choosing microorganisms for industrial microbiology

Nhiệm vụ đầu tiên cho một nhà VSV học công nghiệp là việc tìm thấy một loài vi sinh vật phù hợp, để sử dụng trong các quá trình mong muốn.Một loạt các phương pháp tiếp cận đã có sẵn như:

MINISTRY OF INDUSTRY AND TRADE

HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF FOOD INDUSTRY

FACULITY OF BIOTECHNOLOGY AND ENVIRONMENTAL ENGINEERING

MICROBIOLOGY

Chapter 42:

Students: Group 16 Lecture: Quynh Mai, Nguyen Thi

Ho Chi Minh City, December, 2013

Choosing Microorganisms for Industrial Microbiology and Biotechnology

Choosing Microorganisms for

Industrial Microbiology and Biotechnology

II Thao tác di truyền trên vi sinh vật (Genetic Manipulation of Microorganisms)

II Thao tác di truyền trên vi sinh vật (Genetic Manipulation of Microorganisms)

III Bảo quản vi sinh vật (Preservation of Microorganisms)

I. Tìm kiếm VSV trong tự nhiên (Finding Microorganisms in Nature)

I. Tìm kiếm VSV trong tự nhiên (Finding Microorganisms in Nature)

Nhiệm vụ đầu tiên cho một nhà VSV học công nghiệp là việc tìm thấy một loài vi sinh vật phù hợp, để sử dụng trong các quá trình mong muốn.

Một loạt các phương pháp tiếp cận đã có sẵn như: phân lập VSV từ môi trường đến việc

sử dụng kỹ thuật phân tử tinh vi để sửa đổi một VSV hiện có.

Nhiệm vụ đầu tiên cho một nhà VSV học công nghiệp là việc tìm thấy một loài vi sinh vật phù hợp, để sử dụng trong các quá trình mong muốn.

Một loạt các phương pháp tiếp cận đã có sẵn như: phân lập VSV từ môi trường đến việc

sử dụng kỹ thuật phân tử tinh vi để sửa đổi một VSV hiện có.

LỰA CHỌN LOÀI VSV CHO VSV CÔNG

NGHIỆP VÀ CNSH

Lời mở đầu

I Tìm kiếm VSV trong tự nhiên

(Finding Microorganisms in Nature)

Trái cây hỏng

ái cây

Bánh Mì

Nước

Đất

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật để sử dụng trong công nghiệp vi sinh vật

TỰ NHIÊN

I Tìm kiếm VSV trong tự nhiên (Finding Microorganisms in Nature)

VSV học ngày càng phát triển,các loài VSV được khám phá nhiều hơn với những đặc tính hữu ích và ứng dụng tộng rãi trong công nghiệp vi sinh và công nghệ sinh học

Các VSV tham gia vào các mối quan hệ tương hỗ và có sự hợp tác sơ khai với các VSV khác, cả với thực vật và động vật bậc cao

Các phản ứng sinh học vẫn đang tiếp tục được chú trọng trong mọi lĩnh vực , việc tổ chức nghiên cứu ra các tiềm năng mới đang được phổ biến

Loài Ước tính tổng số loài Số loài đã biết %

Môi trường Ước tính phần trăm nuôi cấy

Chèn chuỗi DNA

ngắn Nội dung chính

II Thao tác di truyền trên vi sinh vật

(Genetic Manipulation of Microorganisms)

II Thao tác di truyền trên vi sinh vật

(Genetic Manipulation of Microorganisms)

www.themegallery.com Company Logo

II.1 Đột biến (Mutation)

1943, chủng Penicillium chrysogenum được phân lập là NRRL

1951-đã được cải thiện hơn thông qua đột biến.

Môi trường nuôi cấy đầu tiên của Penicillium notatum, có thể được phát triển trong những điều kiện tĩnh, mang lại nồng độ Penicillin thấp.

Một loạt các kỹ thuật có thể được sử dụng để cải thiện môi trường nuôi cấy (chất gây đột biến hóa học và tia cực tím)

Hình 42.1 Đột biến làm tăng năng suất lên men.

Tác nhân g ây đột biến

Tác nhân g ây đột biến

Vật lý (nhiệt độ, tia X, UV,

….)

Hóa học (5BU, consisin, nicotine,

dioxine,…) Hóa học (5BU, consisin, nicotine,

dioxine,…)

II.2 Sự dung hợp tế bào trần

II.2 Phân loại

Sử dụng rộng rãi ở nấm men và nấm

mốc

Chất tái tổ hợp mong muốn được xác định

bằng các phương tiện kỹ thuật cấy ria chọn

lọc

VSV SS vô tính làm giảm cơ hội của ĐB ngẫu nhiên có thể dẫn đến chủng thoái hóa

Protoplasts sau đó được tái

sinh sử dụng, giúp ổn định

thẩm thấu như sucrose.

protoplasts được tổng hợp bằng cách phát triển tế bào trong một dung dịch đẳng trương trong khi

xử lý chúng với enzym, bao gồm cellulase và beta-galacturonidase

www.themegallery.com Company Logo

II.2 Sự dung hợp tế bào trần

- Sau khi tế bào tái sinh, sản phẩm chất nguyên sinh phản ứng tổng hợp mới có thể được sử dụng trong nghiên cứu tiếp theo.

- Một lợi thế lớn của kỹ thuật thể nguyên sinh kết hợp tế bào trần là protoplasts của các loài

vi sinh vật khác nhau có thể được hợp nhất, ngay cả khi chúng không liên kết chặt chẽ phân loại học.

Ví dụ, protoplasts của Penicillium roquefortii đã được hợp nhất với P chrysogenum Thậm chí protoplasts và hồng cầu có thể được hợp nhất.

II.3 Chèn chuỗi DNA ngắn

Độ dài ngắn của các trình tự ADN được tổng hợp có thể được chèn vào các vi sinh vật bởi quá trình đột biến

Điều này có thể tạo ra sự thay đổi di truyền nhỏ dẫn đến sự thay đổi của 1 hoặc 1 số aa trong

protein

Thay đổi aa nhỏ đã được tìm thấy, trong nhiều trường hợp, những thay đổi bất ngờ trong các đặc tính protein đã tạo ra các sản phẩm mới như các E đề kháng với môi trường hơn và các E có thể kích thích phản ứng mong muốn

Các phương pháp tiếp cận này là một phần trong lĩnh vực công nghệ protein.

Tạo ra các enzyme và peptide hoạt

tính sinh học với các đặc tính khác

nhau (sự ổn định, động lực học, các

hoạt động)

Một trong những điểm nổi bật nhất

là việc tạo ra các vùng enzyme đặc hiệu hoạt động để thúc đẩy việc sửa đổi "chất không tự nhiên."

Có thể dẫn đến cải thiện chuyển đổi nguyên liệu bắt buộc, hay thậm chí là sự suy thoái của các

nguyên liệu mà trước đó không được tuân theo quá trình sinh học

II.4: Chuyển giao thông tin di truyền giữa các sinh vật khác nhau

Sinh tổ hợp

* Là quá trình sử dụng vi sinh vật tổng hợp nên các hợp chất có đặc tính như mong muốn.

• Việc chuyển giao axit nucleic giữa các sinh vật khác nhau là một phần của sinh học tổ hợp phát triển mạnh.

• Điều này liên quan đến việc chuyển gen để tổng hợp của một sản phẩm cụ thể từ một sinh vật vào nhau, đưa ra các khả năng tiếp nhận khác nhau như tăng công suất tiến hành sự suy thoái hydrocarbon

Ví dụ

* Việc tạo ra các "superbug“, bằng sáng chế của AM Chakarabarty (1974), trong đó có một khả

năng gia tăng sự suy thoái hydrocarbon Các gen để sản xuất có thể được chuyển giao cho một vi sinh vật sản xuất khác, hoặc thậm chí đến một vi sinh vật không sản sinh kháng sinh.

* Hay các gen tổng hợp của bialophos (một loại thuốc kháng sinh diệt cỏ) đã được chuyển giao từ Streptomyces hygroscopicusto vào S lividans.

* Ví dụ khác ở creatininase enzyme của E coli, từ Pseudomonas putida sản xuất pediocin, một

bacteriocin, trong một men được SD trong quá trình lên men rượu với mục đích kiểm soát

chất gây ô nhiễm rượu nhờ vi khuẩn.

E coli Giới thiệu các gen từ lớp Klebsiella pneumoniae DHA sang vi

khuẩn E coli có thể thực hiện kỵ khí sản xuất 1,3-propanediol.

Cephalosporin precursor

synthesis

Penicillium chrysogenum Sản xuất 7-ADC and 7-ADCAatiền thân do sự sát nhập của gen

expandase của Cephalosoporin acremonium vào chuyển đổi

Penicilliumby.

Bảng 42.3 :Sinh học tổ hợp CNSH: Các biểu hiện của gen trong các loài sinh vật khác để cải thiện quy trình và sản phẩm

SX axit lactic Saccharomyces cerevisiae Một loài bò bắp thịt lactate gen dehydrogenase (LDH-A) thể hiện trong S

cerevisiae 95% chuyển đổi xylitol từ xylose thu được bằng cách chuyển gen

XYLI của Pichia stipitis một reductase xylose vào S cerevisiae, làm cho vi sinh

vật này một sinh vật hiệu quả để sản xuất xylitol, dùng làm chất tạo ngọt trong ngành công nghiệp thực phẩm.

SX xylitol S cerevisiae

Creatininase E coli Biểu hiện của gen creatininase từ Pseudomonas putida R565 Gen đưa vào bằng

một vector pUC18

Pediocin S cerevisiae Sự biểu hiện của bacteriocin từ Pediococcus acidilactici trong S cerevisiaeto ức

chế chất gây ô nhiễm rượu

SX

Acetone và butanol

Clostridium acetobutylicum Giới thiệu một vector vận chuyển C acetobutylicum bằng sự cải thiện chuỗi vận

chuyển điện tử và kết quả trong acetone và hình thành butanol

Biểu hiện DNA trong các sinh vật khác nhau có thể nâng cao hiệu quả sản xuất và giảm

thiểu các bước tinh chế cần thiết trước khi sản phẩm sẵn sàng để sử dụng.

 Một loạt các thông tin di truyền cũng có thể được chèn vào các vi sinh vật bằng sử dụng các vector và kỹ thuật tái tổ hợp DNA.

 Vector bao gồm nhiễm sắc thể nhân tạo chẳng hạn như đối với nấm men (YACs), vi khuẩn (BACS), nhiễm sắc thể vi khuẩn P1 có nguồn gốc từ (PAC), và nhiễm sắc thể nhân tạo từ động vật có vú (MAC) YACs đặc biệt có giá trị bởi vì trình tự DNA lớn (trên 100 kb) có thể được duy trì trong YAC như một nhiễm sắc thể riêng biệt trong tế bào nấm men.

 Chuyển giao thông tin di truyền cho phép SX các protein và peptide bởi các sản phẩm tương tự có thể được tổng hợp trong cơ thể ban đầu Cách tiếp cận này có thể làm giảm thời gian

và chi phí phục hồi và làm sạch SP Đặc trưng này là cần thiết để tránh các tác dụng phụ có hại

có thể có của phân lập bất hoạt, như đã xảy ra trong thảm họa thalidomide.

 Một ví dụ của việc SD vector cung cấp bởi các loại VK gây bệnh lở mồm long móng ở gia

súc Thông tin di truyền ở chân và miệng do bệnh vi-rút kháng nguyên có thể đưa vào VK E

coli, sau đó là thể hiện thông tin này di truyền và tổng hợp SP gen để SD trong SX vắc xin

Hình 42.2 tái tổ hợp sản xuất vắc xin Gen mã hóa cho các sản phẩm mong muốn có thể được thể hiện trong các sinh vật khác nhau Bằng

cách sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, vắc-xin lở mồm long móng được sản xuất thông qua nhân bản gen vaccine trong Escherichia coli

Hình 42.2 tái tổ hợp sản xuất vắc xin Gen mã hóa cho các sản phẩm mong muốn có thể được thể hiện trong các sinh vật khác nhau Bằng

cách sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, vắc-xin lở mồm long móng được sản xuất thông qua nhân bản gen vaccine trong Escherichia coli

 Ngoài việc đưa các gen mới vào các sinh vật, ta còn có thể thay đổi quy chế gen bằng cách thay đổi phiên mã gen, tổng hợp protein, tạo quảng bá lai, và loại bỏ các quy chế kiểm soát thông tin phản hồi

 Những cách tiếp cận này làm cho nó có thể sản xuất thừa một loạt các sản phẩm, (bảng 42.4).

 Một ví dụ khác, gen để tổng hợp các actinorhodin kháng sinh đã được chuyển giao vào sản xuất các chủng khác kháng sinh, dẫn đến việc sản xuất hai loại thuốc kháng sinh do cùng một tế bào.

II.5 Sửa đổi biểu hiện gen

Sản phẩm Vi sinh vật Kiểu sửa đổi

Actinorhodin Streptomyces coelicolor thay đổi quá trình phiên mã của gen

Cellulase Clostridium genes in Bacillus Khuếch đại của bài tiết thông qua khuếch đại DNA nhiễm sắc

thể Recombinant protein

albumin

Saccharomyces cerevisiae Fusion với việc SX một loại cao protein

Heterologous protein Saccharomyces cerevisiae Sử dụng cảm ứng promoter lai mạnh mẽ UASgal/ CYC

Enhanced growth ratea Aspergillus nidulans Sản xuất quá mức glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Amino acidsb Corynebacterium Phân lập gen sinh tổng hợp dẫn đến tăng cường các hoạt động

enzyme hoặcloại bỏ các quy chế thông tin phản hồi

Bảng 42.4 : Ví dụ về các hệ thống tái tổ hợp DNA sử dụng để sửa đổi biểu hiện gen

 Cách tiếp cận này, biểu hiện của gen thay đổi cũng có thể được sử dụng để làm thay đổi con đường chuyển hóa bằng cách khử hoạt hoặc bãi bỏ quy định những gene đặc biệt, đó là con đường kiến trúc (hình 42.3)

Cách thay thế có thể được sử dụng để thêm ba nhóm chức năng vào một phân tử Cách tiếp

cận này đã được sử dụng để cải thiện sản lượng penicillin bằng kĩ thuật chuyển hóa(MPE).

II.5 Sửa đổi biểu hiện gen

Hình 42.3: Con đường kiến trúc, một yếu tố quan trọng trong kĩ thuật chuyển hóa

Các bước thay thế bổ sung của ba nhóm chức năng cho một bộ xương hóa chất cơ bản, có thể có hiệu quả khác nhau, và rất quan trọng để lựa chọn sự kết hợp hiệu quả nhất giữa các bước enzyme hoặc con đường để mang lại sản phẩm mong muốn.

E1 → E12 enzyme khác nhau; P: các sản phẩm trung gian sau khi việc bổ sung các nhóm chức năng đầu tiên và thứ hai, và FP: sản phẩm cuối cùng.

Các bước thay thế bổ sung của ba nhóm chức năng cho một bộ xương hóa chất cơ bản, có thể có hiệu quả khác nhau, và rất quan trọng để lựa chọn sự kết hợp hiệu quả nhất giữa các bước enzyme hoặc con đường để mang lại sản phẩm mong muốn.

E1 → E12 enzyme khác nhau; P: các sản phẩm trung gian sau khi việc bổ sung các nhóm chức năng đầu tiên và thứ hai, và FP: sản phẩm cuối cùng.

Một cải tiến gần đây là việc sử dụng các biểu hiện biến đổi gen để sản xuất biến thể của erythromycin kháng sinh Ngăn chặn các bước

sinh hóa riêng trong con đường cho sự tổng hợp của một tiền thân của kháng sinh dẫn đến sản phẩm cuối cùng bị sửa đổi Những sản phẩm bị thay đổi, trong đó có cấu trúc hơi khác nhau, có thể được thử nghiệm cho hiệu năng chống vi thể của nó

Một cải tiến gần đây là việc sử dụng các biểu hiện biến đổi gen để sản xuất biến thể của erythromycin kháng sinh Ngăn chặn các bước

sinh hóa riêng trong con đường cho sự tổng hợp của một tiền thân của kháng sinh dẫn đến sản phẩm cuối cùng bị sửa đổi Những sản phẩm bị thay đổi, trong đó có cấu trúc hơi khác nhau, có thể được thử nghiệm cho hiệu năng chống vi thể của nó

Hình 42.4 Kỹ thuật chuyển hóa để tạo kháng sinh thay đổi

- Tạo ra khả năng trao đổi chất mới cho một VSV, trong đó sử dụng đột biến

evolutionandadaptive cưỡng bức.

- Đây là quá trình sử dụng áp lực môi trường cụ thể để "buộc" vi sinh vật biến đổi và thích ứng,

do đó tạo ra các vi sinh vật với khả năng sinh học mới.

- Các cơ chế của các quá trình đột biến thích nghi bao gồm sắp xếp lại DNA, trong đó yếu tố chuyển vị và các loại tái tổ hợp đóng vai trò quan trọng (bảng 42.5).

II.6 Kỹ thuật di truyền tự nhiên

Bảng 42.5: Hệ thống kỹ thuật di truyền tự nhiên ở VK

Cơ chế kỹ thuật di truyền Thay đổi DNA trung gian

Đột biến địa hóa SOS Sự thay thế cơ bản, khung

Sự xê dịch khung thích nghi Sự xê dịch khung

Tn5, Tn9, TN10 cắt bỏ chính xác Tái tổ hợp đối ứng của sườn 8/9 lặp đi lặp lại bp; phục hồi trình tự ban

Tái tổ hợp topoisomerase loại 2 Xóa và hợp nhất bằng sự tái tổ hợp không tương đồng, đôi khi lặp đi

Các yếu tố chuyển vị (nhiều loài) Chèn, chuyển vị, hợp nhất đơn vị sao chép, xóa liền kề / cắt xén, liền kề

inversionsby thắt của 3 'OH transposon kết thúc 5' nhóm PO4 từ cắt giảm lảo đảo tại các địa điểm mục tiêu không tương đồng

Sự hấp thu DNA (khả năng chuyển đổi) Hấp thụ độc lập dải đơn của chuỗi, hoặc sợi đôi DNA mang loại chuỗi

nhận dạng

III Bảo quản VSV

Chuyển chu kỳ Biến chuyển định kỳ nuôi cấy mới bao gồm tần số chuyển nhượng, vừa sử

dụng, và giữ nhiệt độ, điều này có thể dẫn đến tỷ lệ đột biến tăng và sản lượng của các biến thể

Mặt nghiêng dầu khoáng Một môi trường nuôi cấy gốc được trồng trên một dốc và bao phủ bởi dầu

khoáng vô trùng; nghiêng có thể được bảo quản ở nhiệt độ tủ lạnh

Nhiệt độ tối thiểu, nước cất,

hoặc môi trường thạch nước

Môi trường nuôi cấy rửa được lưu trữ trong tủ lạnh, những nuôi trường nuôi cấy có thể khả thi cho 3-5 tháng hoặc lâu hơn

Bảng 42.6 Phương pháp sử dụng để bảo quản môi trường nuôi cấy VSV có ích cho Công nghiệp VSV

và CNSH

Đông lạnh Không bền, có thể gây hại cho các cấu trúc vi sinh vật, với một số vi sinh vật, tuy

nhiên, điều này có thể là một công cụ hữu ích duy trì nuôi cấy

Phơi khô Môi trường nuôi cấy được sấy khô trên đất vô trùng (cổ phiếu đất), trên đĩa giấy

lọc vô trùng, hoặc trong gelatin giọt; này có thể được lưu trữ trong một bình hút

ẩm ở nhiệt độ lạnh, hoặc đông lạnh để cải thiện khả năng tồn tại

Đông khô (lyophilization) Nước được loại bỏ bằng cách thăng hoa, trong sự hiện diện của một đại lý

cryoprotective; niêm phong trong một ampule có thể dẫn đến khả năng tồn tại lâu dài, với 30 năm đã được thông báo

Ultrafreezing Nitơ lỏng ở -196 ° C được sử dụng, và nuôi trường nuôi cấy của các vi sinh vật

khó tính đã được bảo tồn trong hơn 15 năm