giáo trình công nghệ enzyme protein

- Nhóm guanilic của Acginine Khi tạo thành trung tâm hoạt động các nhóm này phải ở vị trí gần nhau và đượcđịnh hướng trong không gian sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá tr

Định nghĩa enzyme Thành phần cấu tạo của enzyme Trung tâm hoạt động của enzymeTrung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu

tử Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu

tử Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động

Sự tạo thành trung tâm hoạt động Tính đặc hiệu của enzyme

Khái niệm chung Các hình thức đặc hiệu

3 7

77

14 789

12

16 78

Cách gọi tên và phân loại enzyme

Cách gọi tên enzyme Phân loại enzyme

Đơn vị hoạt độ enzyme

Sinh học enzyme

Điều hòa hoạt tính enzyme Điều hòa sinh tổng hợp enzyme Điều hòa theo kiểu đóng mở gen tác động

Ứng dụng Ứng dụng trong y dược Ứng dụng trong hóa học Ứng dụng trong công nghiệp Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

6.2.5 Ứng dụng trong công nghiệp dệt 112

6.2.6 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 113

6.2.7 Ứng dụng trong nông nghiệp

Chương 1 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME

cơ thể Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường

là chất vô cơ Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein

Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứngsinh hóa có thể tóm tắt như sau:

- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóarất cao

- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phảnứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít

- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứngxảy ra trong cơ thể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúctác bởi enzyme

- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng

Enzyme học là khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chấtprotein Hay nói cách khác, enzyme học là khoa học nghiên cứu những tính chất chung, điều kiện, cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu của các enzyme

1.2 Thành phần cấu tạo của enzyme

Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton (có kích thước nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton)

Enzyme được cấu tạo từ các L - a - axitamin kết hợp với nhau bởi liên kết peptit Dưới tác dụng của các peptithydrolase, axit hoặc kiềm các enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các L - a - axitamin Trong nhiều truờng hợp ngoài axit amin còn thu được những thành phần khác, người ta chia thành hai nhóm:

 Nhóm enzyme đơn cấu tử (enzym đơn giản): enzyme chỉ được cấu tạo một

thành phần hóa học duy nhất là protein

 Nhóm enzyme đa cấu tử (enzym phức tạp): enzyme có hai thành

phần:

- Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme Apoenzyme thường quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme

- Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại "agon": như ion kim loại, vitamin, glutation dạng khử, nucleotide và dẫn xuất este phosphat của monosacaride, Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần "apoenzyme" (khi cho thẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì những agon đó còn cótên riêng là coenzyme Phần agon quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với cácyếu tố gây biến tính

Đa số enzyme thuộc loại enzyme đa cấu tử Hiện nay người ta cũng đã xác định được rằng phần lớn các enzyme trong tế bào là những protein có cấu trúcbậc bốn Ở những điều kiện xác định, phân tử của chúng có thể phân ly thuận nghịch tạo thành các phần dưới đơn vị (protome), khi đó hoạt độ enzyme bị giảmhoặc bị mất hoàn toàn Ở những điều kiện thích hợp các phần dưới đơn vị lại

có thể kết hợp lại với nhau và hoạt độ xúc tác của enzyme được phục hồi

1.3 Trung tâm hoạt động của enzyme

Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzyme tham gia kếthợp đặc hiệu với cơ chất, phần đó được gọi là trung tâm hoạt động của

enzyme Trung tâm của enzyme được tạo nên do một số axit amin đảm trách Các axit amin khác trong protein không tham gia gắn với cơ chất mà chỉ làm nhiệm vụ như một chiếc khung cấu trúc không gian của chiếc khung đó

1.3.1 Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử

Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp các nhóm định chức của axit amin không tham gia tạo thành trục chính củasợi

polypeptit

Các nhóm chức của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là:

