Bai giang mon hoa dung342 1 6683

Phân tích được một số ứng dụng của phương pháp sắc ký trong y, dược.. Phương pháp đường chuẩn -Bước 1: Pha dãy chuẩn có nồng độ C tăng dần một cách đều đặn các dung dịch chuẩn phải có

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

DỤNG CỤ

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

3 Định lượng được hàm lượng một số mẫu theo phương pháp

đường chuẩn, thêm chuẩn trong phương pháp đo phổ UV – VIS

4 Phân tích được một số ứng dụng của phương pháp sắc ký trong

y, dược.

* Năng lực tự chủ và trách nhiệm

5 Thể hiện được tính tích cực trong học tập Sử dụng tốt công

nghệ thông tin để tự nghiên cứu, giải quyết bài tập Phối hợp tốt với các thành viên trong nhóm.

CÂU HỎI THẮC MẮC CỦA SV

VỀ NỘI DUNG BÀI HỌC

Vùng phổ hấp thụ tử ngoại –khả

kiến là gì ?

Vùng UV là vùng tử ngoại

+Vùng tử ngoại xa, bước sóng < 200nm + Vùng tử ngoại gần, bước sóng từ 200- 400nm

Vùng VIS là vùng ánh sáng nhìn thấy được

Bước sóng 400-800nm

Phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

là phổ đám (phổ băng) 

Định luật Lambert ư Beer 

Logarit của tỉ s ố gi a c ường độ ánh s áng tới I ữ ư 0 và 

c ờng độ ánh s áng ló I ư l tỉ lệ thuận  với nồng độ dung 

  ­ Dung dÞch ph¶i trong s uèt

   ­ ChÊt thö ph¶i bÒn

LÀM THẾ NÀO ĐỂ ĐO ĐƯỢC

QUANG PHỔ UV-VIS?

Cấu tạo chung của máy quang phổ

Nguồn sáng

Lăng kính

Bộ phận tán sắc

Bộ phận chọn ánh sáng đơn sắc

Bộ phận chứa mẫu(Cuvet)

Màn hình điện tử

Bộ phận ghi và

xử lý tín hiệu quang thành tín hiệu điện

Máy quang phổ một chùm tia

•Trong hệ thống 1 chùm tia, ánh sáng đi thẳng đến 1 cuvet đo mẫu và 1 đầu dò

•Hệ thống 1 chùm tia sử dụng 1 cốc đo, ban đầu sẽ đo cốc mẫu trắng, sau đó đổ mẫu trắng đi và đo với mẫu thât.

Máy đo quang phổ hai chùm tia

•Ánh sáng được tách ra thành 2 tia bằng 1 bán gương: một nửa đi qua mẫu đo (sample) và 1 nửa đi qua đường so sánh (referent) thường chứa mẫu trắng

•Hệ thống 2 chùm tia sử dụng 2 cốc đo, ban đầu cả 2 cốc đều chứa mẫu trắng và

đo tín hiệu mẫu trắng Sau đó cốc ở vị trí mẫu sẽ được đổ đi và thay vào đó bằng mẫu cần đo Cốc tại vị trí so sánh vẫn để yên trong suốt quá trình đo

Nguyên tắc của phép đo phổ

• Thu, phân ly phổ đó và chọn vùng sóng hấp thụ cực đại của chất phân tích và đo cường độ hấp thụ quang A

Những hợp chất nào có thể áp dụng phương pháp đo quang phổ UV-VIS?

- Các chất có màu là do phân tử có chứa nhiều

Những hợp chất nào có thể áp dụng phương pháp đo quang phổ UV-VIS?

