Cắt, chia phôi bò doc

bình thường khi cắt đôi thai 50% bê con 3 Quá trình phát triển * Tạo sinh đôi từ một trứng Để có nhiều con cho một thế hệ của mỗi phôi, người ta sử dụng cắt phôi để có được những con v

Cắt, chia phôi bò

1 Khái niệm

Cắt, chia phôi (vi phẫu thuật phôi) là sử dụng kỹ thuật nhằm di chuyển nhóm tế bào phôi nằm phía trong màng trong suốt Nhờ đó có thể chia nhóm tế bào này làm đôi hoặc ghép các nhân hay cấu trúc nhân của các

tế bào phôi khác nhau lại với nhau

Sau đây, chúng tôi chỉ đề cập đến một vấn đề là cắt (chia phôi) làm đôi (dùng kỹ thuật để chia một phôi ban đầu thành hai phôi) Đây cũng là bước đơn giản đầu tiên của quá trình nhân phôi vô tính

2 Mục đích

- Tăng số lượng phôi: từ một phôi ban đầu giúp người chăn nuôi có nhiều bê hơn, đặc biệt những bê giống nhau Những bê giống nhau về di truyền đã giúp cho việc đánh giá chính xác kiểu di truyền trong cùng một điều kiện ngoại cảnh hoặc một yếu tố nào đấy của điều kiện ngoại cảnh ảnh

hưởng đến năng suất hay kiểu hình của vật nuôi Một cặp sinh đôi cùng trứng có giá trị bằng cả nhóm đối chứng 10-25 (hoặc nhiều hơn) các bê bình thường khác (Hancock, 1954)

- Cắt phôi giúp cho việc xác định giới tính của phôi

- Cắt phôi giúp cho việc tăng tỷ lệ bò sinh đôi, hạn chế hiện tượng freematin (đực, cái) thường gặp khi sinh đôi ở 2 phôi thuộc 2 trứng khác nhau

-Cắt phôi tạo điều kiện và giúp các nghiên cứu khác phát triển Sơ đồ dưới đây minh họa một phần lợi ích của việc cắt phôi

100

phôi bình

thường

y chuyển

lệ đậu thai 65%

Sinh ra

65

?bê con

10

0 phôi

200 phôi sau

Cấ

y chuyển

T

ỷ lệ đậu

Sin

h ra 100

bình

thường

khi cắt đôi

thai 50%

bê con

3 Quá trình phát triển

* Tạo sinh đôi từ một trứng

Để có nhiều con cho một thế hệ của mỗi phôi, người ta sử dụng cắt phôi để có được những con vật hoàn toàn giống nhau về mặt di truyền, có thể tiến hành nghiên cứu sinh lý của chúng, mặt khác cũng để khắc phục hiện tượng vô sinh ở bò và tăng cường khả năng sức sinh sản ở con cái

Nghiên cứu đầu tiên do Moor và cs (1968) tiến hành nhưng không

thành công Đến 1979, những cặp đẻ sinh đôi (do Willadsen cắt phôi) mới ra đời Theo ông (1980), có được những cặp đẻ sinh đôi là do kết quả cắt phôi

ở giai đoạn đầu (2-4 và 8 tế bào)

Để thu được phôi sớm: sau rụng trứng 5 ngày phải thu phôi (phương pháp giải phẫu) trước khi phôi chuyển tới sừng tử cung Sau đó vi phẫu phôi

để lấy ra các tế bào phôi sớm và đưa các tế bào này vào trong các màng trong suốt mới và kín Tất cả được bảo vệ bằng màng a-ga để tránh thất thoát

tế bào và tạo điều kiện dễ dàng cho việc kiểm soát Sau đó những phôi cắt được cấy vào một con vật nhận trung gian (ống dẫn trứng của cừu cái giả chửa) trong 4 ngày Phôi tiếp tục phát triển trong môi trường tử cung của con vật sống đến khi trở thành phôi nang Sau đó thu hoạch các phôi trên và cấy truyền cho những con bò nhận, bò sẽ có chửa và đẻ con bình thường

Willadsen (1981) cắt đôi những phôi có 8 tế bào Những phôi có 4 tế bào này được nuôi cấy trên con vật 4 ngày, kết quả 77% số nửa phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang, và 63% cấy phôi có chửa

Ozil (1982) đề nghị phương pháp mới như phương pháp của Willadsen nhưng phôi được cắt ở giai đoạn 6-8 ngày tuổi

Cắt phôi được? thực hiện trên một mặt phẳng đứng bằng một lưỡi dao

vi phẫu không cần phải đưa số tế bào phôi ra khỏi màng trong suốt và sau đó đưa phôi mới được cắt vào trong môi trường nuôi phôi trong khoảng thời gian ngắn, sau đó cấy cho con cái nhận không cần thiết phải qua con vật cấy

ở giai đoạn trung gian Kỹ thuật này cũng loại trừ được việc thu hoạch phôi bằng phương pháp giải phẫu Kết quả cấy truyền phôi giải phẫu đạt 68% có chửa và có trên 100% bê ra đời so với số cái được cấy phôi (bảng 1)

Theo Ozil (1983), việc cấy 1/2 phôi / một cái nhận, đạt kết quả có chửa thấp hơn là cấy cả hai nửa phôi

Kết quả của Heyman (1985): sau khi cấy 1/2 phôi (hay cả hai nửa phôi) và có so sánh với phôi tươi hay phôi đông lạnh, nhận thấy tỷ lệ có chửa là 36,3% trong trường hợp cấy 1/2 phôi, còn có chửa 68,7% khi cấy cả hai nửa phôi

Gần đây, Heyman et al (1987) đã chứng minh ảnh hưởng dương tính

đến tế bào của phôi (4 ngày được nuôi trong môi trường nuôi cấy)

Bảng 1.? Sự phát triển của hai nửa phôi được cắt ở ngày thứ 6,? 7 và

8 sau khi cấy truyền cho bò nhận phôi

cộng

Số bò nhận phôi được cấy

hai nửa phôi

Số bò có chửa (% ở 45

ngày)

5 (71,4)

4 (57,1)

8 (72,74)

17 (68)

(58,8)

Bảng 2.? Kết quả cấy 1/2 phôi sau khi cắt ở bò

Phôi cấy Cái

nhận

Chửa 21 ngày

Chửa 90 ngày

Số phôi sống

Đông

lạnh

(50,0%)

4?

(20,0%)

4/20? (20%)

Tươi 11 6?

(54,5%)

4 (32,3%)

4/11? (36,3%)

Đông

lạnh

(66,6%)

17?

(47,2%)

17/36? (47,2%)

(71,0%)

26?

(57,7%)

26/45? (37,7%)

Đông

lạnh

(77,2%)

14?

(63,6%)

21/44? (47,7%)

(79,1%)

33?

(68,7%)

47/96? (38,9%)

Về khả năng đông lạnh các phôi đã được cắt đôi: nhiều nhà khoa học

(Lehn-Jensen và Rall, 1983; Kicard et al., 1984; Nicmann et al.; 1986; Chesne et al., 1978; Takeda et al., 1987) đã nghiên cứu và đã có những ý

kiến khác nhau về những bước chuẩn bị đông lạnh các nửa phôi (đưa về vị trí màng trong suốt, bao vây bằng a-ga ) và đều cho rằng tất cả những phôi

không nguyên vẹn đều cho kết quả kém, cần tiếp tục nghiên cứu thêm ở lĩnh vực này

Ngày nay cắt phôi và sử dụng các phôi cắt đã trở thành công việc bình thường ở các nước chăn nuôi? phát triển, đặc biệt ở các nước áp dụng công nghệ phôi trong chăn nuôi bò sữa hoặc bò thịt

4 Một số nhân tố ảnh hưởng

4.1 Tuổi và chất lượng phôi

Tuổi phôi liên quan đến tỷ lệ sống sau khi cắt, và như vậy, liên quan đến tỷ lệ có chửa sau khi cấy Tỷ lệ bò có chửa sau khi cấy phôi cắt tăng từ 33% ở phôi ngày thứ 6 đến 57% ở phôi ngày thứ 8 (Williams, 1984) Một số nghiên cứu khác cho rằng tuổi phôi càng cao (nhưng không vượt quá 10 ngày), tỷ lệ có chửa sau khi cấy ở phôi được cắt càng lớn

Theo nhiều tác giả, phôi ở giai đoạn 5,? 6,? 7 ngày sau khi thụ tinh là tốt nhất cho việc cắt phôi Cắt phôi ở giai đoạn phôi dâu già (cuối của phôi dâu) hoặc đầu phôi nang, khi khối tế bào đủ lớn và tế bào chưa biệt hoá, sẽ cho kết quả cao hơn Tất nhiên phôi phải từ loại B (tốt) trở lên, tốt nhất phôi loại A (rất tốt), không sử dụng phôi loại C (trung bình) để cắt Khi cắt phôi ở giai đoạn phôi dâu, chỉ việc chia 2 khối mầm phôi Khi cắt chia phôi ở giai

đoạn phôi nang, cần chú ý: ngoài phân chia mầm phôi, phần lá nuôi (trophoblast) cũng chia 2 Khi cắt phôi ở giai đoạn muộn hơn, tế bào phôi đã biệt hoá hình thành các lá phôi, xác suất cho một cơ thể trọn vẹn khó được bảo đảm, vì vậy phôi đã ngoài 10 ngày tuổi không sử dụng để cắt, chia

4.2 ảnh hưởng của màng trong suốt? (Zona pellucida, ZP)

ZP ở động vật có vú có cấu trúc dịch protein bao quanh trứng Chức năng của ZP: bảo vệ phôi chống lại sự va chạm của môi trường, kiểm soát áp suất thẩm thấu và trao đổi dinh dưỡng giữa môi trường và phôi Các thao tác cắt phôi được tiến hành trong phòng thí nghiệm bằng vi phẫu thuật không làm tổn thương đến các tế bào bên trong và bảo vệ cho ZP không bị vỡ

Một chức năng khác của ZP là giữ cho các tế bào phôi trong quá trình phân chia ở giai đoạn đầu tập trung với nhau, làm cho khối tế bào phôi có sự liên kết chặt chẽ Sự liên kết đó cho phép phân biệt giữa nhóm tế bào ở trong cùng với khối tế bà ở ngoài Nếu vị trí của các tế bào không xảy ra như vậy, không có sự khác nhau trong các giai đoạn, phôi có thể không sống được (Seidel, 1982)

Nếu phôi trong thời kỳ đầu tiên không có ZP, nhóm tế bào hình que dính với nhóm tế bào nang lông ở ống dẫn trứng, làm cho phôi không phát

triển (Modlinski, 1970) vì khả năng phát triển của phôi sau khi cấy truyền phụ thuộc rất nhiều vào sự hoàn hảo của ZP

Ozil (1983) và Seidel (1983) cho rằng những phôi có tuổi cao (hơn 6 ngày) không đòi hỏi có ZP, những phôi lúc đó có khả năng hoạt động như những đơn vị sinh học của những tế bào cá thể Nếu tiến hành nghiên cứu phôi trước giai đoạn các tế bào liên kết, cần phải để các mảnh tế bào phôi trong ZP, hay được bao quanh bằng thạch a-ga Trong khi đó, nếu chúng ta

sử dụng những phôi có tuổi lớn đã có sự liên kết thì không cần thiết Theo nhiều tác gia, ZP bao quanh trứng và phôi ở động vật có vú đóng một vai trò như hàng rào bảo vệ chống lại sự xâm nhập của các virus (Bowen, 1979;

Willadsen, 1979-1980; Ozil et al., 1982; Seidel, 1982; Lambeth et al., 1983;

Ozil, 1983; Srenan, 1983; Baker, 1985)

Theo Elizabeth Singh et al (1982, 1983, 1987), virus gây bệnh lưỡi

xanh (BTV) và virus gây bệnh ỉa chảy cho bò (BVDV) không phân lập được khi nuôi cấy phôi của những bò cho phôi có huyết thanh dương tính với những virus trên trong thời gian 24-28 giờ Ông kết luận rằng virus không có khả năng đi qua ZP

Theo Voelkel et al (1983), vi khuẩn gây sẩy thai truyền nhiễm không

gây bệnh cho bò nhận phôi khi cấy truyền phôi ở bò bị nhiễm bệnh Nhiều

nghiên cứu cho thấy tầm quan trọng của ZP với giai đoạn phát triển của phôi

bò (Trounson et al., 1976; Willadsen, 1980; Lehn - Jensen, 1983; de Armas,

1985)

Theo Lehn-Jensen và Willadsen (1983), kết quả đông lạnh sẽ tốt hơn đối với các phôi đã được cắt hai hay bốn, nếu sử dụng phôi 6-7 ngày còn nguyên vẹn ZP và được bao bọc bằng a-ga trước khi cho đông lạnh

4.3 ảnh hưởng của việc nuôi cấy sau khi cắt

Mục đích của việc nuôi cấy sau khi phôi bị cắt là giúp phôi nhanh ổn định và bình phục lại vết cắt Việc nuôi cấy các nửa phôi sau khi cắt là cần thiết nhưng không nên quá 2-3 giờ sau khi cắt (Norio Saito, 1994) hoặc

không quá 10 giờ (Vlahov và cs., 1987) Tỷ lệ có chửa sau khi cấy sẽ giảm

đi cùng với sự tăng lên của thời gian nuôi cấy sau khi cắt? ở ngoài? cơ thể

(Armas và cs., 1992) Các công trình nghiên cứu gần đây đều thống nhất

rằng: Nếu dung dịch nuôi cấy được bổ sung một số tế bào tử cung hoặc tế bào và dịch phân tiết của ống dẫn trứng, tỷ lệ có chửa của nửa phôi sẽ tăng lên

4.4 ảnh hưởng của sự đồng pha và số lượng thể vàng giữa bò cho và

bò nhận

Sau khi cấy các nửa phôi, không thấy có sự khác nhau về tỷ lệ có chửa

ở bò nhận có trạng thái sinh lý sinh dục khác tuổi phôi từ -1 ngày đến +1 ngày, nghĩa là bò nhận động dục sau hoặc trước 1 ngày hoặc động dục đồng tuổi với bò cho phôi (Szell và Hudson, 1991) Tuy nhiên Maurer (1988) lại thu được tỷ lệ có chửa ở bò nhận phôi động dục sau 1 ngày cao hơn bò nhận phôi động dục trước 1 ngày

Cũng như phôi nguyên vẹn, tỷ lệ có chửa sau khi cấy sẽ cao nếu thể vàng bò nhận phôi phát triển và hoạt động tốt Szell và Hudson (1991) đã thu được tỷ lệ có chửa cao hơn, tỷ lệ sinh đôi cao hơn ở các nửa phôi được cấy vào tử cung bò mẹ có hai thể vàng trở lên so với những bò nhận chỉ có 1 thể vàng Điều này có lẽ liên quan đến hàm lượng cao hơn của progesteron trong máu ở các bò có nhiều thể vàng hơn, hoặc do hoạt động phân tiết progesteron cao hơn của thể vàng

Ngoài các nhân tố chính kể trên, tỷ lệ có chửa của phôi sau khi cắt còn chịu sự chi phối của một loạt yếu tố khác như: Thời tiết, khí hậu, vị trí cấy phôi, vệ sinh các dụng cụ và môi trường, thao tác kỹ thuật, dung dịch nuôi cấy, v.v

5 Dụng cụ và hoá chất

5.1 Dụng cụ

ă Kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 100-300 lần

ă Hệ thống điều khiển vi thao tác gồm hệ thống điều khiển dao cắt,

hệ thống này được gắn kết hợp với kính hiển vi

ă Các loại ống hút, xơ-ranh, các loại đĩa petri kích thước khác nhau

ă Các micropipet để hút phôi và các cọng rạ khác nhau

5.2 Dung dịch, hoá chất

ã?? Dung dịch để cắt phôi (Bisection medium), theo Her và Reed (1991), là dung dịch Dulbecco?s Modified PBS có bổ sung 0,2M sucrose không có huyết thanh thai bê hoặc BSA (Bovine Serum Albumin)

ã?? ?Dung dịch nuôi cấy phôi sau khi phôi đã cắt, các dung dịch đó là:

+ Han?sF10 + 10-20% FCS

+ TCM 199 + 5% FCS

+ Cr1aa + 5% FCS

+ Whitten?s medium + 20% FCS (Lucas-Hahn và Nieman, 1991)

Hướng sử dụng khác nhau của phôi sau khi cắt

1- Phôi chưa cắt 5- Cấy nửa phôi đông

lạnh

2- Phôi sau khi cắt 6- Phôi bị loại thải

3- Có thể cấy chuyển hoặc

nuôi cấy phục vụ

7- Nuôi cấy, tiến hành chia cắt lặp lại

4- Đem đông lạnh