- Nhóm SH (sunfidryl) của Cysteine

- Nhóm - NH2 (amin) của Lysine

- Nhóm OH (Hydroxyl) của Serine, Threonine và Tyrosine

- Nhóm COOH (Cacboxyl) của axit Glutamic, Aspactic

- Vòng imidazol của Histidine

- Vòng indol của Tryptophan

- Nhóm guanilic của Acginine

Khi tạo thành trung tâm hoạt động các nhóm này phải ở vị trí gần nhau và đượcđịnh hướng trong không gian sao cho

chúng có thể tương tác với nhau trong quá

trình phản ứng

Ví dụ, Trung tâm hoạt động của

Colinesteraza bao gồm các nhóm: -OH

của serine, tyrosine, -COOH

của

glutamic, imidazolit của histidine

Hình 1.1 : Trung tâm hoạt động của enzym colinesteraza

Các trung tâm hoạt động có thể hình thành dễ dàng khi các nhóm chức ở gần nhau trên Apoenzyme Nhưng có khi chúng ở xa nhau thì phải hoạt hóa bằng cách cắt đi một đoạn peptide nào đó, chúng xích lại gần nhau và tạo thành trung tâm hoạt động

Ví dụ, Tripxinogen là trạng thái không hoạt động, nhưng khi dưới tác dụng củaenzyme Enterokinaza thì 6 axit amin bị loại ra, các nhóm chức lúc này xích lại gần

và trung tâm hoạt động được dễ dàng

1.3.2 Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử

Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử thường bao gồm nhóm ngoại (vitamin, ion kim loại ) và các nhóm định chức của các axit amin ở phần

apoenzyme

Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là những kim loại hóa trị 2: Fe, Co, Mn, Zn, Cu¼các kim loại này có thể trực tiếp tham gia trong phản ứng xúc tác, liên kết bền với các phân tử enzyme Enzyme bị mất hoạt động sau khi loại bỏ ion kim loại, tuy nhiên hoạt động có thể được phục hồi lại hoàn toàn ngay sau khi thêm ion kim loại vốn có trong phân tử của nó Một số enzyme có thể được tái hoạt hóa dưới tác dụng của các ion kim loại khác Tuy nhiên sự thay thế này thường làm thay đổi hoạt độ và tính đặc hiệu của enzyme

1.3.3 Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động

Dựa vào vai trò của trung tâm hoạt động các nhóm chức năng có thể phân thànhcác nhóm sau đây:

- Các nhóm xúc tác: là những nhóm trực tiếp tham gia trong phản ứng kết hợp với phần phân tử cơ chất bị chuyển hóa, kết hợp với cofacto

- Các nhóm tiếp xúc: kết hợp với phần cơ chất không bị chuyển hóa có vai trò tương tự dây neo buộc cơ chất lại

- Các gốc cấu tạo hay cố định: không trực tiếp kết hợp với cơ chất, nhưng tương tác với các nhóm xúc tác và tiếp xúc, cố định các gốc này trong những vị trí không gian nhất định và giữ chúng ở trạng thái hoạt động xúc tác Sự liên hệ giữatrung tâm hoạt động với phần còn lại của cơ chất được thực hiện qua gốc này

1.3.4 Sự tạo thành trung tâm hoạt động

Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn có cấu trúckhông gian tương ứng với cấu trúc của phân tử cơ chất cũng giống như ổ khóatương ứng với chìa khóa (Hình a)

Hình 1.2 Mô hình Fisher (a) và mô hình Koshland (b)

Từ đó có thể suy ra rằng enzyme có hình thể tương đối vững chắc, cố định, kết

hợp với cơ chất như một khuôn nào đó Tuy nhiên dần dần người ta thấy quan niệm của Fisher đã không giải thích thỏa đáng được nhiều dẫn liệu thực

nghiệm Đến năm 1958, Kosland đã đề ra thuyết "tương ứng cảm ứng" cho rằngphân tử enzyme cũng như trung tâm hoạt động của nó không có cấu tạo rắn chắc

mà có tính mềm dẻo, cấu hình không gian của nó có thể thay đổi khi tiếp xúc với

cơ chất¼ Theo Kosland thì trong phân tử enzyme có sẵn các nhóm định chức của trung tâm

hoạt động nhưng chúng chưa được sắp xếp ở dạng thích hợp cho hoạt động xúc

tác

Khi tương tác với cơ chất, các nhóm định chức ở phần trung tâm hoạt động của

phân tử enzyme sẽ thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể

cơ chất (Hình b) Trong trường hợp này cơ chất và enzyme có sự tương tác yếu Do

đó, chúng rất dễ bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng

Các chất có cùng kiểu cấu trúc với cơ chất thực nhưng có sự thay đổi ở một phần nào đó trong phân tử có thể vẫn kết hợp với enzyme nhưng tạo thành phứcchất không hoạt động vì các nhóm định chức của trung tâm hoạt động không được định hướng đúng đắn