3 Hợp chất chứa các nguyên tố như N, O, S

còn cặp e chưa tham gia liên kết

OH 180nm; Amin 220nm; halogen 190nm

CO 270-295nm

 Các hợp chất phải bền dưới tác dụng của tia UV-VIS

ỨNG DỤNG ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

DƯỢC CHẤT

OH NHCOCH3

Định tính, định lượng Paracetamol

Hoà tan 50mg chế phẩm trong methanol

và pha loãng với methanol thành 100ml

Lấy 1ml dung dịch này, thêm 0,5ml acid

hydrocloric 0,1M và pha loãng với

methanol vừa đủ 100ml Dung dịch đã pha

tránh ánh sáng và đo ngay độ hấp thụ tại

bước sóng 249nm Độ hấp thụ riêng

A(1%, 1cm) trong khoảng từ 860-980

CH3

O O

HO

O

C C

Đ i t ng nghiên c u ố ượ ứ Ch t c n phân tích ấ ầ Thu c th ố ử

Chất kháng sinh Clotetraxyclin Thuốc thử Th

Chất kháng sinh Streptomyxin Axit picric

Chất kháng sinh Penixilin Hydrocylamin, Fe Các hocmon Cortison Phenylhidrazin, H

2SO4

Thịt Nitrit a-naphtylamin, ax-sunfunilic

Phản ứng và thuốc thử trong

phép đo UV – VIS

Cách tính kết quả định lượng bằng phương pháp quang phổ

UV-VIS?

A = k.l C

k: hệ số hấp thụ

l: Chiều dày cuvet đựng mẫu (cm)

C: Nồng độ của mẫu (mol/l

Định luật Lambert – Beer và

các hệ số hấp thụ

• Nếu nồng độ tính theo mol/l khi l = 1cm và

số hấp thụ mol.

• Nếu nồng độ C tính theo phần trăm (kl/tt)

và l tính theo cm thì: A =

A(1%, cm)

C l

Phương pháp đường chuẩn

-Bước 1: Pha dãy chuẩn có nồng độ C tăng dần một cách đều đặn

(các dung dịch chuẩn phải có cùng điều kiện như dung dịch xác định

• Bước 2: Tiến hành đo độ hấp thụ

quang A của dãy chuẩn ở bước sóng

λ đã chọn.

Phương pháp đường chuẩn

• Bước 3: Dựng đồ thị đường chuẩn A = f(C) Viết phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn y= ax+b

Phương pháp đường chuẩn

-Tiến hành pha chế dung dịch mẫu thử Đo độ hấp thụ

quang A của mẫu.

-Căn cứ vào phương trình hồi quy tuyến tính của dãy

chuẩn và Ax mà ta xác định nồng độ chất X trong mẫu thử -Khi chọn vùng nồng độ để xây dựng đường chuẩn phải chú ý:

+Vùng nồng độ của dãy chuẩn phải bao gồm cả Cx

+Với vùng nồng độ đã chọn dung dịch phải tuân theo định luật lambert Beer.

+ Các giá trị A ứng với nồng độ đã chọn phải sao cho khi

đo có độ lặp lại cao và bảo đảm sự tuyến tính A = f(C)

Phương pháp đường chuẩn

Cx

Phương pháp so sánh

c c

x x

C

C A

-Pha một dung dịch chuẩn có Cc

-Tiến hành đo độ hấp thụ quang A của dung dịch chuẩn so với

dung dịch so sánh (Ac)

-Theo định luật Lambert-Beer: Ac = ε l Cc

-Pha dung dịch mẫu với nồng độ cần xác định Cx (chưa biết)

-Tiến hành đo độ hấp thụ quang A của dung dịch mẫu so với dung dịch so sánh (Ax)

-Theo định luật Lambert-Beer: Ax = ε l Cx

• Ax = l Cx

• A(x+a) = L.(Cx + Ca)

Phương pháp thêm chuẩn

Sử dụng công thức

Phạm vi ứng dụng là xác định các chất có hàm lượng vi lượng hoặc siêu vi

lượng, loại bỏ ảnh hưởng của chất lạ

Phương pháp thêm chuẩn

Sử dụng đồ thị

Ax = b

Cx = b/a

Xác định nồng độ khi biết hệ số

hấp thụ

chính xác và ổn định ở một bước sóng, đo mật độ quang của dung dịch chất đó trong dung môi tương ứng tại bước sóng này

 Thông thường đó là bước sóng cho mật

độ hấp thụ cực đại.

công thức của định luật Lambert – Beer.

Bài tập áp dụng

Câu hỏi 1

Trong công thức của định luật Lamber – Beer:

Hãy xác định các giá trị có thể có của K khi sử dụng các loại nồng độ C (mol/l; %(kl/tt)

Câu hỏi 2

Theo định luật Lamber – Beer, độ hấp thu ánh sáng A (mật độ

quang D) sẽ tăng tuyến tính theo?

Câu hỏi 4

Tính nồng độ B12 trong mẫu biết rằng sử dụng phương pháp UV-VIS

đo được mật độ quang là 0,6 Mẫu chuẩn có nồng độ 0,001% có mật

Phương trình đường chuẩn: y = 0,0661x + 0,0002; y là A, x là nồng

độ Fe (mg/l)

Tính hàm lượng sắt trong mẫu nước ngầm trên ?

1. Đ a hỗn hợp lên pha tĩnh ư

2. Cho pha động chạy qua pha tĩnh

3. Phát hiện các chất

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG

      Thin Layer Chromatography 

(TLC)

NGUYÊN TẮC CỦA SKLM

Kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách.

-Pha tĩnh: là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại.

- Pha động: là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

•Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng

•Khai triển sắc ký với pha động phù hơp

•Phát hiện các vết trên sắc ký đồ

•Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH SẮC KÝ

LỚP MỎNG

Bước 1,2 Bước 3 Bước 4

Dung môi Điểm

mẫu

Thành phần “A”

Thành phần “B”

Thành phần “A” Thành phần “B”

Bản mỏng

Dung môi

di chuyển trên bản mỏng

Đường đi của các vết trên sklm

Cách phát hiện vết trên sắc kí đồ

• Cách 1: Phun thuốc hiện màu: Dùng thuốc thử tạo màu với chất phân tích

Acid phosphomolypdic: phát hiện nhiều chất hữu cơ cho màu xanh tối

Ninhydrin: Màu hồng-tím Phát hiện các amin

• Cách 2: Soi dưới đèn UV Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254nm hoặc 366 nm Một số bản tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh quang

• Cách 3: Dùng densitometer: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dưới đèn UV – VIS Chất phân tích hấp thụ bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký

Ứng dụng của phương pháp sklm

• Định tính: Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và

mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều kiện

• Thử tinh khiết: Dùng SKLM để kiểm tra mức độ tinh

khiết của các hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên sắc

ký đồ Trong các dược điển thường quy định kiểm tra

tạp chất có mặt trong dược chất bằng SKLM.

• Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: Đo diện tích hay

cường độ màu của vết sắc ký (sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5 – 10 %)

Định tính hoạt chất

có trong dược liệu

MÉu nh©n s ©m

MÉu hoµng liªn

Thử giới hạn tạp chất trong thành

phẩm thuốc

ứng  dụng của s ắc ký

1. Định tính và thử độ tinh khiết

2. Định lư ợng ư

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT

SẮC KÍ CỘT

Pha động

Hỗn hợp chất

Các chất tách ra

Chất đầu tiên

đi ra

Dịch chứa chất đầu

Dịch không chứa chất

Chất thứ 2

đi ra

Cột

Bình

chứa

Sự tách s ắc ký và s ắc đồ 

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO -HPLC

HPLC tên viết tắt của phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao tên tiếng Anh là: High-performance liquid

chromatography, hay còn được gọi là Sắc ký lỏng áp

S N O

OH

O

CH3CONH

N

Giảm đau các chứng thấp khớp có viêm

hoặc thoái hoá, viêm cứng cột sống, các chứng

PIROXICAM

3 Kiểm soát chất lượng dược phẩm.

4 Định lượng dược chất trong dược liệu

Ứng dụng trong xét nghiệm

1 Định lượng thuốc trong mẫu sinh học.

2 Xác định steroid trong máu, nước tiểu,

3 Phân tích về thuốc nhuộm ngành dệt

4 Xác định cocaine và các loại thuốc khác trong máu, nước tiểu…

Nguyên tắc hoạt động của pp

HPLC

HPLC là kĩ thuật tách các chất phân tích ra khỏi nhau khi chúng di chuyển theo pha động qua cột chứa các hạt pha tĩnh.

Chất phân tích

Pha độngPha tĩnh

Nguyên tắc hoạt động của máy

Cột sắc kí (Pha động)

Thời gian

3) Đầu dò phát hiện các chất ra khỏi cột

Kim

phun

Bơm cao áp

Ưu điểm của phương pháp này có độ nhạy cảm cao, có khả năng định lượng tốt, mức

độ chính xác cao, đặc biệt thích hợp để tách các chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy nhiệt nên nó được sử dụng khá nhiều

cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu thí nghiệm, pháp lý và y dược.

Câu hỏi 8

Em hãy mô tả những dụng cụ, thiết bị cần có để thực hiện phép

đo mẫu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao?

Câu hỏi 9

Một trong những bước của kỹ thuật phân tích alcaloid độc ( koumin,

mỏng chất trong mẫu so với chất chuẩn Cách làm như sau:

- Pha dung môi khai triển Toluen- Aceton- Ethanol- Amoniac với tỉ lệ tương đương 45:45:7:3 lắc đều rồi đổ vào bình triển khai, đậy nắp lại để dung môi hoà trộn đều trước khi đặt bản sắc ký vào ít nhất 15 phút.

- Dùng đầu côn nhỏ chấm khoảng 15µL mẫu thử lên bản mỏng Đồng thời chấm mẫu chuẩn đối chiếu cách mẫu thử khoảng 1cm Chú ý chấm cách mép dưới bản mỏng khoảng 1cm và vết chấm càng gọn càng tốt, vừa chấm

ta vừa sấy khô.

- Đặt bản mỏng vào trong bình triển khai đã có sẵn dung môi ở trên Chờ dung môi ngấm dần lên tới khi cách mép trên 1cm ta nhấc bản mỏng ra Có thể để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

- Soi qua đèn tử ngoại để nhận biết sơ bộ.

- Phun thuốc thủ hiện màu là Dragendoff bằng đầu phun hơi sương Sau đó tăng độ nhậy bằng acid sulfuric 10% Để khô tự nhiên hoặc sấy khô.

Kết quả: Mẫu thử là Lá ngón cho 4 vết màu vàng trên bản mỏng và có Rf tương đương với mẫu chuẩn

Hãy cho biết: Đâu là pha động, đâu là pha tĩnh trong quy trình trên?

Câu hỏi 10: ĐỊNH TÍNH PHOSPHO HỮU CƠ TRONG NƯỚC TIỂU

Phospho hữu cơ là chất ức chế mạnh các carboxylic ester hydrolase bao gồm: cetylcholinesterase và Pseudocholinesterase huyết tương, dẫn đến sự tích tụ các cetylcholin tại các synap thần kinh Trên lâm sàng thường gặp 3 hội chứng liên quan đến ngộ độc Phospho hữu cơ: hội chứng Muscarin, hội chứng Nicotin và hội chứng Thần kinh trung ương Phospho hữu cơ được hấp thụ vào cơ thể qua đường tiêu hóa, đường hô hấp, đường da và niêm mạc Muốn định tính Phospho hữu cơ có trong nước tiểu hoặc dịch rửa

dạ dày có thể dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng Giả sử, tiến hành chấm 3 điểm trên bản mỏng, điểm 1 là mẫu chuẩn, điểm 2 và 3 là mẫu nước tiểu và dịch dạ dày Sau khi chạy thu được sắc đồ như sau (vạch vàng)

Hãy quan sát sắc đồ cuối và hãy đánh giá xem trong mẫu nước tiểu và mẫu dịch dạ dày có chứa phospho hay không? Giải thích vì sao?

TỔNG KẾT BÀI

HƯỚNG DẪN TỰ HỌC BÀI 11

"XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!"