TUYỂN CHỌN VÀ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌCLUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TUYỂN CHỌN VÀ TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG ĐÔNG TỤ TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TUYỂN CHỌN VÀ TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG ĐÔNG TỤ TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO (SAU BIOGAS)

CỦA BACILLUS CÁC DÒNG KG.05, ST.02, VL.01, VL.05

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Gs Ts CAO NGỌC ĐIỆP TRẦN NGỌC HÂN MSSV: 3112462

LỚP: CNSH K37

Cần Thơ, tháng 5/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TUYỂN CHỌN VÀ TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG ĐÔNG TỤ TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO (SAU BIOGAS)

CỦA BACILLUS CÁC DÒNG KG.05, ST.02, VL.01, VL.05

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Gs Ts CAO NGỌC ĐIỆP TRẦN NGỌC HÂN

MSSV: 3112462

LỚP: CNSH K37

Cần Thơ, tháng 5/2014

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy tôi trong thời gian học tập vừa qua.

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy Gs.Ts Cao Ngọc Điệp_người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành tốt luận văn

Xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Liên_cố vấn học tập, người đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và động viên tôi khi vừa bước chân vào giảng đường đại học

Chân thành cám ơn anh Hồ Thanh Tâm, anh Trần Hoài Phong và chị Giang_cán

bộ phòng thí nghiệm Vi sinh Môi trường, các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ, tận tình chỉ dạy, dìu dắt và giúp

đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học khóa 37, các anh chị, các em trong Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ về kiến thức cũng như tinh thần để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã khích lệ và luôn ủng hộ tôi để tôi vững tin hoàn thành tốt khóa học của mình

Kính chúc quý Thầy Cô luôn dồi dào sức khỏe để tiếp tục cống hiến cho sự nghiệp trồng người

Xin chân thành cám ơn!

Cần Thơ, ngày 05 tháng 5 năm 2014

Trần Ngọc Hân

DANH SÁCH HÌNH i

DANH SÁCH BẢNG i

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT iii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tính chất nước thải chăn nuôi heo 3

2.1.1 Nước thải chăn nuôi heo trước khi qua xử lý biogas 3

2.1.2 Nước thải chăn nuôi heo sau biogas 3

2.2 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus 4

2.3 Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải 6

2.3.1 Bùn hoạt tính 6

2.3.2 Màng sinh học 6

Hình 2 Hệ vi sinh vật trong màng sinh học 7

2.4 Sự đông tụ 8

2.4.1 Khái niệm 8

2.4.3 Cơ chế của sự đông tụ 10

Quá trình đông tụ chủ yếu phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào và các thành phần cấu tạo tham gia vào các liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau 10

Lipopolysaccharides (LPSs) là thành phần cấu trúc bề mặt quan trọng của vi khuẩn Gram âm, nằm giữa các protein và phospholipid chiếm gần 75% diện tích bề mặt ngoài tế bào vi khuẩn Một LPS gồm có ba thành phần: lipid A, oligosaccharides và O-kháng nguyên Thường cấu trúc O-Kháng nguyên không đồng nhất trong các LPSs giúp tế bào vi khuẩn có thể thích nghi trong các trường hợp môi trường có biến động Cấu trúc của LPS bị biến đổi sẽ ảnh hưởng đến khả năng đông tụ của các dòng vi khuẩn thông qua làm thay đổi tính kỵ nước của bề mặt tế bào (Sutherland, 2001) Để làm rõ hơn vấn đề này, một nghiên cứu của Kimchhayarasy et al (2009) được tiến hành Ông gây đột biến dòng A johnsonii S35 có bề mặt gồ ghề hiệu suất đông tụ 88% bằng cách cấy chuyển nhiều lần; kết quả kiểm tra hiệu suất đông tụ chỉ còn 20% gần như mất khả năng đông tụ, và đặc điểm bề mặt tế bào vi khuẩn được quan sát có sự thay đổi từ lồi lõm thành bề mặt tế bào tương đối nhẵn hơn 10

Sự kết dính của hai tế bào thông qua sự liên kết của một dạng protein loại lectin trên tế bào này với một oligosaccharide trên tế bào kia Sự đông tụ ngừng lại nếu protein lectin bị biến tính do nhiệt độ hoặc các enzyme protease; hoặc sự xuất hiện của đường (lactose, galactose, hoặc các đường đơn khác), chúng liên kết với protein lectin khóa hoạt động của protein này (Kolenbrander and Anderson, 1989; Kinder and Holt, 1993; Shaniztki et al, 1997) Để làm rõ vai trò liên kết protein lectin-oligosaccharide, các tế bào vi khuẩn có khả năng đông tụ được xử lý với actinase E để phân hủy protein lectin, và xử lý với periodate để cắt cầu nối carbon trên oligosaccharide, kết quả đã làm ngăn cản quá trình đông tụ (Malik et al., 2003) 11

2.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự đông tụ 11

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 13

3.2 Phương tiện nghiên cứu 13

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 13

3.2.3 Hóa chất 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1 Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn 14

3.3.2 Phương pháp tính hiệu suất đông tụ 14

3.4 Tiến hành thí nghiệm 14

3.4.1 Thí nghiệm 1: xác định cặp dòng vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất .14

Mục đích: chọn được cặp dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao nhất, xác định thời gian tối ưu nhất để sự đông tụ đạt được hiệu suất đông tụ cao 15

3.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất đông tụ 16

Mục đích: xác định giá trị pH tối ưu nhất để hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn ở thời điểm tối ưu đạt được cao nhất 16

3.4.3 Thí nghiêm 3: khảo sát ảnh hưởng của các cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+ đến hiệu suất đông tụ 17

3.4.4 Khảo sát tính tương quan của yếu tố pH và cation hiệu suất đông tụ 19

Mục đích: tìm điều kiện tối ưu nhất cho sự đông tụ của cặp dòng vi khuẩn được chọn, khi khảo sát mối tương quan của hai yếu tố pH và cation .19

3.5 Phương pháp phân tích số liệu 19

4.1 Cặp dòng vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất 20

Bốn dòng vi khuẩn KG.05, VL.05, VL.01, ST.02 được tổ hợp thành 6 cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, KG.05-ST.02, VL.01-VL.05, VL.05-ST.02, VL.01-ST.02 để kiểm tra thời gian đông tụ tốt nhất của các cặp dòng vi khuẩn đồng thời dựa vào thí nghiệm này có thể chọn được cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn được ghi nhận tại năm móc thời gian 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ (bảng 4 ) 20

Bảng 4 Hiệu suất đông tụ ở những thời điểm khác nhau của các cặp dòng vi khuẩn .21

Từ kết quả thống kê, có thể kết luận rằng các cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 99% Cụ thể là, trung bình hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 tại các thời điểm là 58.82% khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê và cao nhất so với các cặp dòng vi khuẩn còn lại 21

Hiệu suất đông tụ ở các móc thời gian khác biệt có ý nghĩa ở mức 1% Trong đó, tại móc thời gian 6 giờ, trung bình hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn cao nhất là 75.27% và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các móc thời gian còn lại 21

4.3 Ảnh hưởng của các cation 24

Cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01, thời gian cho tổ hợp hai dòng vi khuẩn là 6 giờ, và pH=7 được chọn qua 2 thí nghiệm trên để tiến hành thực hiện kiểm tra ảnh hưởng của 4 loại : cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+, mỗi loại khảo sát ở 6 nồng độ: 10mM, 20nM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM của các loại muối tương ứng: CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl 24

Bảng 6 Ảnh hưởng của các cation ở các nồng độ khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 24

Từ kết quả phân tích có thể nhận định, các loại cation (loại muối) ảnh hưởng khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức tin cậy 99% Trong đó, sự hiện diện của Mg2+ cho hiệu suất đông tụ cao nhất (53.47%) so với các loại cation còn lại và hiệu suất đông tụ thấp nhất là 44.69% dưới sự tác động của cation K+ .24

cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 1% Trong tất cả các trung bình của từng nồng độ tính trên cả 4 loại muối, nồng độ cho hiệu suất đông tụ cao nhất (65.32%) là 30mM, thấp nhất (36.48%) ở nồng độ 60mM 25 Qua phân tích ANOVA có thể nhận định, các nồng loại muối khác nhau sẽ có một nồng độ tối ưu cho hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 Cụ thể là, 2 muối cation hóa trị II: CaCl2 và MgCl2 có hiệu suất đông tụ cao nhất, khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99%, (tương ứng là 57.07%; 62.95%) ở nồng độ 20mM so với các nồng độ muối còn lại; 2 muối có cation hóa trị I: KCl và NaCl có hiệu suất đông tụ cao nhất (tường ứng là 69.64%; 71.63%) khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nồng độ muối còn lại Ở các nồng độ muối ban đầu thấp 10mM (và 20mM đối với cation hóa trị I) hiệu suất đông tụ chưa tối ưu nhất, cho đến khi tăng nồng độ muối đến giá trị phù hợp đối với từng muối Và tiếp tục, nồng độ các muối được nâng lên 40mM, 50mM, 60mM hiệu suất đông tụ có những biến động theo chiều hướng giảm (hình), và thấp nhất là ở nồng độ muối 60mM Nguyên nhân là do, sự thay đổi nồng độ hay điện tích ion trong môi trường sẽ làm thay đổi cấu trúc

bề mặt tế bào dẫn đến sự đông tụ bị ảnh hưởng Hơn nữa liên kết giữa các dòng vi khuẩn là nhờ liên kết lectin-olygosaccharide, protein lectin chiệu sự tác động của điện tích trong môi trường nên nồng độ muối cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn

25

26

Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu của Min et al., (2010) khi khảo sát các yếu tố hóa, lý ảnh hưởng đến sự đông tụ của 2 dòng vi khuẩn Sphingomonas natatoria 2.1gfp và Micrococcus luteus 2.13 trong bùn hoạt tính của nước thải sinh hoạt Tế bào vi khuẩn được pha loãng trong các dung dịch có nồng độ khác nhau của các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 và NaCl, KCl, sự đông tụ bị hạn chế khi nồng độ muối NaCl, KCl (cation hóa trị 1) ở 90 mM, trong khi đó nồng độ các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 (cation hóa trị 2) chỉ cần 40 mM .26

Muối cation hóa trị I: NaCl và KCl, cation cation hóa trị II: CaCl2, MgCl2 tương ứng có hiệu suất đông tụ cao nhất ở nồng độ 30mM, 20mM khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99% so với các nồng độ còn lại Nhưng khi so sánh giữa chúng với nhau thì sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê Tuy nhiên, mỗi dòng vi khuẩn sẽ phù hợp với một loại ion ở nồng độ nhất định để hoạt động tối ưu nhất (Theo Lương Đức Phẩm, 2009), trong khi đó, môi trường nước thải chăn nuôi heo tồn tại rất nhiều các loại ion hóa trị I, II Vì thế, thí nghiệm tiếp được thực hiện để tìm ra loại cation có nồng độ tối ưu được 26

26

27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.Vi khuẩn bacillus sau khi nhuộm Gram 4

Hình 2 Hệ vi sinh vật trong màng sinh học 6

Hình 3 Sự đông tụ giưa các dòng vi khuẩn 7

Hình 4 Hoạt động liên kết của protein Lectin trên bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ 9

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần và tính chất nước thải chăn nuôi heo 2 Bảng 2 Giá trị giới hạn các thông số chất lượng nước thải công nghiệp 3 Bảng 3 Thành phần môi trường Polypepton lỏng nhân sinh khối vi khuẩn đông tụ 8

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

BOD Biochemical Oxygen Demand_Nhu cầu oxy hóa sinh học

COD Chemical Oxygen Demand_Nhu cầu oxy hóa học

LPS Lipopolysaccharides

OD660

OD0

ODS

TSS Total Suspended Solids_

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam, chăn nuôi heo là một nghề đã có từ lâu, đến ngày nay nó được mở rộng với quy mô lớn tại các cơ sở do nhu cầu tiêu thụ thịt ngày càng tăng Bên cạnh đó là sự phát sinh lượng nước thải lớn làm ô nhiễm môi trường Vấn đề này được khắc phục bằng nhiều biện pháp: sinh học, hóa lý, cơ học,…Trong đó biện pháp sinh học được sử dụng rộng rãi do có nhiều ưu điểm: an toàn, dễ thực hiện, giá thành rẻ,… Đặc biệt là biện pháp

ủ yếm khí (biogas) được nhiều người áp dụng, ngoài việc cải thiện tình trạng ô nhiễm còn

có thể thu khí metan làm nhiên liệu Những lợi ích do ủ biogas đem lại là không thể phủ nhận, tuy nhiên các chỉ tiêu ô nhiễm vẫn còn ở mức khá cao, vì thế việc tiếp tục xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas là cần thiết

Sự kết tụ nhờ vi sinh vật (microbial flocculants) trong hệ thống bùn hoạt tính, màng sinh học tỏ ra có hiệu quả khi đưa vào các quy trình làm sạch nước thải, trong đó có chăn nuôi heo sau biogas bằng cách tổng hợp các chất kết tụ sinh hoc (bioflocculants) làm lắng

tụ vật chất lơ lững có kích thước nhỏ Nhưng theo nhiều nghiên cứu gần đây các dòng vi khuẩn chiếm ưu thế lại không có khả năng kết tụ (Non-flocculation bacteria), chúng có một cơ chế riêng ít được nói đến, trong đó quần thể vi khuẩn có khả năng đông tụ

(Aggregation) lại có tỉ lệ cao, chúng cũng tham gia vào quá trình lắng động, kết dính các vật chất có kích thước nhỏ, khó xử lý vì thế giữ vai trò quan trọng trong quá trình hình thành màng sinh học, bùn sinh học

Đề tài “Tuyển chọn và tối ưu hóa khả năng đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo

(sau biogas) của vi khuẩn Bacillus các dòng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05” được thực

hiện để xác định các điều kiện tối ưu cho sự đông tụ của dòng vi khuẩn có hiệu suất đông

tụ cao nhất, tạo tiền đề cho những nghiên cứu kế tiếp để xử lý nước thải chăn nuôi heo một cách có hiệu quả

1.2 Mục tiêu của đề tài

Chọn cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất từ Bacillus các dòng KG.05,

VL.01, VL.05, ST.02 được phân lập từ nước thải chăn nuôi heo sau biogas, và xác định điều kiện tối kiện tối ưu nhất cho quá trình đông tụ trong điều kiện phòng thí nghiệm

1.3 Nội dung nghiên cứu

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU2.1 Tính chất nước thải chăn nuôi heo

2.1.1 Nước thải chăn nuôi heo trước khi qua xử lý biogas

Nước thải chăn nuôi bao gồm: nước vệ sinh vật nuôi, chuồng trại chứa phân, nước tiểu, thức ăn thừa… chúng là tác nhân gây ra ô nhiễm môi trường do chứa nhiều các chất

lơ lững, hợp chất hữu cơ, hàm lượng N, P khá cao ngoài ra còn có coliform, trứng giun sán; là môi trường thuận lợi cho nhiều vi sinh vật gây bệnh phát triển đặc biệt là sự biến thể của các virus làm bùn phát các dịch bệnh: lở mồm long móng, tai xanh trên heo,… ảnh hưởng lớn đến nền kinh tế, sức khỏe con người và vật nuôi…

Theo Từ Thụy Hạnh (2013), trong thành phần chất rắn của nước thải, chất hữu cơ chiếm 70-80% gồm các chất hydrocacbon, proxit, acid amin chất béo và các dẫn xuất của chúng có trong phân và thức ăn thừa Chất vô cơ chiếm 20-30% gồm các, đất, muối clorua, SO4 đặc biệt là hàm lượng đạm trong nước thải rất cao do hệ tiêu hóa của gia súc

có khả năng hấp thu kém thành phần nitơ Chỉ có 30% lượng nitơ đưa vào cơ thể vật nuôi chuyển hóa thành sản phẩm, 70% còn lại bị bài tiết ra ngoài dưới dạng NH4+, NO2-, NO3- (Jongbloes và Lenis, 1992) Lân là thành phần tương đối ít, chiếm 0.25-1.4% trong thức

ăn thừa, và một ít trong nước tiểu của heo…tồn tại chủ yếu ở dạng HPO42-, H2PO4, PO43-,

và photphate hữu cơ

Bảng 1 Thành phần và tính chất nước thải chăn nuôi heo.

Thông số Đơn vị Giá trị

(*Nguồn: http://moitruonghaidang.com/cong-nghe-xu-ly-nuoc-thai-chan-nuoi-heo , ngày 7/1/2014).

2.1.2 Nước thải chăn nuôi heo sau biogas

Sau khi qua xử lý bằng cách ủ biogas, các chất hữu cơ có trong nước thải chăn nuôi heo được chuyển hóa có hiệu quả: COD giảm 76.3%; SS giảm 86.1% và 51.2% vi sinh vật gây bệnh bị tiêu diệt; nhưng các chất dinh dưỡng (N, P) được xử lý chỉ một phần: N giảm 11.8%; P giảm 7.0% (Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu, 2012).

Nước thải sau khi qua xử lý biogas, nếu thải trực tiếp ra ngoài môi trường sẽ ảnh hưởng đến hệ sinh thái tự nhiên, do hàm lượng các chất ô nhiễm vẫn chưa đạt các chỉ tiêu

an toàn cho phép, nhất là các thành phần dinh dưỡng còn ở mức cao, cần được tiếp tục xử

lý trước khi thải vào môi trường

Bảng 2 Giá trị giới hạn các thông số chất lượng nước thải công nghiệp.

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillaceae

Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus (*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus, ngày 31/12/2013 )

Hình 1 Vi khuẩn bacillus sau khi nhuộm Gram.

(Nguồn: http://textbookofbacteriology.net/Bacillus.html , ngày 20/2/2014).

Bacillus là một chi vi khuẩn Gram dương có hình que, tạo bào tử, hiếu khí hoặc yếm

khí Bacillus được tìm thấy ở nhiều môi trường với nhiều chủng loài khác nhau và được

ứng dụng nhiều trong cuộc sống, có tác động đáng kể đến hoạt động của con người trên nhiều lĩnh vực: từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường

ô nhiễm, thu hồi kim loại nặng, sản xuất chế phẩm sinh học, nhiên liệu sinh học… cụ thể

là, B thuringiensis được sử dụng rộng rãi để tiêu diệt côn trùng có hại, B subtilis

là chủng sản xuất một loạt các peptide có hoạt tính sinh học cao (Shalini et al., 2009)

Theo nghiên cứu của Singh et al (2013), B.subtilis NG220 được ứng dụng để xử lý nước thải của các nhà máy sản xuất đường một cách hiệu quả, đồng thời tạo ra poly β- hydroxybutyrate là thành phần tổng hợp nhựa phân hủy sinh học B aterrimus, B

megaterium, B natto, B panis, B pumilis… giúp cải thiện môi trường, kiểm soát sự phát

triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh, tăng cường miễn dịch cho các loài thủy sinh trong nuôi trồng thủy sản

Bacillus có thể sống riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi Do có bào tử nên

chúng có thể kháng lại các điều kiện bất lợi của môi trường rất có hiệu quả: chúng có thể

sống trong môi trường có pH biến động cao, có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ,

kháng áp suất cao…Đặc biệt vi khuẩn Bacillus còn có bao nhầy được cấu tạo từ các

polypeptide đóng vai trò dự trữ thức ăn, bảo vệ vi khuẩn khỏi các điều kiện bất lợi…(Trần Thị Thu Hiền, 2012)

Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus dễ nuôi cấy, thường mọc tốt trên môi trường có

nguồn cacbon là đường, acid hữu cơ, rượu… với nguồn nitơ duy nhất là ammonium, ngoài ra còn có một số dạng phân lập cần vitamin để tăng trưởng Môi trường sống chủ

yếu của Bacillus là đất, nước và bùn (Green et al., 1999).

2.3 Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải

Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải là phương pháp sử dụng khả năng sống

và hoạt động của vi sinh vật để khoáng hóa các chất hữu cơ có trong nước thải thành các chất vô cơ, các chất khí đơn giản và nước Các vi sinh vật tồn tại trong môi trường thực hiện quá trình trao đổi chất để tăng sinh khối, tạo sản phẩm cần thiết cho nhu cầu sinh hoá của tế bào Vi sinh vật phân hủy các chất có trong nước thải, thường có hai kiểu sinh trưởng: sinh trưởng lơ lửng (bùn hoạt tính) và sinh trưởng dính bám (màng sinh học)

2.3.1 Bùn hoạt tính

Bùn hoạt tính bao gồm những vi sinh vật sống kết lại thành dạng hạt hoặc dạng bông với trung tâm là các chất rắn lơ lửng chiếm 40% Các hạt bông này khi được khuấy đảo và thổi khí sẽ dần dần lớn lên do tiếp tục hấp thụ nhiều hạt rắn nhỏ, tế bào vi sinh vật, nguyên sinh động vật… (Nguyễn Văn Phước, 2009) Trong quá trình hình thành bùn hoạt tính các vi sinh vật có trong bùn sử dụng các chất dinh dưỡng, chất hữu cơ có trong nước thải làm nguồn thức ăn để tổng hợp năng lượng và các thành phần cấu tạo nên tế bào mới Những hạt bông bùn sẽ lắng xuống đáy khi chúng đủ lớn hoặc ngừng các hoạt động thổi khí, khuấy trộn Sau đó, vi sinh vật yếm khí dưới đáy bùn tiếp tục quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ này

2.3.2 Màng sinh học

Màng sinh học là tập hợp nhiều dòng vi khuẩn khác nhau, có hoạt tính oxy hóa các chất hữu cơ khi chúng tiếp xúc với màng Màng sinh học thường có các kênh thông nhau như một hệ thống tuần hoàn giúp cộng đồng vi khuẩn có thể loại thải các chất độc hại

cũng như tiết và hấp thu các sản phẩm trao đổi chất, trao đổi vật liệu di truyền, sản xuất các phân tử tín hiệu như peptide, autoinducer hoặc dựa vào cấu trúc bề mặt như tính kỵ nước, roi, fimbriae, độ bám dính không đặc hiệu giữa các loài vi khuẩn, phối hợp các hoạt động trong quá trình sinh trưởng và phát triển để có thể duy trì tính toàn vẹn của cộng đồng đa loài màng sinh học (Costerton, 1995).

Các thành phần trong màng sinh học khác nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố, thông thường thành phần chính là nước và vi khuẩn, tiếp theo là exopolysaccharides…là rào cản vật lý giúp chóng lại các điều kiện bất lợi từ môi trường như: sự khô hạn, tia tử ngoại, sự thay đổi của pH, các chất độc,…(Sutherland, 2001)

Các vi khuẩn trong màng sinh học thường có hoạt tính cao hơn vi khuẩn trong bùn hoạt tính Màng sinh học hiếu khí là một hệ vi sinh vật tùy tiện Ở ngoài cùng của màng là

lớp vi khuẩn hiếu khí mà dễ thấy là trực khuẩn Bacillus, ở giữa là các vi khuẩn tùy tiện như Alkaligenes, Pseudomonas, Flavobacterium, Micrococus và cả Bacillus Lớp sâu bên trong màng là các vi khuẩn kỵ khí khử lưu huỳnh và nitrat như Desulfovibrio Vi sinh vật

trong màng sinh học sẽ oxi hóa các chất hữu cơ, sử dụng chúng làm nguồn dinh dưỡng và năng lượng Như vậy chất hữu cơ được tách ra khỏi nước, còn khối lượng của màng sinh học tăng lên (Nguyễn Văn Phước, 2007) Màng sinh học được ứng dụng trong các hệ thống lọc sinh học xử lý nước thải như: đĩa quay sinh học, lọc sinh học nhỏ giọt, lọc sinh học ngập nước

Hình 2 Hệ vi sinh vật trong màng sinh học.

(*Nguồn: http://microwavesscience.blogspot.com/ Ngày 6/1/2014)

- Sự nhận biết và kết dính của các tế bào vi khuẩn còn xảy ra đối với các dòng vi khuẩn giống nhau về mặt di truyền, được gọi là sự tự đông tụ (intrageneric coaggregation hay autoaggregation)

Hình 3 Sự đông tụ giưa các dòng vi khuẩn.

(A) A johnsonii S35 và B natatoria S9; (B) A johnsonii S35 và Mycobacterium sp S19; (C) A junii S33 và B natatoria S9; (D) A junii S33 và Mycobacterium sp S19

(*Nguồn: Kimchhayarasy et al., 2009).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học8

A V i k h u ẩ

n d ò n

g K G.

05 ch ụ

p d ư

ới kí n

h hi

ển

vi đi

ện

tử (S E M ), đ

ộ p h ó n

g đ

ại 6.

50

0

B V i k h u ẩ

n d ò n

g K G.

05 ch ụ

p d ư

ới kí n

h hi

ển

vi đi

ện

tử (S E M ), đ

ộ p h ó n

g đ

ại 6.

50

0

Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ

Hình 4 Vi khuẩn dòng VL.01 (A) và KG.05 (B).

(*Nguồn: Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2013)

Bảng 3 Một số vi khuẩn có khả năng đông tụ.

Vi khuẩn có khả năng đông tụ Tác giả

Flavobacterium spp. Sakka et al (1981)

Pseudomonas spp. Sakka et al (1981)

lactobacillus Vandevoorde et al (1992)

Acinetobacter johnsonii S35 Malik và Kakii (2003)

A junii S33 Malik và Kakii (2003)

Bacillus cereus Kimchhayarasy et al (2009)

Blastomonas natatoria Kimchhayarasy et al (2009)

Mycobacterium sp. Kimchhayarasy et al (2009)

Thermomonas Kimchhayarasy et al (2009)

Enterobacteriaceae Kimchhayarasy et al (2009)

Sphingomonas natatoria 2.1gfp Min và Rickad (2009)

Micrococcus luteus 2.13 Min và Rickad (2009)

2.4.2 Vi khuẩn đông tụ trong các hệ thống xử lý nước thải bùn hoạt tính và màng sinh học

Trong thí nghiệm của Malik (2003) có 52 dòng vi khuẩn được phân lập từ bùn hoạt tính trong đó các dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ chiếm 31%, 11% là các dòng vi khuẩn

bị lắng tụ còn lại 58% là các dòng vi khuẩn không có khả năng kết tụ Trong nhiều nghiên cứu khác các dòng vi khuẩn này cũng chiếm một tỉ lệ cao và trước đây chúng bị xem là

một trong các nguyên nhân gây đục nước vì thế chúng ít được đề cập đến Nhưng về sau,

nhiều nghiên cứu chứng minh chúng giữ một vai trò quan trọng trong quá trình làm sạch nước trong các hệ thống bùn hoạt tính và màng sinh học nhờ vào khả năng đông tụ

Sự đông tụ, kết dính (Adherence) và lắng (Settlement) là các quá trình quan trọng trong vận hành bùn hoạt tính Sự đông tụ và kết dính được biết là quá trình kết tụ sinh học (Biofloculation), lắng xuống tạo thành bùn Các quá trình được vận hành một cách tuần hoàn Vì vậy, quá trình bùn hoạt tính hoạt động hiệu quả phải đảm bảo các hạt bùn được lắng tốt Sự đông tụ và lắng tốt quyết định độ sạch và trong của nước sau xử lý Tuy

V i k h u ẩ

n d ò n

g K G.

05 ch ụ

p d ư

ới kí n

h hi

ển

vi đi

ện

tử (S E M ),

đ

ộ p h ó n

g đ

ại 6.

50

0 lầ n

V i k h u ẩ

n d ò n

g K G.

05 ch ụ

p d ư

ới kí n

h hi

ển

vi đi

ện

tử (S E M ), đ

ộ p h ó n

g đ

ại 6.

50

0 lầ n

nhiên, quá trình bùn hoạt tính thường gặp nhiều sự cố như sự phát triển quá nhiều của vi khuẩn dạng sợi hoặc bùn kém chất lượng như bùn lắng kém hay bùn tạo khối (Kimchhayarasy et al., 2009).

Nhiều nghiên cứu về sự đông tụ của vi sinh vật trong các hệ thống sinh học đã cho thấy vai trò sự đông tụ là yếu tố cần thiết cho sự hình thành màng sinh học (Saginur et al., 2006) Sự đông tụ góp phần tham gia vào quá trình hình thành và phát triển màng sinh học, bước đầu tiên là sự kết dính (Coadhesion) của tế bào đơn trong môi trường đến bề mặt vật liệu Sau đó chủ yếu là sự đông tụ, từ các tế bào đơn lẻ hoặc từ một nhóm các tế bào khác nhau hoặc một nhóm các tế bào giống nhau về mặt di truyền sẽ kết dính với những tế bào kết dính với bề mặt vật liệu trước đó Quá trình này được tiếp diễn và tạo thành màng sinh học đa chủng vi sinh vật Min và Rickard (2009) đã chứng minh rằng sự đông tụ tăng cường độ bám dính giữa các màng sinh học nước ngọt phù du, vi khuẩn và

nó có khả năng đóng góp vào sự phát triển của màng sinh học trong môi trường tĩnh hay chảy

2.4.3 Cơ chế của sự đông tụ

Quá trình đông tụ chủ yếu phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào và các thành phần cấu tạo tham gia vào các liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau

Lipopolysaccharides (LPSs) là thành phần cấu trúc bề mặt quan trọng của vi khuẩn Gram âm, nằm giữa các protein và phospholipid chiếm gần 75% diện tích bề mặt ngoài tế bào vi khuẩn Một LPS gồm có ba thành phần: lipid A, oligosaccharides và O-kháng nguyên Thường cấu trúc O-Kháng nguyên không đồng nhất trong các LPSs giúp tế bào

vi khuẩn có thể thích nghi trong các trường hợp môi trường có biến động Cấu trúc của LPS bị biến đổi sẽ ảnh hưởng đến khả năng đông tụ của các dòng vi khuẩn thông qua làm thay đổi tính kỵ nước của bề mặt tế bào (Sutherland, 2001) Để làm rõ hơn vấn đề này, một nghiên cứu của Kimchhayarasy et al (2009) được tiến hành Ông gây đột biến dòng

A johnsonii S35 có bề mặt gồ ghề hiệu suất đông tụ 88% bằng cách cấy chuyển nhiều

lần; kết quả kiểm tra hiệu suất đông tụ chỉ còn 20% gần như mất khả năng đông tụ, và đặc điểm bề mặt tế bào vi khuẩn được quan sát có sự thay đổi từ lồi lõm thành bề mặt tế bào tương đối nhẵn hơn

Sự kết dính của hai tế bào thông qua sự liên kết của một dạng protein loại lectin trên

tế bào này với một oligosaccharide trên tế bào kia Sự đông tụ ngừng lại nếu protein lectin

bị biến tính do nhiệt độ hoặc các enzyme protease; hoặc sự xuất hiện của đường (lactose, galactose, hoặc các đường đơn khác), chúng liên kết với protein lectin khóa hoạt động của protein này (Kolenbrander and Anderson, 1989; Kinder and Holt, 1993; Shaniztki et al, 1997) Để làm rõ vai trò liên kết protein lectin-oligosaccharide, các tế bào vi khuẩn có khả năng đông tụ được xử lý với actinase E để phân hủy protein lectin, và xử lý với periodate

để cắt cầu nối carbon trên oligosaccharide, kết quả đã làm ngăn cản quá trình đông tụ (Malik et al., 2003)

Hình 5 Hoạt động liên kết của protein Lectin trên bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ.

(*Nguồn: Malik et al 2003)

2.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự đông tụ

Dòng vi khuẩn Sphingomonas natatoria 2.1gfp và Micrococcus luteus 2.13 có khả

năng đông tụ với nhiều dòng vi khuẩn khác và khả năng tạo màng sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm, đồng thời sự đông tụ này bị ngăn chặn bởi galactosamine (Min và Rickad, 2009)

Một nghiên cứu khác của Min et al., (2010) đã khảo sát các yếu tố lý hóa học ảnh

hưởng đến sự đông tụ của hai dòng vi khuẩn Sphingomonas natatoria 2.1gfp và

Micrococcus luteus 2.13 Khi tế bào vi khuẩn được pha loãng trong các dung dịch có

nồng độ khác nhau của các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 và NaCl, cho thấy sự đông tụ bị

hạn chế khi nồng độ muối NaCl (cation hóa trị 1) đạt 90 mM, trong khi đó nồng độ các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 (cation hóa trị 2) chỉ cần 40 mM, điều này do sự chênh lệch

về điện tích các ion Sự thay đổi nồng độ ion hay thay đổi điện tích sẽ làm thay đổi cấu trúc bề mặt vỏ tế bào sẽ ảnh hưởng đến sự đông tụ Hơn nữa protein dạng lectin cũng sẽ ảnh hưởng bởi nồng độ ion xung quanh nó, điều này làm thay đổi khả năng đông tụ Ngược lại khi bổ sung EDTA, mục đích là để hấp thu các ion, sự đông tụ bị giới hạn lại

Do đó, nồng độ ion có giới hạn trên và giới hạn dưới đến sự đông tụ Yếu tố của pH được khảo sát kết quả là sự đông tụ xảy ra ở khoảng giá trị khá rộng 3-9 Giá trị pH trong dung dịch ảnh hưởng đến khả năng đông tụ của các dòng vi khuẩn do bề mặt các chất phân tán thay đổi theo giá trị pH

Các nguyên tố K, Mg, Ca, S, Fe, Mn, Zn,… đều cần cho vi sinh vật sống Nếu thiếu nitơ quá lâu làm cho vi sinh vật không sinh sản, sinh khối không tăng, ngoài ra còn làm cản trở các quá trình hóa sinh và bùn hoạt tính khó lắng, trôi theo nước khỏi bể lắng Nếu thiếu phospho sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh ra dạng sợi làm cho quá trình lắng chậm, giảm hiệu suất oxy hóa các chất hữu cơ của bùn hoạt tính (Lương Đức Phẩm, 2009)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện từ 10/2013 - 04/2014 tại phòng vi sinh vật môi trường và vi sinh vật đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

3.2 Phương tiện nghiên cứu

- Thiết bị: máy khuấy từ; máy microwave; pH kế Orion 420A; máy vortex IKA; cân điện tử Sartorius; tủ sấy EHRET; tủ ủ vi sinh vật Incucell 111; máy lắc GFL 3005; nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international; tủ lạnh trữ mẫu-Sanyo; lò vi sóng Panasonic; máy

đo OD BecKman coulter DU 640B; máy ly tâm; tủ cấy