Tóm tắt nghiên cứu, thiết kế, chế tạo chip vi lỏng có gắn cảm biến dựa trên công nghệ mems và hạt nano siêu thuận từ Định hướng Ứng dụng trong lĩnh vực y sinh

Tóm tắt nghiên cứu, thiết kế, chế tạo chip vi lỏng có gắn cảm biến dựa trên công nghệ mems và hạt nano siêu thuận từ Định hướng Ứng dụng trong lĩnh vực y sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ - -

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Bùi Thanh Tùng

2 GS.TS Chử Đức Trình

Phản biện: 1 TS Phan Thanh Hòa

Phản biện: 2 PGS.TS Trương Thị Ngọc Liên

Phản biện: 3 TS Nguyễn Thị Thủy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia

chấm luận án tiến sĩ họp tại Trường Đại học Công nghệ, ĐHQGHN

vào hồi 09 giờ 00’ ngày 10 tháng 12 năm 2024

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

Lý do lựa chọn đề tài

Việc định lượng tế bào chỉ dấu đóng vai trò quan trọng trong đánh giá tình trạng bệnh và nâng cao hiệu quả điều trị Ví dụ, trong xét nghiệm HIV, cần xác định số lượng tế bào T-CD4 và T-CD8 trong một đơn vị thể tích máu để đánh giá sức khỏe bệnh nhân và xây dựng phác đồ điều trị phù hợp Hiện nay, có hai phương pháp chính để định lượng tế bào miễn dịch T-CD4:

(1) Đếm thủ công bằng kính hiển vi: Phương pháp này sử dụng hạt từ

gắn với kháng thể anti-CD4 để loại bỏ tế bào mono và tách tế bào CD4 ra khỏi mẫu, sau đó tiến hành đếm thủ công dưới kính hiển vi Tuy chi phí thấp, phương pháp này mất nhiều thời gian và chỉ xử lý được lượng mẫu nhỏ

T-(2) Đếm tế bào bằng phương pháp dòng chảy (flow cytometry):

Phương pháp này phân tích nhanh và chính xác các đặc điểm tế bào với tốc độ từ vài trăm đến vài nghìn tế bào mỗi giây Hạt từ được nhuộm huỳnh quang và gắn kháng thể anti-CD4 để nhận diện T-CD4 thông qua hệ thống quang học Tuy nhiên, đây là kỹ thuật tiêu chuẩn đòi hỏi thiết bị phức tạp, đắt tiền và chi phí lớn cho cả nhuộm huỳnh quang lẫn chuẩn bị mẫu

Gần đây, nhiều nghiên cứu về chip vi lỏng kết hợp cảm biến sinh học

đã được thực hiện để phát hiện các đối tượng sinh học Điển hình là nghiên cứu của nhóm tại Bệnh viện Tổng hợp Massachusetts và Đại học Y Harvard, với mục tiêu đếm tế bào T-CD4 nhằm giám sát HIV trong điều kiện cơ sở hạn chế Hệ thống này sử dụng chip vi lỏng để di chuyển mẫu đến vị trí cố định, nơi tế bào T-CD4 được bắt giữ bằng kháng thể đặc hiệu

Hệ thống CCD và thuật toán phân tích hình ảnh được dùng để xác định số lượng tế bào Phương pháp này thay thế hệ thống quang học bằng cảm biến hình ảnh và phần mềm nhận dạng, tương tự flow cytometry, nhưng thiết bị vẫn cồng kềnh và độ chính xác phụ thuộc vào phần mềm nhận dạng Ngoài ra, các chip sinh học (Biochip) chỉ dùng một lần

Tại Việt Nam, nghiên cứu về chip vi lỏng và biochip trong phân tích sinh học phân tử đang phát triển Tiêu biểu, nhóm tại Đại học Công nghệ

- ĐHQGHN đã đề xuất chip vi lỏng kết hợp cảm biến dựa trên thay đổi điện dung không tiếp xúc để phát hiện tế bào sống trong dòng chảy liên tục Phương pháp này có chi phí thấp, dùng ít mẫu và phát hiện chính xác, đánh dấu bước tiến trong ứng dụng công nghệ chip vi lỏng vào phân tích

y sinh Ngoài ra, nhóm ICDREC tại Đại học Quốc gia TP.HCM đã nghiên cứu cảm biến sinh học dựa trên vi cân tinh thạch anh để phát hiện dư lượng sinh học trong hải sản, ma túy, và vi khuẩn E coli O157-H7 Những kết quả này cho thấy tiềm năng của chip vi lỏng và cảm biến sinh học trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Như các phương pháp đã đề cập ở trên, để định lượng các đối tượng sinh học như tế bào, trước tiên cần phải tách lọc hoặc đánh dấu chúng Sử dụng hạt từ tính để tách và làm giàu tế bào là phương pháp phổ biến hiện nay Sau khi tách ra khỏi mẫu, các hạt từ vẫn bám trên tế bào và nó trở thành dấu hiệu để nhận diện tế bào trong mẫu Khai thác đặc điểm này, chip vi lỏng kết hợp cảm biến từ tính được phát triển nhằm phát hiện tế bào thông qua hạt nano siêu thuận từ bám trên tế bào Phương pháp này tận dụng lại hạt nano đã sử dụng trong quy trình tách lọc, giúp giảm chi phí, công đoạn và thời gian định lượng tế bào Ưu điểm của cảm biến từ tính là không bị ảnh hưởng bởi tạp chất phi từ Tuy nhiên, thách thức lớn nằm ở việc xử lý tín hiệu nhỏ và nhiễu điện từ Bên cạnh đó, tín hiệu từ các hạt nano siêu thuận từ rất nhỏ, làm cho việc phát hiện trở nên khó khăn Vì vậy, nghiên cứu phát triển chip vi lỏng và hệ đo vi lưu sử dụng cảm biến từ tính được chế tạo bằng công nghệ MEMS (Micro-Electro-Mechanical Systems - hệ thống vi cơ điện tử) để phát hiện hạt nano siêu thuận từ trong dòng chảy liên tục, làm nền tảng cho các hệ phân tích sinh học phân tử, là chủ đề nghiên cứu luận án này

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

Mục tiêu của luận án là nghiên cứu, phát triển được một hệ đo vi lưu siêu nhạy từ để xác định nồng độ các hạt nano siêu thuận từ (SPMNPs) trong dòng chảy liên tục của chip vi lỏng, định hướng phát triển hệ phân

tích định lượng tế bào được đánh dấu bằng SPMNPs trong dòng chảy liên tục

Mục tiêu cụ thể của luận án:

Về mặt lý thuyết, luận án cần nghiên cứu, đề xuất được mô hình hệ đo

vi lưu từ tính có độ nhạy cao để định lượng nồng độ SPMNPs trong dòng chảy liên tục

Về mặt thực nghiệm, luận án cần nghiên cứu thiết kế, chế tạo được một

hệ đo nồng độ SPMNPs được chức năng hóa sinh học (dùng trong tách lọc

tế bào), trong điều kiện dòng chảy liên tục với nồng độ rất thấp làm nền tảng cho việc phát triển các hệ phân tích y sinh Cụ thể, hệ đo vi lưu cần đáp ứng yêu cầu sau: (1) chip vi lỏng với cảm biến từ tính gắn trên kênh

vi lỏng ở vị trí được tính toán tối ưu trong từ trường để đo được tín hiệu của dòng hạt nano siêu thuận từ; (2) nguồn phát từ trường ổn định, có khả năng điều khiển được cường độ từ trường, tần số và hướng theo yêu cầu của mô hình đề xuất để từ hóa hạt nano siêu thuận từ với từ trường xoay chiều đồng thời phát từ trường tĩnh, định thiên cho cảm biến ở chế độ làm việc; (3) mạch xử lý tín hiệu có khả năng phát hiện tín hiệu rất nhỏ từ ngõ

ra của cảm biến do dòng hạt nano siêu thuận từ gây ra; (4) tích hợp hệ thống thành một hệ đo vi lưu hoàn chỉnh để phân tích định lượng hạt nano siêu thuận từ trong dòng chất lỏng chảy liên tục; (5) thử nghiệm thành công mô hình đề xuất để phát hiện một số loại hạt nano siêu thuận từ được chế tạo trong phòng thí nghiệm và hạt nano thương mại được chức năng hóa sinh học trong các điều kiện thực nghiệm khác nhau Từ đó, xác định các điều kiện thực nghiệm tối ưu cho các thí nghiệm phát hiện tế bào bằng hệ đo được

đề xuất

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án:

− Đối tượng nghiên cứu: chip vi lỏng, cảm biến từ, hệ đo vi lưu, mạch

xử lý tín hiệu, hạt nano siêu thuận từ được chức năng hóa sinh học

− Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu phát triển hệ đo vi lưu siêu nhạy từ

để phân tích định lượng nồng độ hạt nano siêu thuận từ được chức năng hóa sinh học trong dòng chảy liên tục của chip vi lỏng, định hướng phát triển các hệ phân tích định lượng tế bào

Chế tạo thành công hệ đo vi lưu đề xuất với chip vi lỏng được chế tạo bằng công nghệ in 3D trên vật liệu công nghiệp Việc sử dụng công nghệ

in 3D để chế tạo chip vi lỏng đề xuất trong luận án có tính mới; mô hình toán học được áp dụng vào việc tìm ra các thông số tối ưu cho chip vi lỏng mang tính khoa học, đáp ứng thực tiễn tốt và có giá trị tham khảo; kỹ thuật

xử lý tín hiệu phù hợp với đặc tính vật lý của cảm biến giúp giới hạn phát hiện tín hiệu của hệ đo vi lưu siêu nhạy từ được giảm xuống 3,81 nT tương ứng với nồng độ 12,5 µg/mL hạt nano siêu thuận từ, tốt hơn các kết quả nghiên cứu của các công trình trước đây

Kết quả nghiên cứu của luận án tạo nền tảng cho việc phát triển các hệ thống phân tích định lượng các đối tượng sinh học như tế bào, protein, giảm chi phí xét nghiệm nhờ hạn chế việc sử dụng các thiết bị và hoạt chất đánh dấu có chi phí cao Đã làm chủ được quy trình và công nghệ chế tạo trong phòng thí nghiệm, hướng tới phát triển và nội địa hóa các thiết bị phân tích trong y sinh.

Phương pháp nghiên cứu của luận án

Luận án kết hợp các phương pháp nghiên cứu lý thuyết, mô hình toán học, mô phỏng, đo đạc, kiểm chứng bằng thực nghiệm, cụ thể:

− Dựa trên các cơ sở lý thuyết về cơ học, sinh học và vật lý, luận án đề xuất mô hình hệ đo vi lưu với chip vi lỏng được tính toán thông qua

mô hình toán học để tìm ra các thông số tối ưu

− Phương pháp mô phỏng được sử dụng cho các thiết kế hệ phát từ trường và mạch điện tử

− Phương pháp thực nghiệm được áp dụng để đo đạc, đánh giá tối ưu cảm biến, chế tạo chip vi lỏng, mạch điện tử và toàn bộ hệ đo từ trường

Phương pháp thực nghiệm cũng được áp dụng để kiểm chứng các kết quả tính toán trong chip vi lỏng

Bố cục của luận án:

Bố cục của luận án gồm 4 chương và 5 phụ lục, được trình bày tóm tắt như sau:

Chương 1 nêu tầm quan trọng của tế bào và việc định lượng tế bào

trong chẩn đoán y sinh Sau khi phân tích các phương pháp định lượng, luận án chọn sử dụng cảm biến từ tính để phát hiện hạt nano siêu thuận từ trong dòng chảy liên tục, nhận biết tế bào qua hạt nano bám trên bề mặt trong quá trình tách lọc Các cấu trúc và nguyên lý hoạt động của cảm biến từ tính được phân tích cụ thể Cuối cùng, cảm biến hiệu ứng từ điện trở khổng lồ được chọn để phát triển chip vi lỏng đáp ứng mục tiêu nghiên cứu, làm nền tảng cho thiết kế hệ thống ở Chương 2 và thực nghiệm chế tạo ở Chương 3

Chương 2trình bày quá trình nghiên cứu và tính toán lý thuyết để xây dựng mô hình hệ thống phát hiện hạt nano siêu thuận từ trong dòng chảy liên tục, làm nền tảng phát triển hệ phân tích tế bào Nội dung bao gồm phân tích cơ chế tách lọc tế bào và nguyên lý phát hiện hạt nano trên

bề mặt cảm biến, được tính toán để xây dựng mô hình phù hợp Phương pháp toán học được áp dụng để xác định độ lớn từ trường cảm ứng, tối ưu hóa thiết kế chip vi lỏng nhằm đạt giá trị cực đại của từ trường Các thông

số này sẽ được sử dụng trong thiết kế và chế tạo chip vi lỏng ở Chương 3, đồng thời giúp đánh giá sai số chế tạo trong Chương 4 Cuối chương, mô hình hệ đo nồng độ hạt nano siêu thuận từ trong dòng chảy liên tục được

đề xuất, tạo tiền đề cho các thiết kế và chế tạo chi tiết trong Chương 3

Chương 3 trình bày quá trình tính toán, mô phỏng, thiết kế và chế

tạo các thành phần của hệ đo nồng độ hạt nano siêu thuận từ trong dòng chảy liên tục, dựa trên mô hình đề xuất ở Chương 2 Các thông số của

từng thành phần được tối ưu hóa nhằm thu nhận tín hiệu hiệu quả khi hạt nano dịch chuyển trong kênh vi lỏng Kết quả đo đạc và đánh giá đặc tính

kỹ thuật của các thành phần bằng thiết bị tiêu chuẩn được trình bày, làm

cơ sở thiết lập điều kiện thực nghiệm ở Chương 4 Kết quả đo thực nghiệm cũng được so sánh với tính toán lý thuyết để xác định sai số chế tạo Các thành phần sau đó được tích hợp thành hệ thống hoàn chỉnh, chuẩn bị cho các thử nghiệm đo nồng độ hạt nano siêu thuận từ trong Chương 4

Chương 4 trình bày các thực nghiệm đánh giá hiệu năng của hệ thống

bằng cách đo nồng độ hạt nano siêu thuận từ trong dòng chảy liên tục ở các điều kiện khác nhau Kết quả thực nghiệm đầu tiên được so sánh với tính toán lý thuyết để đánh giá độ chính xác của mô hình và khâu chế tạo Các kết quả này cũng giúp lựa chọn cấu hình chip vi lỏng tối ưu cho các thực nghiệm tiếp theo Nhược điểm của từng thực nghiệm được phân tích,

và các giải pháp kỹ thuật được điều chỉnh để cải thiện kết quả Các kết quả thực nghiệm được trình bày theo thứ tự khả năng phát hiện của hệ thống Cấu hình hệ đo tối ưu nhất được phân tích, đánh giá về tiềm năng ứng

dụng trong xây dựng hệ phân tích y sinh

1 Chương 1 Tổng quan 1.1 Vai trò của tế bào trong sinh vật sống và ý nghĩa của phân tích định lượng tế bào

Sự nhận biết và mô tả định lượng các loại tế bào trong mẫu xét nghiệm đóng vai trò quan trọng trong khoa học sự sống, trong chuẩn đoán lâm sàng, nghiên cứu y tế Tế bào là các đối tượng sinh học được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực sinh học phân tử Việc phát hiện và định lượng chúng

có ý nghĩa trong nhiều ứng dụng thực tiễn

1.2 Một số phương pháp phát hiện các đối tượng sinh học

Một số phương pháp phát hiện đối tượng sinh học hiện nay được phân tích trong luận án, bao gồm:

− Kỹ thuật xét nghiệm ELISA

− Kỹ thuật mô hình hóa miễn dịch (IHC)

− Kỹ thuật đếm dòng chảy (Flow cytometry)

− Kỹ thuật đếm tế bào bằng chip vi lỏng

− Nguyên lý phát hiện của các chip sinh học

Sau khi phân tích nguyên lý và các ưu nhược điểm của các phương pháp trên, phương pháp phát hiện từ tính được lựa chọn cho luận án

1.3 Nguyên lý của các loại cảm biến hiệu ứng từ

Các nguyên lý cảm biến từ tính được nghiên cứu để lựa chọn cấu trúc cảm biến phù hợp cho mục tiêu luận án, bao gồm:

− Cảm biến từ trở dị hướng

− Cảm biến cấu trúc van-spin (SV)

− Cảm biến dựa trên hiệu ứng Hall phẳng (PHE)

− Cảm biến từ trở khổng lồ (GMR)

− Cảm biến dựa trên hiệu ứng từ trở xuyên hầm (TMR)

Sau khi nghiên cứu, phân tích, cảm biền theo nguyên lý từ trở khổng

lồ (GMR) đã được xác định là phù hợp nhất để phát triển thiết bị vi lỏng cho hệ đo vi lưu đề xuất của luận án

2 Chương 2 Nguyên lý, tính toán và đề xuất mô hình hệ đo nồng độ

hạt nano siêu thuận từ trong dòng chảy liên tục

2.1 Nguyên lý tách lọc tế bào sử dụng hạt nano siêu thuận từ

Nguyên lý tách lọc tế bào bằng hạt nano từ tính dựa trên sự kết dính sinh học giữa chất bắt cặp (thường là kháng thể - Antibody) bám trên hạt nano từ tính và tế bào đặc hiệu của chúng

Sau đây trình bày hai cơ chế tách lọc tế bào ra khỏi mẫu được được sử dụng phổ biến hiên nay

2.2 Cơ chế tách lọc âm tính

Cơ chế tách lọc âm tính (negative) giữ lại đối tượng phi mục tiêu (không quan tâm) và lấy ra các đối tượng mục tiêu Trong đó, SPMNPs gắn nhiều loại kháng thể của đối tượng phi mục tiêu được trộn vào mẫu ban đầu SPMNPs sẽ bắt cắp lên toàn bộ bề mặt tế bào phi mục tiêu tương ứng Một từ trường tĩnh (nam châm vĩnh cửu) được sử dụng để giữ lại toàn bộ các tế bào đã bắt cắp với hạt nano và các hạt nano tự do đồng thời thu hồi toàn bộ tế bào mục tiêu

Hình 3.1 trình bày cơ chế tách lọc tế bào negative bằng kit thương mại (mã 11346D) sử dụng SPMNPs

Hình 2.1 Cơ chế tách lọc tế bào negative

2.3 Cơ chế tách lọc dương tính

Cơ chế tách lọc dương tính (positive) giữ lại đối tượng mục tiêu và rửa trôi các đối tượng phi mục tiêu Hình 2.2 trình bày cơ chế tách lọc tế bào positive bằng kit thương mại (mã 11361D) với hạt nano từ Dynabeads

Hình 2.2 Cơ chế tách lọc tế bào positive Hạt nano gắn lên toàn bộ bề mặt tế bào mục tiêu Một nam châm vĩnh cửu giữ lại các tế bào đã gắn SPMNPs, trong khi gạn bỏ các đối tượng phi

từ khỏi mẫu Cuối cùng, sử dụng một chất phân ly để loại bỏ liên kết tế bào-SPMNPs rồi giữ lại SPMNPs và gạn được tế bào mục tiêu

2.4 Nguyên lý phát hiện hạt nano siêu thuận từ trên bề mặt cảm biến

Có hai cơ chế phát hiện SPMNPs thể hiện trên Hình 2.3 và Hình 2.4

Hình 2.3 Ảnh hưởng của từ trường theo phương nhạy của cảm biến khi

(a) chưa có và (b) có mặt hạt nano siêu thuận từ

Hình 2.4 Ảnh hưởng của từ trường theo phương vuông góc với phương nhạy của cảm biến khi (a) chưa có và (b) có hạt nano siêu thuận từ trên

bề mặt cảm biến

Các hạt nano siêu thuận từ (SPMNPs) không có tính chất từ khi chưa được từ hóa, nhưng khi tiếp xúc với từ trường ngoài, chúng trở thành vi nam châm Trước khi có SPMNPs, chỉ có từ trường ngoài tác động lên bề mặt cảm biến Khi SPMNPs xuất hiện, cảm biến chịu tác động của cả từ

trường ngoài và từ trường cảm ứng do SPMNPs sinh ra So sánh tín hiệu

từ trên bề mặt cảm biến trước và sau khi có mặt SPMNPs giúp định lượng được SPMNPs Có hai cơ chế phát hiện SPMNPs: (1) do từ trường SPMNPs sinh ra làm suy giảm từ trường ngoài theo phương nhạy của cảm biến khi từ hóa song song (Hình 2.3) và (2) do SPMNPs bẻ đường sức từ

từ phương không nhạy (vuông góc) thành phương nhạy (song song), làm cho từ trường theo phương nhạy tăng lên (Hình 2.4) Nghiên cứu này áp dụng cơ chế thứ hai và sử dụng phương trình 2.42 để tính toán, thiết kế, chế tạo và kiểm chứng chip vi lỏng

(2.42)

Trong đó, µ0 là độ thẩm từ trong không khí; 𝜒 là độ cảm từ phụ thuộc vào vật liệu làm ra SPMNPs; 𝑉𝑡 là tổng thể tích chiếm dụng bởi SPMNPs;

là khoảng cách từ tâm dòng SPMNPs đến mặt phẳng cảm biến theo trục Z; (𝐹 − 𝐸) là độ dài dòng SPMNPs; (𝑥2− 𝑥1) là độ rộng mặt phẳng cảm biến; (𝑦2− 𝑦1) là độ dài mặt phẳng cảm biến

2.5 Mô hình hệ thống xác định nồng độ hạt nano siêu thuận từ trong dòng chảy liên tục

Sau khi nghiên cứu các nguyên lý và tính toán, mô hình hệ đo nồng độ SPMNPs trong dòng chảy liên tục được đề xuất như Hình 2.8 Các thành phần của hệ đo được đánh số thứ tự giống nhau cả sơ đồ khối (Hình 2.8 (b)) và sơ đồ nguyên lý (Hình 2.8 (b))

Hình 2.8 (a) Sơ đồ khối và (b) nguyên lý của mô hình hệ đo nồng độ hạt

nano siêu thuật từ trong dòng chảy liên tục Trên Hình 2.8(b), nguồn từ trường ngoài phát ra theo hai hướng, một