Ở những enzyme alosteric (enzym dị lập thể, enzym điều hòa) còn có trung tâm

dị lập thể (trung tâm điều hòa) Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác Các cơ chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa alosteric Khi trung tâm điều hòa này tương tác với chất điều hòa alosteric sẽ làm thay đổicấu trúc không gian của trung tâm hoạt động Do đó hoạt tính xúc tác của enzyme

sẽ bị thay đổi theo

Nếu quá trình này làm tăng hoạt tính của enzyme thì chất điều hòa alosteric này gọi là chất điều hòa dương Ngược lại, nếu quá trình này làm giảm hoạt tính của enzyme thì chất điều hòa alosteric này gọi là chất điều hòa âm Chất điều hòa này hoàn toàn không bị biến đổi khi chúng tương tác với enzyme

1.4 Tính đặc hiệu của enzyme

1.4.1 Khái niệm chung

Tính đặc hiệu cao của enzyme là một trong những khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định

Sự tác dụng có tính lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của

enzyme

1.4.2 Các hình thức đặc hiệu

Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ

(hydroxyure) nhưng với vận tốc bé hơn 120 lần

Các enzyme khác như arginase, glucooxydase cũng thuộc loại có tính đặc hiệu

tuyệt đối, vì arginase chỉ xúc tác thủy phân L- arginin tạo thành L-ornitin và ure mà

Những enzym có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượngchính xác cơ chất của nó

 Đặc hiệu nhóm tương

đối

Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thànhmối liên kết đó

Ví dụ, lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiều peptide

 Đặc hiệu

nhóm

Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định với điều

kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định

Ví dụ, cacboxypeptidaza có khả năng phân cắt liên kết peptide gần nhóm

Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương

hổ

giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng

Ví dụ, lactatracemase của vi khuẩn xúc tác cho phản ứng chuyển hóa lẫn nhaugiữa axit D - và L - lactic, aldo - 1 - epimerase xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

- D - glucose thành - D - Glucose, v.v Các enzyme này có vai trò quan trọng

khi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng phương pháp hóa học, vì chúng có thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sử dụng được thành dạng có thể hấpthụ

Enzyme còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong phân tử giống nhau hoàn toàn về mặt hóa học

Ví dụ, hai nhóm - CH2OH trong phân tử glycerin, glycerophosphatkinase xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc phosphate từ ATP đến C3 của glycerin (chứ không phải C1)

1.5 Cơ chế tác dụng của enzyme

Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa Khi cơ chất kết hợp vào enzyme,

do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng củacác liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng

Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chấtxúc tác thông thường

Ví dụ, trong phản ứng phân hủy H2O2 thành H2O và O2 nếu không có chất xúctác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, nếu có chất xúc tác là platin thì năng lượng hoạt hóa là 11,7 Kcal/mol, còn nếu có enzyme catalase xúc tác thì năng lượng hoạt hóa chỉ còn 5,5 Kcal/mol

Sự tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản

phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:

và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp;

- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá

vỡ

các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng;

- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là các tương tác:

- Tương tác tĩnh điện (liên kết ion, liên kết muối, cầu muối, cặp ion): Liên kết này được tạo thành giữa nhóm tích điện của cơ chất (S) với nhóm tích điện trai sdaaus trong phân tử enzym (E)

- Liên kết hydro: Liên kết này được tạo thành theo kiểu A - H¼B, trong đó hydro kết hợp với A bằng liên kết cộng hóa trị, đồng thời tạo liên kết yếu với B Liên kết này được tạo thành khi khoảng cách giữa A và B là 3A0

- Tương tác VanderWaals: Tương tác này yếu hơn tương tác tĩnh điện và liên kết hydro Tương tác này thể hiện rất rõ khi nhiều nguyên tử của cơ chất có thể đồng thời tiếp cận với nhiều nguyên tử của enzym Nó chỉ xảy ra khi có sự ăn khớp về cấu trúc không gian giữa cơ chất và enzym

Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khácnhau khi có nước

Chương 2 ĐỘNG HỌC ENZYME 2.1 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme

Nghiên cứu động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố nồng

độ cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm¼ đến tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho ta biết được các

vấn đề sau đây:

- Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme

- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme

- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa chọn các đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng

- Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì người

ta cần phải kiểm tra về mặt lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt động của chế phẩm enzyme trong các giai đoạn tinh chế

2.2 Động học các phản ứng enzyme

2.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme

Đường biểu diễn có dạng: tốc độ phản ứng v= K[E] có dạng y=ax

Khi thừa cơ chất thì khi nồng

độ enzyme tăng vận tốc tăng Khi

nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ

cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận

tốc không thay đổi

Hình 2.1 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]

Giả sử phản ứng chỉ có một cơ chất S và tạo thành sản phẩm P, phản ứng xảy

ra như sau:

Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES

Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S

Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P

Với k1, k -1, k2 là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng

k 1[E][S] = (k -1 + k2)[ES] (2) Gọi E0 là nồng độ enzym ban đầu:

[E0] = [E] + [ES] => [E] = [E0] - [ES] (3) Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:

(k -1 + k2)[ES] = k1([E0] - [ES])[S]

k1

[S]

v = Vmax - (5)

Km + [S]

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis - Menten

Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với

cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn

Hình 2.2 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất

Khi tăng [S] thì V phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì V đạt đến giá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]

Khi Km = [S] thì V0 =1/2 Vmax

Để thuận tiện hơn Lineweaver và Burk (1934), trên cơ sở của phương trình (5)

đã nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu kìm hãm enzyme

Hình 2.3 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất

theo

Lineweaver - Burk

Tính chất phổ biến của phương trình Michelis - Menten thể hiện ở chỗ nó không chỉ dùng trong trường hợp đơn giản như đã nói ở trên (một cơ chất S tạo

thành một sản phẩm P) mà nó cũng đúng trong những trường hợp phức tạp hơn,

phản ứng gồm hai hay nhiều cơ chất tạo thành nhiều sản phẩm

2.2.3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitior)

Chất kìm hãm là chất có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme Nó có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, và cả protein

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch

2.2.3.1 Các chất kìm hãm không thuận nghịch

Chất kìm hãm (I) kết hợp với enzyme (E) tạo thành phức chất Enzyme - chất kìm hãm (EI) theo phản ứng sau:

K1E+I

K2

EI

Nếu K2 = 0 phức chất

EI hoàn toàn không phân ly Sự kìm hãm ở đây là không thuận nghịch

Dưới tác dụng của các chất kìm hãm không thuận nghịch, mức độ kìm hãm tăng theo thời gian tác dụng, nếu nồng độ chất kìm hãm đủ lớn để bão hòa

enzyme thì cuối cùng phản ứng enzyme sẽ ngừng hoàn toàn Hơn nữa khi loại bỏ chất kìm hãm hoạt tính của enzyme cũng không được phục hồi

2.2.3.2 Các chất kìm hãm thuận nghịch

Phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng tháicân bằng Dưới tác dụng của chất kìm hãm thuận nghịch, hoạt tính của enzyme cóthể được phục hồi sau khi loại bỏ chất kìm hãm

Các chất kìm hãm có thể tác dụng với enzyme theo các cách khác nhau:

 Kìm hãm cạnh tranh (Competitive

inhibition)

Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự cấu trúc của

cơ chất Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của

enzyme Chúng chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành phức ES

Ví dụ, Malonic (HOOC - CH2 - COOH) là chất kìm hãm cạnh tranh của enzyme succinatdehydrogenaza, vì nó cấu tạo gần giống với cơ chất succinic (HOOC - CH2

- CH2 - COOH)

Hình 2.4 Kiểu kìm hãm cạnh tranh (competitive inhibition)

Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại

có tác dụng kìm hãm hoàn toàn

Hình 2.5 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

theo

Lineweaver - Burk khi có kìm hãm cạnh tranh

Như vậy ta thấy khi có sự cạnh tranh, hằng số Km sẽ tăng lên, do đó làm giảm

ái lực của enzym và cơ chất

Trường hợp đặc biệt của kìm hãm cạnh tranh là kìm hãm bằng sản phẩm và xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và choán vị trí hoạt động ở phân tử enzyme

 Kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive

inhibition)

Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ kết hợp với phức chất

ES

Hình 2.6 Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh

Tác dụng kìm hãm không bị loại trừ khi tăng nồng độ cơ chất Kiểu kìm hãm này thường gặp đối với phản ứng nhiều cơ chất trong đó có sự tạo thành nhiềuphức chất trung gian khác nhau

Hình 2.7 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

động xúc tác của nó, do đó làm giảm vận độ phản ứng Vì vậy sau khi kết hợp với

chất kìm hãm này, enzyme vẫn có thể tiếp tục kết hợp với cơ chất tạo thành phứcchất

tranh

Tương tự như trên ta có phương trình :

Hình 2.9 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

Lineweaver - Burk khi có kìm hãm hỗn tạp

Các giá trị,' được định nghĩa như trên Trường hợp =' gọi là kìm hãm không cạnh tranh (noncompetitive)

Hình 2.10 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

theo

Lineweaver - Burk khi có kìm hãm không cạnh tranh

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của kiểu kìm hãm lên Vmax và Km

Trường hợp kìm hãm enzyme bằng nồng độ cao của cơ chất gọi là "kìm hãm

cơ chất" như kìm hãm urease khi nồng độ ure cao Nguyên nhân của những hiện tượng này còn chưa được biết rõ Đó có thể là:

- Tồn tại nhiều trung tâm kết hợp với cơ chất bằng các ái lực khác nhau Khi nồng độ cơ chất thấp thì enzyme có thể chỉ kết hợp với một phân tử cơ chất, còn khi ở nồng độ cơ chất cao nó kết hợp với nhiều cơ chất dẫn đến hình thành phức hợp ES không hoạt động

- Cơ chất cũng có thể được kết hợp nhờ những vị trí đặc biệt của enzyme

Đó là một nhóm enzyme quan trọng (enzyme dị lập thể) bên cạnh trung tâm xúc tác còn có trung tâm điểu chỉnh

- Cơ chất có thể kết hợp với một chất hoạt hóa và bằng cách này nó tách khỏi E

- Cơ chất có thể choán chổ (ngăn cản) một cofactor hay một coenzyme

- Cơ chất có thể ảnh hưởng đến ion lực của môi trường và qua đó làm mất

đi tính chuyên hóa của enzyme

2.2.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator)

Là chất làm tăng khả năng xúc tác của enzyme, thường có bản chất hóa học khác nhau có thể là các anion, các ion kim loại nằm ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 của Bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc hóa học khác nhau như cácvitamin tan trong nước

Ví dụ, Tác dụng của anion clo, brom, iot đến hoạt độ của a - amilaza động vật; tác dụng của một số ion kim loại như Mn2+, Zn+,¼ đối với hoạt độ của các

proteaza

Tuy nhiên tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt quá

giới hạn này có thể làm giảm hoạt tính enzyme

2.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme càng tăng khi nhiệt độ tăng, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đó khi tăng nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của protein

Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, thường ở trong khoảng từ 40-600C Tuy nhiên, mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, nóphụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn enzyme, cơ chất, pH môi trường, thời gianphản ứng¼

Nhiệt độ mà enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt tới hạn thường vào khoảng 700C Ở nhiệt độ tới hạn enzyme bị biến tính, ít ki có khả năngphục hồi Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00C hoạt tính của enzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường

Hình 2.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng

pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES

Ngoài các yếu tố chính đã nêu trên, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào những yếu tố khác: ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu âm, tia bức xạ,¼Trong hệ thống sống, hoạt tính enzyme còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởngphát triển

Chương 3 Cách gọi tên và phân loại enzyme

3.1 Cách gọi tên enzyme

Theo qui ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme thường gồm hai phần:

- Phần thứ nhất chỉ tên cơ chất (nếu có nhiều cơ chất thì tên các cơ chất cáchnhau bằng dấu hai chấm)

- Phần thứ hai chỉ tên kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, cộng thêm đuôi

"ase" hoặc "aza" Hai phần trên cách nhau bằng một dấu nối ngang

Ví dụ, tên enzyme xúc tác sự oxy hóa glycolat thành axit glyoxylic có tên là: glycolat:oxy-oxydoreductase

Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hỗ thì ngườ ta còn thêm sauphâng thứ hai của tên gọi một phần tương ứng trong dấu ngoặc

Ví dụ, enzyme xúc tác oxy hóa axit amin trong phản ứng:

COOH COOH

H2N CH + O2 C = O + NH3 + H2O

L - axitamin

có tên gọi là L - axitamin : oxydoreductase (deamin)

Ngoài ra hiện nay còn dùng tên thông dụng như amilase, papain, pepsin, Ví dụ enzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid) có:

có tên hệ thống là: Carbamid - amidohydrodase, tên thông dụng: urease

3.2 Phân loại enzyme 3.2.1

Các lớp enzyme

Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đãthống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số từ 1 đến 6 Các số thứ tự này

Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất

mà không cần nước, hoặc loại nước của phân tử tạo thành nối đôi, hoặc kết hợp nước vào nối đôi

Ví dụ, hydratase, aldolase, decarboxylase

Mỗi lớp lại chia thành nhiều tổ Mỗi tổ lại chia thành nhiều nhóm Do đó, trongbảng phân loại đứng trước tên enzym thường có bốn con số:

Ethanol + NAD+acetaldehyde + NADH + H+

có tên gọi là alcohol dehydrogenase (ADH), tên quốc tế theo khóa phân loại là: Alcohol: NAD oxydoreductase (EC 1.1.1.1), trong đó:

- mã số 1 đầu tiên biểu thị tên lớp enzyme là oxydoreductase (lớp 1)

- mã số 1 thứ hai biểu thị tổ 1: tác dụng lên nhóm CH - OH của các chất cho

- mã số 1 thứ ba biểu thị nhóm 1: chất nhận là NAD hay NADP

- mã số 1 cuối cùng chỉ số thứ tự của enzyme

Sau tên của enzyme là số của nó theo danh sách các enzyme do tiểu ban về enzyme đề ra (enzyme commission, EC)

3.2.2 Các phản ứng enzyme

3.2.2.1 Lớp enzyme oxydoreductase

Lớp enzyme này gồm 14 lớp phụ, xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử Phản ứng oxy hóa tương ứng với sự tách điện tử ra khỏi cơ chất, phản ứng khử

là phản ứng thu nhận điện tử và thường đi kèm với nhau

Quá trình tổng quát có thể biểu thị như sau:

Trong đó:

+ AKh là cơ chất A ở dạng khử

+ Aox là cơ chất A ở dạng oxy hóa

+ e là điện tử, Box là cơ chất B ở dạng oxy hóa +

BKh là cơ chất B ở dạng khử

Các enzyme thuộc lớp này là những enzyme 2 thành phần có các coenzyme như NAD+, NADP+, FMN, FAD, hem

 Dehydrogenase: xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ cơ chất và chuyển

đến NAD+, NADP+, FMN, FAD

 Oxydase: xúc tác cho quá trình chuyển điện tử đến oxy do đó hoạt hóa oxy làm

cho nó có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường

 Oxygenase: xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử của hợp

chất hữu cơ (thường là các chất có vòng thơm) Có thể phân biệt hai loại: oxygenase và hydroxylase

+ Oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp toàn bộ phân tử oxy

+ Hydroxylase chỉ kết hợp một nửa phân tử oxy (thường ở dạng OH) vào hợp chất hữu cơ

 Peroxydase: các peroxydase điển hình và catalase có coenzyme là hem, xúc tác

cho phản ứng oxy hóa các chất hữu cơ khi có H2O2

3.2.2.2 Lớp enzyme transferase

Lớp này gồm tám lớp phụ Các enzyme lớp này cũng là những protein phức tạp, bản chất hóa học của các coenzyme rất khác nhau, tùy theo bản chất của nhómđược chuyển vị như các nhóm monocarbon, nhóm alkyl, nhóm glucosyl, các nhóm có phosphore, các nhóm chứa lưu huỳnh

coenzyme A, tạo thành phức CoAS ~ acyl

 Glucosyltransferase: xúc tác cho phản ứng vận chuyển gốc đường

(hexose,

pentose) từ chất cho đến các chất nhận khác nhau, thường gặp nhất là nhóm OH của một gốc saccharide khác hoặc các gốc phosphate, nguyên tử N của nhân vòng

 Aminotransferase: các enzyme này có coenzyme là pyridoxal phosphate xúc

tác

cho phản ứng chuyển vị nhóm amin Các phản ứng quan trọng như chuyển thuậnnghịch nhóm amin của amino acid đến - cetoacid

 Phosphotransferase: xúc tác cho phản ứng vận chuyển gốc phosphoryl thường

có sự tham gia của ATP với ý nghĩa như một chất cho Gốc phosphate được chuyển từ ATP (hoặc có thể là NTP) đến nhóm hydroxyl của alcol hoặc saccharide Các enzyme này thường có tiếp vị ngữ "kinase" Ví dụ, hexokinase xúc tác cho phảnứng

Có thể

được biểu thị như sau:

Các phản ứng do enzyme lớp này xúc tác luôn có nước tham gia Đặc điểm khác là các hydrolase thường không cần coenzyme cho hoạt động xúc tác của chúng

 Amylase: xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và các

polysaccharide tương tự Có 3 loại amylase khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng đối với liên kết glucoside và một số tính chất khác

+ - amylase phân giải các liên kết 1,4 - glucoside ở giữa chuỗi mạch polysaccharide, vì vậy cũng gọi là "endo - amylase" tạo thành các dextrin phân tử thấp

+ - amylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết 1,4 - glucoside kể

từ đầu không khử tạo thành chủ yếu là maltose và dextrin phân tử lớn

+ Glucoamylase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết 1,4 - 1,6 - glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide Sảnphẩm chủ yếu được tạo thành dưới tác dụng của enzyme này là

 Peptide hydrolase: xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide tạo

thành

peptide phân tử thấp, axitamin Các peptide hydrolase khác nhau có tính đặc hiệu khác nhau đối với liên kết peptide Một số enzyme phân giải các liên kết peptide ở giữa chuỗi mạch polypeptide gọi là endopeptide hydrolase hay proteinase (pepsine, trypsin, chimotrypsin ); một số khác lại thủy phân các liên kết ở đầu mút của chuỗi mạch, gọi là exopeptide hydrolase hay peptidase

 Lipase: xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động

vật) tạo thành các acid béo tự do và glycerol (thủy phân lần lượt từng liên kết este) 3.2.2.4 Lớp enzyme lyase

Lớp enzyme này gồm 5 lớp phụ, tác động vào các liên kết C - C, C - O, C - N,

C - S, C - Halogen Có thể biểu thị như sau:

 Pyruvat decarboxylase: xúc tác cho phản ứng loại CO2 khỏi phân tử axit

pyruvic, tạo thành aldehyde tương ứng là acetaldehyde Coenzyme của nó là thiamine pyrophosphase

 Fumarathydratase: xúc tác cho phản ứng tách thuận nghịch phân tử H2O khỏi

axit malic, tạo thành axit fumaric (có một nối đôi)

3.2.2.5 Lớp enzyme isomerase

Lớp enzyme gồm 5 lớp phụ, trong quá trình này có sự sắp xếp lại trong phân tử

cơ chất Có thể biểu thị như sau:

 UDP - glucose - 4 - epimerase: xúc tác cho sự chuyển hóa tương hỗ phức

tạp

giữa galactose và glucose, tức là làm xoay nhóm OH xung quanh nguyên tử carbon ở

ứng:

3.2.2.6 Lớp enzyme ligase

Lớp enzyme này có 4 lớp phụ và chúng thường tạo nên các liên kết C - O, C - S,

C - N, C - C

Các enzyme ligase xúc tác cho việc tạo thành aminoacyl - tRNA từ amino acid

và tRNA ở giai đoạn đầu tiên trong sự sinh tổng hợp protein Ngoài ra chúng cònxúc tác cho sự sinh tổng hợp amiono axit, tạo ra những dẫn chất acyl - CoA

 Pyruvatcarboxylase: xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa axit pyruvic acid tạo

thành axit oxaloacetic Enzyme này có chứa nhóm phụ là biotin, cần acetyl - CoA và

Mg++ cho phản ứng xúc tác

Chương 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME 4.1 Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme