết hợp (trong glyxerit) khi xà phòng hóa hoàn toàn 1g dầu mỡ Thông thường các dầu mỡ có chỉ số xà phòng hoá vào khoảng 170 – 260 Chỉ số xà phòng hóa đặc trưng cho tổng lượng axit béo có trong chất béo Chỉ số xà phòng hoá càng cao chứng tỏ trong dầu mỡ có chứa nhiều axit béo phân tử lượng thấp và ngược lại

Nguyên tắc : tiến hành xà phòng hoá 1 lượng dầu mỡ xác định bằng một lượng dungdịch kiềm dư, sau đó chuẩn độ lượng kiềm dư bằng axit và tính ra lượng kiềm đã xà phòng hoá dầu mỡ

Hóa chất cần thiết :

+ dung dịch KOH 0,5N trong cồn 96%

+ dung dịch HCl 0,5N trong nước

+ chỉ thị phênolphtalêin 1% trong cồn

Dụng cụ và máy móc :

+2 bình cầu 200ml với ống làm lạnh

Tính kết quả :

Trang 12

 

c

b a

EV   28,055

aq số ml HCl 0,5N dùng chuẩn độ ở bình kiểm tra

bq số ml HCl 0,5N dùng chuẩn độ ở bình thí nghiệm

cqkhối lượng mẫu thử tính bằng g

28,055 – số mg KOH trong 1 ml dung dịch KOH 0,5N

Trường hợp màu dầu thẫm thì dùng chất chỉ thị như trong khi xác định chỉ số axit

8 Xác định chỉ số iốt (iod value-IV)

Chỉ số iốt :là số gam iốt cần thiết bão hòa hết số liên kết đôi của axit béo có trong 1g dầu mỡ, nó biểu thị mức độ không no của dầu mỡ, chỉ số iốt càng cao thì mức độ không

no càng lớn và ngược lại Dựa vào chỉ số iốt người ta có thể phân dầu mỡ làm 3 loại:

Dầu khô : I > 130

Dầu bán khô : 85 < I < 130

Dầu không khô : I < 85

Các dầu mỡ thực phẩm thường nằm trong phạm vi nhóm dầu không khô và bán khô (tính khô của dầu mỡ thường biểu hiện khi tiếp xúc với không khí chúng có khả năng tạo thành màng khô có tính đàn hồi, dầu mỡ chứa càng nhiều axit béo không no càng dễ hoá khô Tính khô của dầu mỡ được ứng dụng nhiều trong kỹ nghệ sơn dầu.)

Nguyên tắc : Phương pháp này dựa trên nguyên tắc iôt kết hợp với axit béo ở các vị trí nối đôi Ở nhiệt độ thường, iôt phản ứng với các axit béo có trong thành phần của chất béo chậm, khi đun nóng thì iôt kết hợp với các nối đôi không đồng đều, không làm no đượchoàn toàn các nối đôi Các halogen khác (Cl2, Br2) phản ứng với axit béo rất mạnh, nên thay iôt bằng các hợp chất của nó với các halogen khác

C = C + I2 C_C hay C_C

(Br2)

I I Br Br Dùng KI để chuyển hóa Brôm dư thành iôt

+2 bình cầu dung tích 200q300ml có nút nhám

+2 cốc nhỏ đường kính 1q2 cm

Trang 13

Tiến hành: Cân vào lọ nhỏ 0,2g dầu hoặc 4g bơ hoặc mỡ Chuyển sang bình cầu dung tích 200q300ml có nút nhám Bình kiểm tra thay chất béo bằng 0,2ml nước cất Cho thêm 10ml clorofom vào mỗi bình, lắc nhẹ để hòa tan hết chất béo Cho thêm 15ml dung dịch Hanus, đậy kín bình ngay bằng nút nhám Lắc cẩn thận bình Để yên chỗ tối 15 phút (dầu có nhiều axit béo không no thì dđể lâu hơn) Thêm 15ml dung dịch KI 10%, 50ml nước cất Chuẩn độ iôt giải phóng ra bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến màu vàng rơm Thêm 1ml dung dịch hồ tinh bột 1%, 3ml clorofom Chuẩn độ tiếp cho đến khi dung dịch bị mất màu hoàn toàn Cho thêm clorofom vào để giải phóng iôt bị hấp thụ trên chất béo (khi chuẩn độ phải lắc mạnh) đồng thời làm thí nghiệm kiểm tra.

c

f a b

IV    0,01269100

aqsố ml dung dịch Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình kiểm tra

bq số ml dung dịch Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm

cqlượng chất béo (g)

fqhệ số điều chỉnh nồng độ Na2S2O3

100qhệ số qui chuẩn cho 100g chất béo

0,01269qsố g iôt tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,1N

9 Xác đinh chỉ số peroxyt (PoV)

Chỉ số peoxyt là số gam iôt được giải phóng ra khi dung dịch KI tác dụng với 100g chất béo nhờ tác dụng của peroxyt có trong chất béo

PoV là chỉ số chất lượng đặc trưng cho mức độ ôi hóa bằng oxi hóa

Nguyên lý: Ở môi trường axit, peoxyt giải phóng iôt từ muối kali iođua, ở nhiệt độ nóng hoặc lạnh Chuẩn độ iôt được giải phóng ra thể tự do bằng một dung dịch natri tiosunfat

+Dung dịch KI bão hòa (pha dùng ngay)

+Chỉ thị hồ tinh bột 1%

+Dung dịch Na2S2O3 O,01N (pha trước khi dùng từ dung dịch Na2S2O3 0.1N bằng nước cất đun sôi để nguội không chứa CO2)

Trang 14

Cách xác định: Lấy 2 bình nón dung tích 250ml Cho vào bình 1 (bình thí nghiệm) 2g dầu, bình 2 (bình kiểm tra) 2ml nước cất Cho thêm vào mỗi bình 10ml dung dịch hỗn hợp axit axetic và clorofom (tỉ lệ 2:1), 1ml dung dịch KI mới pha (hoặc một ít tinh thể KI), đậy nút Lắc hỗn hợp cẩn thận và đặt vào chỗ tối 10 phút Cho thêm 25ml nước cất Cho thêm 0,5ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ iôt tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi mất màu xanh.

Tính kết quả :

c

f b a PoV    0,01269100

aqsố ml dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ở bình thí nghiệm

bqsố ml dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ở bình kiểm tra

cqkhối lượng chất béo

0,01269qsố gam iôt tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,01N

IV.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG QUÁT PHÂN TÍCH LIPID

1 Phương pháp để xác định tổng lipid trong thực phẩm:

Chất béo tổng được biểu diễn là số gram chất béo trên 100 gram một khẩu phần nhỏ

thực phẩm hay trên một muỗng xúp Những số liệu này thì được xác định bằng cách thủy phân mẫu và phân tích những acid béo riêng lẻ (xem bên dưới)

Trang 15

Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định chất béo tổng được chấp nhận bởi các

cơ quan có thẩm quyền ở hầu hết các nước (Bảng 5.2) Các phương pháp cũ dùng dung môi để trích ly và đo tổng khối lượng bã lipid còn lại Ưu điểm của phương pháp này là có thể đồng thời trích ly nhiều mẫu trong cùng một trụ chiết

Để xác định chất béo tổng, ethyl ether (diethyl ether) là những dung môi được lựa

chọn vì nó không phân cực và trích ly được hầu hết các chất béo không phân cực: triacylglycerol, sterol, tocopherol,…; trong khí đó lại trích ly kém hiệu quả những chất béo phân cực: glycolipid và phospholipid…

Nguyên tắc của định lượng lipid tổng bằng phương pháp Soxhlet: dùng dung môi kỵ

nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được sấy khô, nghiền nhỏ Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan

Trang 16

trong chất béo, các chất mùi … tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp Do có lẫn tạp chất phần trích ly gọi là lipid tổng hay dầu thô.

Một số phương pháp khác được phát triển, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn để trích ly

và xác định chất béo tổng So với phương pháp trích ly bằng dung môi, trong hầu hết trường hợp, số liệu ở cả hai phương pháp thì gần giống như nhau

Phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân cũng được phát triển để định

lượng chất béo tổng của một số thực phẩm

Ngoài ra, phương pháp quang phổ cận hồng ngoại cũng được sử dụng như là một

phương pháp không phá vỡ cấu trúc để định lượng chất béo tổng Cả hai phương pháp này được dùng để xác định chính xác hàm lượng vì vậy đòi hỏi dụng cụ và thiết bị phải được đo đạc và chuẩn bị chính xác

2 Phương pháp để trích ly lipid tổng trong thực phẩm:

Quá trình trích ly lipid tổng trong thực phẩm khá đơn giản Tuy nhiên, do sự đa dạng của các cấu trúc sinh học, thực phẩm và lipid, đạt được sự trích ly chính xác là một việc khá khó khăn

Phương pháp trích ly được mô tả ở trên (dùng dung môi hữu cơ và CO2 siêu tới hạn) tỏ ra hữu hiệu trong việc trích ly triacylglycerol và những lipid không phân cực khác từ thực phẩm có hàm ẩm thấp Để trích ly lipid tổng (phân cực và không phân cưc), những dung môi phân cực được sử dụng làm chất trích ly (Bảng 5.3) Phương pháp để trích ly lipid tổng phổ biến nhất là phương pháp Folch (Bảng 5.3) Lipid được trích ly từ mẫu (1g) với 20ml chloroformqmethanol (2:1 theo thể tích) Sau khi trích ly, 1/5 thế tích nướchay dung dịch muối (0.29%) được thêm vào, hỗn hợp được khuấy và cân bằng Sau khi cân bằng, hai pha sẽ hình thành, lớp ở đáy bao gồm chloroformqmethanolqnước, 86:14:1,và gần như tất cả lipid Lớp ở trên bao gồm những dung môi giống như vậy theo tỉ lệ 3:48:47 và chứa hầu hết những chất không phải là lipid Phương pháp này thể hiện tốt nhất nếu tỉ lệ cuối cùng của 3 dung môi, chloroformqmethanolqnước, là 8:4:3

Phương pháp Bligh và Dyer được phát triển để trích ly lipid tổng từ cá nhưng nó đượctận dụng để trích ly lipid từ mô của nhiều động, thực vật Phương pháp này được tiến hành bằng cách lấy mô và mô được trích ly theo tỉ lệ 1:2:0.8, chloroformqmethanolqnướcnội sinh Sau khi trích ly hỗn hợp một pha, một phần chloroform và nước (0.08% KCl) được thêm vào và khuấy trộn, và sau khi cân bằng, lipid được lấy trong pha ít hơn.Bởi vì một vài mô thực vật chứa những enzyme phân giải lipid hoạt động, sự giảm sútlipid có thể giải quyết bằng cách ngâm mô thực vật trong isopropanol nóng trước khi trích ly bằng chloroform methanol.Gần đây, sự đa dạng của phương pháp này được phát triển, dùng để trích ly lượng mẫu lá lớn để phân tích lipid bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Bởi vì sự quan tâm về sức khoẻ, làm việc với chloroform,

Trang 17

phương pháp được phát triển để sử dụng những dung môi ít độc hại hơn như hexaneqisopropanol

3 Phương pháp để phân tách và phân tích định lượng lipid:

Phân tách lipid bắt buộc khi chuẩn bị mẫu cho phân tích chất béo Nó cũng cung cấpthông tin định lượng về thành phần cấu tạo của các lipid khác nhau Một vài phương pháp đơn giản được phát triển để tách lipid từ lipid tổng, sử dụng sắc kí cột (áp suất thấp) Christie mô tả phương pháp để tách những lipid không phân cực (hydrocarbons, cholesterol esters, triacylglycerols, cholesterol, diacylglycerols và monoacylglycerols) từ lipid trích ly bằng cách sử dụng cột silicic acid và tách rửa bằng dung môi haxane và diethyl ether từ 0 – 100% (bảng 5.4) Bảng bao gồm những chất béo tự do và hydroxyl và được phân tách bằng sắc kí cột áp suất thấp (LC), trích ly pha rắn (SE), sắc kí lớp mỏng (TLC) và sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Những phương pháp tương tự để phân tách chất béo phân cực và không phân cực có thể sử dụng chất hấp phụ như là Florisil hay DEAE cellulose

Trang 18

CE, cholesterol esters FS, free sterol PG, phosphatidylglycerol

Ch, cholesterol HC, hydrocarbons PL, phospholipids

CSE, cinnamic acid steryl esters MAG, monoacylglycerols SE, sterol esters

DAG, diacylglycerols MGDG, monogalactosyldiacylglycerol SG, sterol glycosidesDGDG, digalactosyldiacylglycerol PE, phosphatidylethanolamine TAG, triacylglycerolsFAMEs, fatty acid methyl esters PC, phosphatidylcholine

FFA, free fatty acids PI, phosphatidylinositol

Trang 20

Sắc kí lớp mỏng là một kỹ thuật phổ biến để tách các lipid khác nhau Hiện nay,

hầu hết các nhà phân tích sử dụng dĩa TLC được mạ lót vì sự thuận tiện và để tái sử dụng dễ dàng Mặc dù, trong tương lai, HPLC sẽ thay thế TLC, vài ưu điểm quan trọng của TLC bao gồm: thiết bị đơn giản và rẻ tiền; thuốc thử dạng phun được lựa chọn cungcấp thông tin về cấu trúc rất chính xác Phương pháp TLC thường dùng để tách những lipid phân cực và không phân cực được nêu ra ở bảng 5.4 Mặc dù hầu hết các nhà phântích sử dụng TLC một chiều nhưng đôi khi cũng cần thiết để sử dụng TLC hai chiều ( với hỗn hợp dung môi khác nhau cho mỗi chiều) để việc tách lipid hiệu quả hơn Tuy nhiên, ở một vài trường hợp, chúng ta cũng có thể tách cả lipid phân cực và không phâncực ở cùng một chiều bằng cách sử dụng hai bước kế nhau trong cùng một hướng, với hỗn hợp hai dung môi khác nhau

Phương pháp HPLC :dùng tia UV (bước sóng từ 205 – 210 nm) có thể phát hiện

những chất béo chưa bão hoà một cách hiệu quả Tuy nhiên, định lượng bằng đầu dò

UV thì rất khó khăn vì tín hiệu đáp lại của đầu dò thì tỉ lệ với tổng số liên kết đôi carbonqcarbon trong lipid Tương tự, đầu dò UV không thể phát hiện ra những chất béo bão hòa Trong những năm giữa thập niên 80 của thế kỉ XX, hai loại khác nhau của

“máy dò khối lượng” được phát minh, máy dò ion hóa ngọn lửa (FID) và máy dò ánh sáng tán xạ có khả năng làm bay hơi (ELSD) FID thì chỉ được sử dụng trong khoảng thời gian ngắn, các nhà sản xuất hiện tại đang tiếp tục hoàn thiện ELSDs và chúng đã trở thành một công cụ rất hữu hiệu trong việc phân tích lipid Một vài phương pháp HPLC_ELSD đã phát triển để phân tích định lượng lipid không phân cực (hình 5.3) và lipid phân cực (hình 5.4)

Mặc dù sắc kí khí (GC) thì không được sử dụng nhiều để phân tích các loại lipid, một vài phương pháp GC được phát triển để tách những lipid không phân cực (bảng 5.5) Hầu hết các phương pháp này sử dụng nhiệt độ rất cao, và một vài phương pháp đòi hỏi phải trimethyl hóa mẫu để giảm điểm sôi của lipid Vì hầu hết những phương pháp này thực hiện ở nhiệt độ rất cao, việc tiến hành phải cẩn thận để chắc chắn rằng lipid không bị giảm trong suốt quá trình phân tích

4 Phương pháp để thủy phân lipid mạch thẳng và phân tích định lượng acid béo và sterol:

Những chất béo phức tạp thường được phân tích bằng cách thủy phân liên kết ester với acid béo, và sau đó định lượng chúng với GC Việc thủy phân được tiến hành trong môi trường kiềm nhẹ (0.5 – 1.5 KOH trong methanol) Sau khi thủy phân, hỗn hợp được acid hóa để tạo thành acid béo Sau đó chúng được trích ly (được tách từ glycerol,muối, và những chất không lipid khác) bằng cách thêm hexane hay sử dụng những phương pháp trích ly lipid khác (ví dụ như trích ly theo phương pháp Bligh và Dyer) Phương pháp GC để phân tích chất béo thường bắt buộc phải chuyển acid béo tự do thành FAMEs

Nhiều phương pháp GC để phân tích FAMEs được trình bày trong bảng 5.5 Hỗn hợp đơn giản của FAMEs sẽ được tách trên cột không phân cực Hỗn hợp FAMEs chứahỗn hợp đa dạng những acid béo (bao gồm hỗn hợp FAMEs mạch ngắn, mạch rất dài hay chưa bão hòa) đòi hỏi phải sử dụng cột phân cực (ví dụ như CPqSil 88, BPX 70, SPq2340) để tách tốt nhất Một vài cột GC phân cực cũng có thể tách đồng phân cis và

Tiêu đề	Kiến thức về lipid
Tác giả	Lê Ngọc Tú, W. W. Christie
Trường học	Trường Đại Học
Chuyên ngành	Sinh học
Thể loại	bài viết

Định dạng
Số trang	41
Dung lượng	907,5 KB

Kiến thức về Lipid

Phương pháp bạc nitrate (silver nitrate method)

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC)