Nghiên cứu quy trình sản xuất 3 chế phẩm tắm từ dược liệu

Do đó, việc nghiên cứu về các tính chất dược liệu, trị liệu dựa trên bài thuốc tắm cổ truyền của người dân tộc đang được công ty rất quan tâm và chú trọng nhằm đáp ứng được nhu cầu chăm

SỞ KẾ HOẠCH VÀ ĐẦU TƯ TỈNH LÀO CAI CÔNG TY CỔ PHẦN KINH DOANH CÁC SẢN PHẨM BẢN ĐỊA

SAPA (SAPA NAPRO JSC.)

BÁO CÁO ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT 3 CHẾ PHẦM TẮM TỪ DƯỢC LIỆU

2 Chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Đức Ngà

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Công ty CP KD các SP Bản địa Sa Pa

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Khoa học và Công nghệ

5 Thư ký đề tài:

6 Phó chủ nhiệm đề tài hoặc Ban chủ nhiệm đề tài

7 Danh sách những người thực hiện chính:

nhiệm ĐT

2 Ông Lý Láo Lở Công ty Sapa Napro

3 PGS.TS Nguyễn Tất Cảnh Trường ĐH Nông nghiệp

Hà Nội

4 PGS.TS Nguyễn Thượng Dong Nguyên Viện Dược liệu

5 TS Nguyễn Thị Phương Thảo Viện Sinh học Nông nghiệp

–ĐHNNHN

6 KS.Nguyễn Văn Phúc Hội Nông dân tỉnh Lào Cai

9 ThS Hoàng Văn Lâm Trường ĐH Dược Hà Nội

11 DS Phạm Hà Thanh Tùng Trường ĐH Dược Hà Nội

12 DS Nghiêm Đức Trọng Trường ĐH Dược Hà Nội

8 Các đề tài nhánh: không có

9 Thời gian thực hiện đề tài: Tháng 9/2008-2/2011 (gia hạn thêm 3

tháng)

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN III Dược điển Việt Nam 3

ĐHNNHN Đại học nông nghiệp Hà Nội

GC/MS Sắc ký khí kết hợp khối phổ

HNIP Phòng tiêu bản của Trường Đại học Dược Hà Nội

NCCT Người cung cấp thông tin

NCCT Người cung cấp tin

NSNN Ngân sách nhà nước

OECD

PRA Đánh giá nông thôn có sự tham gia của người dân

(Partcipatory Rural Appraisal)

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 CÁCH TIẾP CẬN CỦA DỰ ÁN 9

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.2.1 Nghiên cứu xác định dược liệu tiêu chuẩn để sản xuất 3 chế phẩm 9

2.2.2.3 Nghiên cứu tiêu chuẩn của nguyên liệu dược liệu “đầu vào” để sản xuất 3 chế phẩm 22

2.2.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm 22

2.2.2.1 Pha chế sản phẩm tắm và ngâm chân 22

2.2.2.2 Pha chế sản phẩm xông hơi 24

2.2.3 Nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của các chế phẩm 25

2.2.3.1 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm tắm thư giãn trên mô hình thử nghiệm dược lý 25

2.2.3.3 Khảo sát tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm xông hơi 31

2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, khối lượng cho 3 loại sản phẩm 32

2.2.4.2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và sản xuất chế phẩm 35

2.2.4.3 Xây dựng mẫu mã, đăng ký thương hiệu sản phẩm 36

2.2.4.4 Sản xuất thử nghiệm ở quy mô pilot và sản xuất đại trà 36

2.2.4.5 Phát triển và triển khai sản xuất chế phẩm mục tiêu 37

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯỢC LIỆU TIÊU CHUẨN ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM 38

3.1.1 Danh mục các cây thuốc tắm được dân tộc Dao đỏ Sa Pa sử dụng 38

3.1.2 Danh mục các cây thuốc có mùi thơm được dân tộc Dao đỏ Sa Pa

sử dụng với tác dụng xông hơi 54

3.1.3 Tình trạng bảo tồn của các cây thuốc tắm của người Dao đỏ ở Sa Pa 57

3.1.4 Trữ lượng các loại cây thuốc tắm và xông hơi chính 60

3.2 NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM TẮM THƯ GIÃN DAO’SPA RELAX 61

3.2.1 Đặc điểm của thành phẩm 61

3.2.2 Nguyên phụ liệu 62

3.2.3 Quy trình sản xuất 62

3.2.3.1 Chuẩn bị 62

3.2.3.2 Cân nguyên liệu 62

3.2.3.3 Làm cao lỏng dược liệu 63

3.2.3.4 Loại tạp 65

3.2.3.5 Pha chế: 65

3.2.3.6 Đóng lọ và hoàn thiện 66

3.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu và chế phẩm 67

3.2.4.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu 67

3.2.4.2 Tiêu chuẩn thành phẩm 69

3.2.5 Thử nghiệm tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm 70

3.2.5.1 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm tắm thư giãn trên mô hình thử nghiệm dược lý 70

3.2.6 Khảo sát tác dụng của sản phẩm trên người tình nguyện 73

3.2.6.1 Điều kiện thử nghiệm: 73

3.2.6.2 Các chỉ tiêu sức khỏe ảnh hưởng sau khi dùng chế phẩm: 82

6.2.6.3 Sự thay đổi trạng thái tinh thần và thể chất 86

3.3 NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM NGÂM CHÂN SALUS RELAXO 93

3.3.1 Danh mục các cây thuốc ngâm chân 93

3.3.2 Thành phần hoá học các cây thuốc ngâm chân 93

3.3.3 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm nước ngâm chân 95

3.3.3.1 Đặc điểm thành phẩm 95

3.3.3.2 Nguyên phụ liệu 95

3.3.3.3 Quy trình sản xuất 96

3.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu và chế phẩm 101

3.3.4.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu 101

3.3.5 Thử nghiệm tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên mô hình thử nghiệm dược lý 104

3.3.6 Khảo sát tác dụng của chế phẩm trên người tình nguyện 107

3.4 NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM XÔNG HƠI 111

3.4.1 Lựa chọn các loài đưa vào sản phẩm xông hơi 111

3.4.2 Thành phần hoá học các cây thuốc xông hơi 112

3.4.3 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm xông hơi 115

3.4.3.1 Đặc điểm thành phẩm: 115

3.4.3.2 Nguyên phụ liệu 115

3.4.3.3 Quy trình sản xuất 116

3.4.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu và chế phẩm 118

3.4.4.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu 118

3.4.4.2 Tiêu chuẩn thành phẩm 119

3.4.5 Thử nghiệm tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên người tình nguyện 120

3.4.5.1 Kết quả thử tính kích ứng da của chế phẩm 120

3.4.5.2 Khảo sát tác dụng của chế phẩm trên người tình nguyện 121

3.5 SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM 124

3.5.1 Xây dự ng mẫu mã, đăng ký thương hiệu sản phẩm 124

3.5.1.1 Sản phẩm tắm sảng khoái 124

3.5.1.2 Sản phẩm ngâm chân 124

3.5.1.3 Sản phẩm xông hơi 125

3.5.2 Phát triển và triển khai sản xuất chế phẩm mục tiêu 125

3.5.2.1 Sản phẩm tắm Dao’Spa Relax 125

3.5.2.1 Sản phẩm Salus Relaxo 125

3.5.2.1 Sản phẩm xông hơi 125

PHẦN 4 KẾT LUẬN 126

4.1 Về các dược liệu để sản xuất 3 chế phẩm từ các dược liệu của bài thuốc 126

4.1.1 Dược liệu để sản xuất chế phẩm tắm Dao’Spa Relax 126

4.1.2 Dược liệu để sản xuất chế phẩm ngâm chân Salus Relaxo 126

4.1.3 Dược liệu để sản xuất chế phẩm xông hơi 126

4.2 Về qui trình sản xuất 3 chế phẩm 127

4.2.1 Qui trình sản xuất chế phẩm tắm Dao’Spa Relax 127

4.2.2 Quy trình sản xuất chế phẩm tắm Dao’Spa Relax từ cao lỏng (Cao lỏng 1) 129

4.2.3 Qui trình sản xuất chế phẩm Xông hơi 132

4.3 Về tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu và 3 chế phẩm 132

4.3.1 Tiêu chuẩn sơ sở của nguyên liệu và chế phẩm tắm Dao’Spa Relax 132

4.3.2 Tiêu chuẩn sơ sở của nguyên liệu và chế phẩm ngâm chân Salus Relaxo 133

4.3.3 Tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu và chế phẩm xông hơi 133

4.4 Về tính an toàn và hiệu lực của 3 chế phẩm 133

4.4.1 Tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm tắm Dao’Spa Relax 133

4.4.2 Tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm ngâm chân Salus Relaxo 134

4.4.3 Tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm xông hơi 134

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các máy móc, thiết bị dùng trong sản xuất chế phẩm tắm và

ngâm chân 22

Bảng 2.2 Máy móc, thiết bị dùng trong sản xuất chế phẩm xông hơi 24

Bảng 3.1: Danh mục các cây thuốc được người Dao đỏ Sa Pa sử dụng trong bài thuốc tắm (Xếp theo tên khoa học) 38

Bảng 3.2: Đa dạng sinh học của cây thuốc tắm theo các ngành thực vật 46

Bảng 3.3: Danh mục các họ cây thuốc tắm (xếp theo thứ tự tên họ) 47

Bảng 3.4 Danh mục các chi cây thuốc tắm (xếp theo thứ tự tên chi) 49

Bảng 3.5: Các dạng sống của cây thuốc tắm của người Dao đỏ 52

Bảng 3.6: Đa dạng theo bộ phận sử dụng 53

Bảng 3.7: Đa dạng theo cách dùng 53

Bảng 3.8: Công dụng của các cây thuốc được người Dao đỏ sử dụng 54

Bảng 3.9 Danh mục các cây thuốc được đồng bào dân tộc Dao đỏ Sa Pa sử dụng để xông hơi (Xếp theo tên khoa học) 55

Bảng 3.10: Các cây thuốc tắm và xông hơi có mức độ ưu tiên bảo tồn ≥ 10 ở Sa Pa (Sắp xếp theo thứ tự ĐBT giảm dần) 59

Bảng 3.11: Trữ lượng các cây thuốc tắm khai thác để phát triển các sản phẩm Dao’spa 60

Bảng 3.12: Danh mục các nguyên liệu dùng sản xuất chế phẩm tắm sảng khoái 62

Bảng 3.13: Công thức sản xuất chế phẩm tắm sảng khoái 63

Bảng 3.14: Danh mục các nguyên phụ liệu pha chế chế phẩm tắm sảng khoái 65

Bảng 3.15: Tác dụng của dịch chiết Relax trên tim ếch nguyên vẹn 71

Bảng 3.16: Tác dụng của dịch chiết Relax nồng độ 0,5% trên cơ trơn thành mạch thỏ 71

Bảng 3.17 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn số cơn quặn đau của các

lô chuột thử nghiệm 72

Bảng 3.18 Kết quả độ kích ứng da của chế phẩm tắm Relax 73

Bảng 3.19 Tỷ lệ mắc các triệu chứng cấp tính 74

Bảng 3.20 Tỷ lệ mắc các bệnh mạn tính 75

Bảng 3.21: Mối liên hệ giữa nhiệt độ không khí trong phòng tắm với nhiệt độ nước tắm 79

Bảng 3.22: Mối liên hệ giữa thời gian tắm với cảm giác trong khi tắm 82

Bảng 3.23 Phân bố các khoảng thay đổi nhịp tim 83

Bảng 3.24: Phân bố các khoảng thay đổi huyết áp tối đa 84

Bảng 3.25 Phân bố các khoảng thay đổi huyết áp tối thiểu 85

Bảng 3.26 Phân bố khoảng thay đổi điểm số trạng thái tinh thần 86

Bảng 3.27 Phân bố khoảng thay đổi trạng thái thể chất 87

Bảng 3.28 Mối liên hệ của nồng độ thuốc tắm và các chỉ tiêu sức khỏe 89

Bảng 3.29 Mối liên hệ giữa thời gian tắm và các chỉ tiêu sức khỏe 90

Bảng 3.30: Mối liên hệ của nhiệt độ nước tắm đến chỉ tiêu sức khỏe 91

Bảng 3.31 Mối liên hệ giữa cảm giác trong khi tắm với sự thay đổi trạng thái tinh thần và thể chất sau khi tắm 92

Bảng 3.32: Định tính các nhóm chất chính của cây thuốc trong sản phẩm ngâm chân 94

Bảng 3.33: Danh mục các nguyên liệu dùng sản xuất chế phẩm ngâm chân 96

Bảng 3.34: Công thức sản xuất chế phẩm ngâm chân 96

Bảng 3.35: Danh mục các nguyên phụ liệu pha chế chế phẩm ngâm chân 99

Bảng 3.36: Tác dụng của Salus Relaxo trên tĩnh mạch tai thỏ 104

Bảng 3.37 Tác dụng của chế phẩm Salus Relaxo trên các chủng vi khuẩn và vi nấm 105

Bảng 3.38 Độ kích ứng da của chế phẩm ngâm chân Salus Relaxo 107

Bảng 3.39 Tỷ lệ mắc các bệnh mãn tính 108

Bảng 3.40 Các biểu hiện xuất hiện trong và sau khi ngâm chân 109

Bảng 3.41 Điểm số đo mức độ hài lòng của khách hàng đối với chế phẩm 109

Bảng 3.42: Sự thay đổi huyết áp, nhịp tim trước và sau khi ngâm chân 110

Bảng 3.43 Kết quả định lượng hàm lượng tinh dầu lá Chùa dù, lá Ngồng lải, thân Pơ mu 112

Bảng 3.44 Các thành phần trong tinh dầu lá Chùa dù Sa Pa 113

Bảng 3.45 Các thành phần trong tinh dầu lá Ngồng lải 114

Bảng 3.46 Các thành phần trong tinh dầu thân Pơ mu 115

Bảng 3.47 Danh mục các nguyên liệu dùng sản xuất các chế phẩm xông hơi 115

Bảng 3.48 Công thức pha chế chế phẩm xông hơi 116

Bảng 3.49 Kết quả thử kích ứng da của chế phẩm xông hơi pha chế thử nghiệm 120

Bảng 3.50: Các thông số theo dõi của mẫu nghiên cứu trước và sau xông hơi 121

Bảng 3.51: Các thông số theo dõi của mẫu nghiên cứu trước và sau xông hơi của 2 nhóm dùng chế phẩm và đối chứng 122

Bảng 3.52: Sự khác nhau giữa các thông số theo dõi của 2 nhóm nghiên cứu 123

Bảng 3.52 Giá trị các thông số theo dõi trên đối tượng Nam và nữ đối với 2 nhóm nghiên cứu 123

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Sơ đồ logic của dự án 10

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí các ô tiêu chuẩn 13

Hình 2.3: Quy trình sản xuất các sản phẩm tắm và ngâm chân 23

Hình 2.4 Sơ đồ các bước pha chế tinh dầu 24

Hình 3.1: Quy trình chiết xuất cao lỏng cho sản xuất sản phẩm tắm sảng khoái 64

Hình 3.2: Quy trình loại tạp cao lỏng cho sản xuất sản phẩm tắm sảng khoái 65

Hình 3.3: Qui trình pha chế sản phẩm tắm sảng khoái 66

Hình 3.4: Quy trình đóng lọ và hoàn thiện sản phẩm tắm sảng khoái 67

Hình 3.5: Phân bố nồng độ thuốc tắm của nhóm đối tượng nghiên cứu 76

Hình 3.6 Phân bố thời gian tắm của nhóm đối tượng nghiên cứu 77

Hình 3.7: Phân bố nhiệt độ nước tắm của nhóm đối tượng nghiên cứu 77

Hình 3.8: Phân bố nhiệt độ không khí trong phòng tắm 78

Hình 3.9: Phân bố thời gian bắt đầu toát mồ hôi 80

Hình 3.10: Phân bố thời gian tim bắt đầu đập nhanh 81

Hình 3.11: Các biểu hiện đặc biệt trong khi tắm 81

Hình 3.12: Qui trình chiết suất cao lỏng cho sản xuất sản phẩm ngâm chân 98

Hình 3.13: Qui trình loại tạp cao lỏng cho sản xuất sản phẩm ngâm chân 99

Hình 3.14: Quy trình pha chế sản phẩm ngâm chân 100

Hình 3.15: Quy trình đóng lọ và hoàn thiện sản phẩm ngâm chân 101

Hình 3.16 Tác dụng kháng khuẩn/nấm của chế phẩm ngâm chân ở các nồng độ pha loãng khác nhau 106

Hình 3.17 Hoạt động thử nghiệm chế phẩm ngâm chân trên người

tình nguyện 110

Hình 3.18: Elsholtzia penduliflora W.W.Smith 111

Hình 3.19: Elsholtzia blanda (Benth.) Benth 112

Hình 3.20 Qui trình sản xuất chế phẩm xông hơi 117

Hình 3.21 Sắc ký lớp mỏng tinh dầu Ngồng lải – Chùa dù – Pơ mu – Chế phẩm xông hơi 120

Hình 3.22 Mẫu mã sản phẩm tắm Dao’Spa Relax 124

Hình 3.23 Mẫu mã sản phẩm ngâm chân Sao’Spa và hiện nay là Salus Relaxo 125

ĐẶT VẤN ĐỀ

Công ty cổ phần Kinh doanh các sản phẩm bản địa (Sapa Napro

JSC.) được thành lập theo quyết định số 1203000063 ngày 02 tháng 11 năm

2006 của Sở Kế hoạch và Đầu tư tỉnh Lào Cai, trên cơ sở tham gia tự nguyện của các thành viên trong cộng đồng các dân tộc tại Sa Pa, chủ yếu là người Dao

đỏ và người Giáy Trụ sở chính của Công ty ở thôn Tà Chải, xã Tả Phìn, tỉnh Lào Cai, có diện tích khoảng 300 m2, bao gồm khu vực sản xuất, kho chứa và khu dịch vụ tắm tại chỗ với mục đích phát triển và thương mại hóa các sản phẩm bản địa dựa trên tri thức truyền thống của chính dân tộc mình

Doanh thu hiện tại của công ty là khoảng 50 triệu đồng/tháng Sản

phẩm chính là Nước tắm DAO’SPA, dịch vụ Tắm lá thuốc và Lúa Tàu bay Nguồn nguyên liệu đầu vào chủ yếu cho sản phẩm “Nước tắm

DAO’SPA” và dịch vụ “Tắm lá thuốc” từ các nguyên liệu thảo dược thiên nhiên được thu hái và chọn lựa tại địa phương nên có tác dụng rất tốt cho sức khoẻ, đặc biệt là với phụ nữ sau khi sinh, những người mới ốm dậy, giúp phục hồi sức khỏe, giúp thư giãn, giảm stress Do tác dụng tốt của bài thuốc tắm nên nhu cầu về sản phẩm này trên thị trường ngày càng gia tăng về cả số lượng cũng như chất lượng Do đó, việc nghiên cứu về các tính chất dược liệu, trị liệu dựa trên bài thuốc tắm cổ truyền của người dân tộc đang được công ty rất quan tâm và chú trọng nhằm đáp ứng được nhu cầu chăm sóc sức khỏe và đa dạng hóa sản phẩm của cộng đồng Tuy nhiên, do quy mô của Công ty còn nhỏ; đội ngũ cán bộ còn thiếu, trình độ chuyên môn còn chưa cao (giám đốc công ty là người dân tộc Dao mới chỉ học hết lớp 9, chưa có kiến thức về quản lý doanh nghiệp, về thị trường ); đặc biệt nguồn nguyên liệu đầu vào đang ngày càng khan hiếm do bị khai thác, sử dụng nhiều nhưng không có kế hoạch cải tạo, phục hồi Kết quả là sản phẩm của công ty chưa đáp ứng được nhu cầu của thị trường cả về số lượng và chất lượng

Do nguồn nguyên liệu ngày càng khan hiếm và thiếu kiến thức về cách phối trộn, chế biến và pha chế thuốc tắm nên hiệu quả của bài thuốc tắm này thường không ổn định, phụ thuộc vào từng cơ sở dịch vụ Việc đa dạng hoá các sản phẩm của bài thuốc tắm, sản xuất ổn định các sản phẩm có chất lượng cao đang đặt ra những thách thức cho công ty

Mặt khác, Công ty đặt tại thôn Tà Chải, cách đường ô tô 500m không thuận tiện về giao thông gây cản trở cho các hoạt động sản xuất như vận chuyển nguyên vật liệu, nhiên liệu, thành phẩm Trang thiết bị của công ty bao gồm hệ thống chiết suất, cô đặc và đóng gói với công suất 3.000 sản phẩm/tháng, các thiết bị này có công suất và chất lượng thấp, không đồng bộ Khu dịch vụ đủ cho 3 khách/lần tắm không đáp ứng được nhu cầu khách tắm ngày càng tăng Thiết bị phục vụ chưa tương xứng với tiềm năng, kích cỡ nhỏ

và chất lượng thấp Khu nhà kho với sức chứa 500 kg nguyên liệu, chưa có các trang thiết bị bảo quản cần thiết nên không thu mua đủ nguyên liệu để sản xuất, nguyên liệu nhanh bị xuống cấp ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

Để giải quyết vấn đề trên, cần có sự hộ trợ và tạo điều kiện của chính quyền các cấp, các chương trình hỗ trợ doanh nghiệp góp phần nâng cao hiệu quả hoạt động của doanh nghiệp, nâng cao đời sống của đồng bào dân tộc bản địa trên cơ sở bảo tồn và phát huy các lợi thế của địa phương trong đó có nguồn tài nguyên thiên nhiên cây dược liệu, cũng như bảo tồn tri thức bản địa,

đa dạng văn hoá của chính nơi được coi là trung tâm đa dạng sinh học cao

nhất Việt Nam, nơi địa đầu biên cương của tổ quốc

PHẦN 1:

TỔNG QUAN

Khi quan sát thế giới tự nhiên, loài người đã nhận thấy thảm thực vật có ích cho họ, mỗi khi ốm đau họ biết sử dụng những loài thực vật để chữa bệnh dưới nhiều hình thức như uống, xoa bóp hoặc xông hơi và tránh những loài

có tác dụng gây độc Ban đầu là kinh nghiệm trong vận dụng các quy luật và giá trị của tài nguyên để tự chữa bệnh, dần dần hình thành các nền y học mà ngày nay các nhà khoa học gọi là “y học cổ truyền dân tộc” tri thức về thảm

tài nguyên dược liệu được gọi là thực vật học dân tộc, còn các hiểu biết về tác dụng của cây cỏ được gọi là dược lý học dân tộc (các tri thức bản địa)

Như vậy, trong lịch sử phát triển của các dân tộc, các quốc gia cũng như trong

sự phát triển của xã hội loài người trên toàn thế giới gắn liền với lịch sử phát triển và sử dụng cây thuốc

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển với số dân khoảng 3,5 - 4 tỉ người sử dụng các loài cây thuốc cho chăm sóc sức khỏe Cùng với giá trị phòng bệnh, cây thuốc còn được quan tâm ở các quốc gia có nền công nghiệp phát triển vì lí do kinh tế Hàng năm nước Mỹ thu được khoảng 1,5 tỷ USD từ việc sản xuất các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc (chiếm 25% nguyên liệu dược phẩm) Người ta cũng ước tính rằng, nếu phát triển tối đa các loài cây thuốc có nguồn gốc thực vật ở khu vực nhiệt đới thì hàng năm các quốc gia này có thu nhập khoảng

900 tỉ USD

Việt Nam là nước nằm trong khu vực, công tác bảo tồn và phát triển các tri thức bản địa về “thực vật học và dược lí học dân tộc” là một thế mạnh không những có giá trị bồi dưỡng và nâng cao sức khỏe cộng đồng trong và ngoài quốc gia mà còn đem lại lợi ích kinh tế to lớn cho nhiều vùng, miền, địa phương Với điều kiện nhiệt đới gió mùa, quanh năm có cây xanh che phủ suốt

từ Bắc đến Nam, Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và

đa dạng, trải qua hàng nghìn năm lịch sử dựng nước và giữ nước, cộng đồng các dân tộc Việt Nam đã có truyền thống lâu đời về sử dụng các loài cây cỏ sẵn có

để làm thuốc và bảo vệ sức khỏe

Theo tổ chức điều tra đánh giá nguồn tài nguyên dược liệu tự nhiên của Việt Nam hiện có 3948 loài cây thuốc, 408 loài động vật làm thuốc, 75 khoáng vật và 52 loài tảo biển lớn; trong đó có 206 loài còn trữ lượng tương đối lớn thuộc 50 vùng tại 22 tỉnh miền núi như Sapa, Bắc Hà (Lào Cai), Yên Bái, Phú Thọ, Hà Giang, Cao Bằng… khai thác tự nhiên với tổng trữ lượng 121.000 tấn Ngoài ra còn xác định được 133 loài cây thuốc đang trồng phổ biến như kim tiền thảo, các cây có tinh dầu Hàng năm sản xuất ra hàng ngàn tấn dược liệu phục vụ y học cổ truyền, công nghiệp dược và xuất khẩu

Cả nước hiện có 286 cơ sở sản xuất dược phẩm, đang sản xuất 2.218 loại dược phẩm từ nguyên liệu thực vật hoặc chiết suất từ thực vật thuộc 35 dạng bào chất khác nhau chiếm 23% số loại dược phẩm được phép sản xuất

và lưu hành từ 1995 – 2000 Nhu cầu dược liệu cho y học dân tộc khoảng 3.000 tấn/năm, cho khối công nghiệp dược khoảng 20.000 tấn/năm và cho xuất khẩu khoảng 10.000 tấn/năm , phục vụ cho 145 bệnh viện y học cổ truyền 242 khoa y học cổ truyền tại các bệnh viện đa khoa cho 30.000 lương

y, các công ty dược sử dụng dược liệu như xí nghiệp TW 26, xí nghiệp TW 3, công ty dược liệu TW 1, công ty cổ phần Traphaco, công ty TNHH Bảo Long, xí nghiệp chế biến Đông dược quận 5 (TP Hồ Chí Minh) vv… Riêng công ty cổ phần Traphaco hàng năm sử dụng khoảng 500 tấn dược liệu của hơn 100 loài cây thuốc

Sapa là một vùng trồng dược liệu quan trọng của Việt Nam Đặc điểm vùng sinh thái ở Sapa đã cho phép cây thuốc phát triển một cách phong phú

và đa dạng Nơi đây còn là điểm du lịch rất đặc sắc của Việt Nam Hàng năm thu hút hàng vạn khách trong và ngoài nước đến thăm quan Do đó phát triển

du lịch gắn liền với sản phẩm bản địa trong đó có cây thuốc đặc biệt là các loài thuốc dân tộc là một thế mạnh và đang là định hướng phát triển của vùng

Ở Sapa các cộng đồng người dân tộc có truyền thống lâu đời trong việc

sử dụng cây cỏ để chăm sóc sức khỏe Nhiều loài cây thuốc quý đã được các

cơ quan, các nhà khoa học nghiên cứu phát hiện và đề xuất sử dụng như: sâm Hoàng liên, tam thất Hoàng liên, Linh chi, Thạch sương bồ Gần đây, các nhà khoa học và các nhà phát triển cộng đồng trong và ngoài nước quan tâm đến nhóm cấy thuốc được cộng đồng các dân tộc ở Sa Pa và một số nơi khác

ở khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam sử dụng để tắm sông hơi chữa trị một

số bệnh và phục hồi sức khỏe, tiếng dân tộc Dao gọi là “Đìa dảo xin” Bắt trước những tri thức truyền thống trong việc sử dụng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, nhiều cơ sở tắm ở Sa Pa và một số thành phố lớn như: Hà Nội đã xây dựng những cơ sở tắm lá thuốc để kinh doanh, chưa có một nghiên cứu đánh giá nào về hiệu lực của bài tắm lá thuốc này đến việc chữa bệnh và pgục hồi chữa bệnh của con người Số cây thuốc được sử dụng trong bài thuốc tắm biến động rất lớn, trung bình thường sử dụng khoảng 72 loài, số loài được sử dung phụ thuộc vào loại bệnh cần chữa trị và tình trạng cơ thể của người mới

ốm dậy để phục hồi sức khỏe Trong số 72 loài có từ 5-10 loài được sử dụng nhiều nhất

Mục đích sử dụng các loài cây thuốc trong bài thuốc tắm rất đa dạng, tùy thuộc vào số lượng, tỷ lệ phối trộn giữa các loài cây thuốc để tạo nên các bài thuốc rất khác nhau dùng để chữa bệnh (đau nhức cổ xương, đau khớp, cảm cúm, phù người, táo bón, nhọt ) dùng để tắm, xông hơi với 100% dược liệu từ thiên nhiên với sự kết hợp hài hòa giữa các biện pháp hấp thụ qua da và đường hô hấp, đã làm nâng cao sinh lực, phục hồi sức khỏe, sảng khoái, giảm Stress, làm đẹp da, chống mệt mỏi vv… đặc biệt là sử dụng cho người mới ốm dậy và phụ nữ sau sinh nở

Trong một số năm gần đây, do nhu cầu sử dụng bài thuốc tắm của du khách đến với Sapa ngày một tăng, việc sử dụng bài thuốc tắm tại Sapa đã

được thương mại hóa tại các nhà hàng, khách sạn, bệnh viện với lượng dược liệu ngày càng gia tăng (hàng 100 tấn tươi/năm) Thuốc tắm “đìa dảo xin” ngoài sử dụng tươi, còn được sơ chế biến như (thái lát, phơi khô, nghiền thành bột khô…) bày bán với mục đích sử dụng khác nhau tại các nhà hàng, khách sạn, cửa hàng thuốc (đồ uống, tắm, xông hơi, xoa bóp…) tại Sa Pa hoặc các thị trường khác như Hà Nội, Hà Tây, thành phố Hồ Chí Minh…

Trong tiến trình phát triển trên của vùng, Công ty Cổ phần kinh doanh các sản phẩm bản địa (Sapa Napro JSC.) được thành lập là sản phẩm của dự án

“Phát triển thị trường các sản phẩm bản địa ở khu vực miền núi phía Bắc” với mục tiêu thương mại hóa các sản phẩm bản địa nhằm nâng cao thu nhập cho cộng đồng, dưới sự tài trợ của tổ chức RF cùng với sự tham gia đóng góp của người dân về công lao động, đất đai, đầu tư kinh phí, đã xây dựng được các nhà xưởng để sản xuất, chưng cất sản phẩm tắm Dự án được chia làm 2 giai đoạn: giai đoạn 1 (2003-2005) xác định các sản phẩm của tiềm năng thị trường; giai đoạn 2 (2005-2007) xây dựng mô hình thương mai hóa các sản phẩm

Với mục tiêu trên việc nghiên cứu mở rộng và phát triển sản phẩm bài thuốc tắm “Đìa dảo xin” đặc trưng của cộng đồng các dân tộc tại Sa Pa là một trong những mục tiêu ưu tiên của Công ty Trong quá trình nghiên cứu thị trường tiêu thụ các sản phẩm được chế biến từ bài thuốc tắm “Đìa dảo xìn” chúng tôi nhận thấy: các bài thuốc dùng để tắm, dùng để xông hơi, dùng để ngâm chân được nhiều du khách, người sử dụng rất ưa thích nên số lượng tiêu thụ sản phẩm 3 bài thuốc này nhiều hơn hẳn so với các sản phẩm được chế biến từ các bài thuốc tắm “Đìa dảo xin” khác Do đó, công ty định hướng khai thác từ bài thuốc tắm “Đìa dảo xin” của để sản xuất 3 chế phẩm trên

Cơ sở khoa học của 3 chế phẩm này là: Trong 23 họ và 120 loài dược liệu của bài thuốc tắm “Đìa dảo xin” công ty khai thác từ 15- 20 loại dược liệu có trong các họ như họ ráy, họ cúc, họ cam quýt, họ cà phê, họ ngũ vị, họ gừng, họ hoa môi, họ mộc… trong đó đa số các dược liệu mọc tự nhiên ở trong rừng số

lượng phong phú Các dược liệu này đa số là cây có tinh dầu, hầu hết tan trong nước hoặc bốc hơi mỗi khi được đun nóng Khi nước và dược liệu được đun nóng thì các hoạt chất của dược liệu tan vào trong nước và hơi nước sẽ ngấm qua

da, bàn chân hoặc đường hô hấp vào trong cơ thể, các dược liệu sẽ khuếch tán vào tới các bộ phận trong cơ thể, chúng giải các chất độc làm tiêu mỡ trong máu,

hạ cholesterol, làm giảm đau, khử các axit như axit uric… sau đó các chất bị giải hoặc khử lại theo nước hoặc hơi nước thoát ra ngoài (lúc này bồn nước hoặc chậu nước sẽ có màu khác thường đậm đen hơn so với màu nước ban đầu), cơ thể con người được sảng khoái, các bệnh thấp khớp, tim mạch, huyết áp, béo phì, tiểu đường… được giảm và cứ như vậy sức khỏe được tăng dần

Các bệnh trên hiện nay rất phổ biến, nếu các chế phẩm trên có tác dụng

rõ rệt và giá cả hợp lý sẽ nhanh chóng thu hút người sử dụng với số lượng rất lớn, chắc chắn sẽ nâng cao thu nhập của công ty, của người dân nơi đây và nâng cao sức khỏe cộng đồng; đồng thời đẩy mạnh việc khai thác và bảo tồn phát triển tri thức bản địa bài thuốc tắm “Đìa dảo xin” của cộng đồng các dân tộc miền núi

Tuy nhiên để sản xuất được các chế phẩm trên, nhiều vấn đề cần phải nghiên cứu và hoàn thiện như:

- Xác định tiêu chuẩn của nguyên liệu theo hướng chế phẩm tạo ra (bao gồm các tiêu chuẩn về định tính: xác định loại cây, bộ phận của cây, hình thái: đường kính, độ dài, màu sắc…, tiêu chuẩn định lượng: hàm lượng các hoạt chất

có trong nguyên liệu để sx chế phẩm)

- Xây dựng quy trình sản xuất 3 chế phẩm (bao gồm: thu hái, sơ chế biến, bảo quản, tỷ lệ phối trộn, chiết suất…)

- Xác định tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm (thử hiệu lực của chế phẩm trên chuột, thỏ, ếch )

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho mỗi sản phẩm (các hoạt chất đặc trưng, độ ẩm, độ tinh khiết, mùi vị )

- Xây dựng thương hiệu, xác định quy mô sản xuất chế phẩm đảm bảo phát triển bền vững

Kỹ thuật giải quyết các vấn đề trên, hiện thời công ty còn hạn chế về cơ sở vật chất, nhân lực, tài lực do công ty ở vùng sâu, vùng xa, đa số thành viên công

ty là người dân tộc Dao đỏ nên rất cần có sự hỗ trợ của Nhà nước

Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu quy trình sản xuất 03 chế phẩm tắm từ dược liệu” được đề xuất theo nghị định 119 về hỗ trợ kinh phí nghiên

cứu khoa học cho doanh nghiệp nhằm bước đầu xây dựng cơ sở khoa học và thực tiễn cần thiết cho hoạt động hiện đại hóa y học cổ truyền, cũng như giúp doanh nghiệp có sản phẩm đạt chất lượng cao, độc đáo, ổn định và hấp dẫn thị trường tiêu thụ, nâng cao khả năng cạnh tranh cho sản phẩm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường trong nước, hướng đến xuất khẩu ra thị trường thế giới

Mục tiêu của dự án là:

1 Nghiên cứu xác định loại dược liệu để sản xuất 3 chế phẩm từ các dược liệu của bài thuốc tắm

2 Nghiên cứu quy trình sản xuất 3 chế phẩm (chế phẩm dược liệu dùng

để tắm, chế phẩm dược liệu dùng để ngâm chân, chế phẩm dược liệu dùng để xông hơi)

3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu và 3 chế phẩm

4 Thử nghiệm tính an toàn và hiệu lực của các chế phẩm

PHẦN 2:

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 CÁCH TIẾP CẬN CỦA DỰ ÁN

Cách tiếp cận của dự án là:

- Lấy thị trường làm gốc: Việc phát triển và hiện đại hoá các sản phẩm

truyền thống nói chung và bài thuốc tắm nói riêng cần được thực hiện dựa trên nhu cầu của thị trường

- Sản xuất theo hướng chuẩn hoá: Sản xuất chuẩn hoá nhằm bảo đảm sự

ổn định và chất lượng hàng hoá sản xuất ra Để đạt được điều này cần có thiết bị

và dây truyền tương đối hiện đại, có được nhờ nâng cấp và mở rộng hệ thống sản xuất cũ và xây dựng hệ thống sản xuất mới; Qui trình sản xuất ổn định và chuẩn hoá, có được nhờ thực hiện các nghiên cứu cơ bản như tác dụng dược lý của các chế phẩm; phát triển sản phẩm hợp lý nhất trên cơ sở nhu cầu thị trường và năng lực máy móc, thiết bị; đội ngũ cán bộ công nhân viên được đào tạo phù hợp

- Chia sẻ lợi ích hài hoà: Lợi ích có được từ hoạt động sản xuất và thương

mại hoá các sản phẩm từ cây thuốc và tri thức bản địa của người Dao đỏ trong khu vực được chia sẻ thông qua việc lập quỹ phúc lợi cộng đồng từ lợi nhuận ròng (lợi nhuận sau thuế) hằng năm của Công ty

Các cách tiếp cận thực hiện trong dự án được trình bày ở Hình 1 Các hoạt động chính bao gồm: Điều tra thị trường; phát triển, cải tiến và hoàn thiện sản phẩm, nâng cấp hệ thống sản xuất (nhà xưởng, thiết bị/dây truyền sản xuất); sản xuất và tiếp thị trên qui mô lớn

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu xác định dược liệu tiêu chuẩn để sản xuất 3 chế phẩm

2.2.1.1 Điều tra tính đa dạng sinh học của các cây dùng sản xuất 3 chế phẩm

a Điều tra, thu thập, xác định tên khoa học (bộ, họ, loài, giống, bộ phận dùng ) của các vị thuốc trong bài, nếu không xác định được tên khoa học cần nêu tên địa phương; hàm lượng của các vị thuốc trong 3 chế phẩm

Sử dụng các phương pháp cơ bản trong điều tra dược dân tộc học bao gồm: (1) Liệt kê tự do, (2) Điều tra theo tuyến và (3) Điều tra theo ô tiêu chuẩn kết hợp với các công cụ của PRA (Đánh giá nông thôn có sự tham gia)

(1) Liệt kê tự do: Được cải tiến từ kỹ thuật liệt kê tự do sử dụng trong

nhân học và tài nguyên cây cỏ nói chung

— Giai đoạn 1: Điều tra tại cộng đồng

Chọn mẫu: Mẫu nghiên cứu được chọn là những người làm thuốc hoặc

là người có hiểu biết nhiều về cây thuốc và được thừa nhận rộng rãi trong cộng đồng Số lượng người được phỏng vấn được quyết định khi “đường cong loài” tăng không đáng kể khi tăng người được phỏng vấn

Phỏng vấn: Mỗi người được phỏng vấn đều được yêu cầu liệt kê tất cả

các cây thuốc bằng tiếng Dao mà họ sử dụng trong bài thuốc tắm, ngâm chân hoặc các cây thuốc có mùi thơm có thể ứng dụng để xông hơi

Hình 2.1: Sơ đồ logic của dự án

Giai đoạn 2: Thu thập mẫu tiêu bản

Mẫu tiêu bản của tất cả các tên cây thuốc đã được nêu ra trong phần liệt

kê tự do được thu thập, ghi chép, xử lý và sấy khô theo các kỹ thuật làm tiêu bản thực vật thông thường và lưu trữ tại Phòng tiêu bản của Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP) Tổng cộng 120 tiêu bản đã được thu thập trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Giai đoạn 3: Xác định tên khoa học

Tên khoa học của mẫu tiêu bản được giám định bởi TS Trần Văn Ơn (Trường Đại học Dược Hà Nội) bằng phương pháp so sánh hình thái dựa trên các sách cây thuốc, thực vật chí, các đặc điểm mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Sinh Thái và Tài nguyên sinh vật

Giai đoạn 4: Xử lý dữ liệu

Từ danh mục liệt kê tự do của tất cả các cây thuốc tắm và các mẫu tiêu bản thu được Loại bỏ các tên tiếng Dao đồng nghĩa, tổng hợp và lập thành một danh mục tên tiếng Dao của các cây thuốc tắm được người Dao đỏ sử dụng

(2) Điều tra theo tuyến: Được thực hiện thông qua các chuyến nhập

cuộc quan sát tại thực địa để quan sát, phỏng vấn và thu thập mẫu tiêu bản tại thực địa Tổng cộng 16 chuyến nhập cuộc quan sát đã được thực hiện trong thời gian nghiên cứu (Hình 2.4)

Độ tin cậy của thông tin được tính theo công thức của Friedmann

ij v

S

F =

S

∑

Fv: độ tin cậy của thông tin ( 0 ≤ Fv ≤ 1)

Sij: Số người nói cây thuốc i chữa bệnh j

tổng số ∑S: tổng số lượt điều tra, trong đợt nghiên cứu này là 16

(3) Xác định tình trạng bảo tồn của cây thuốc tắm, ngâm chân và xông hơi

Dựa vào danh mục cây thuốc thu được ở giai đoạn 4, xác định tình trạng bảo tồn của các cây thuốc sử dụng các kỹ thuật cho điểm của PRA Ba tiêu chuẩn được áp dụng để đánh giá mức bảo tồn của cây thuốc là:

- Tỉ lệ (%) số hộ biết sử dụng (từ 1- 4 điểm, trong đó 4 điểm là 100% số hộ biết sử dụng)

- Mức độ sử dụng (từ 1-3 điểm, trong đó 3 điểm là sử dụng nhiều nhất)

- Mức giảm trữ lượng trong 10 năm qua (từ 0-10, trong đó 10 là đã mất hết) Trong quá trình xử lý số liệu chỉ tiêu này được rút gọn thành thang 0-4 nhằm cân bằng với các chỉ tiêu khác

Các tiêu chuẩn trên được xác định thông qua việc phỏng vấn các người NCCT thường xuyên có các hoạt động thu hái và bán thuốc ở trong khu vực Giá trị của mỗi tiêu chuẩn được xác định bằng giá trị trung bình của giá trị các NCCT cung cấp

Điểm bảo tồn (ĐBT) được xác định bằng tổng giá trị ba tiêu chuẩn trên Trong phạm vi đề tài, chúng tôi xác định các loài có điểm bảo tồn > 9 là các loài có mức ưu tiên bảo tồn cao

(4) Điều tra hoạt động thu hái, chế biến và bán các sản phẩm thuốc tắm, ngâm chân và xông hơi

Bằng phương pháp phỏng vấn và nhập cuộc quan sát các hoạt động thu hái, chế biến, sử dụng, buôn bán thuốc tắm tại địa phương và chợ Sa Pa

(5) Đánh giá trữ lượng của các cây thuốc tắm, ngâm chân và cây có mùi

Bằng phương pháp điều tra theo ô tiêu chuẩn: Ô tiêu chuẩn có kích thước là 100m2 (10mx10m), được xác định bằng phương pháp phân tầng – ngẫu nhiên Trong mỗi ô tiêu chuẩn 100m2 lại lập 13 ô nhỏ 1m2 để xác định tỷ

lệ cây thuốc trên cây cỏ nói chung trong khu vực (Hình 2.1) Tổng cộng có 12

ô đã được lập Các hoạt động điều tra bao gồm:

- Thiết lập ô: Xác định ranh giới ô bằng thước dây, đóng cọc và căng

dây nylon màu

- Thu mẫu tiêu bản để xác định tên khoa học

- Phỏng vấn người dân tại địa phương: Việc phỏng vấn được thực hiện

trực tiếp trên các cá thể loài có trong ô Nội dung phỏng vấn bao gồm tên cây (tên địa phương), có làm thuốc/không làm thuốc

- Xử lý kết quả: Kết quả được xử lý bao gồm: Danh mục loài cây thuốc,

tên khoa học, họ thực vật, số lượng và tỷ lệ các bậc phân loại (ngành, họ và chi), các dạng sống

Các chỉ tiêu xác định ở ô 100m2 bao gồm: Thành phần loài, là số loài xuất hiện trên các ô theo thảm thực vật; tần số xuất hiện; tỷ lệ số loài cây thuốc trên tổng số loài cây gặp trong từng ô

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí các ô tiêu chuẩn

2.2.1.2 Nghiên cứu thành phần hoá học của các dược liệu dùng sản xuất 3 chế phẩm

Nghiên cứu thành phần hóa học chính của một vài cây chính, tập trung vào những cây có hàm lượng cao trong bài

a) Nghiên cứu định tính các thành phần hóa học cơ bản có trong từng cây thuốc để sản xuất chế phẩm các chế phẩm

Xác định sự có mặt của một số thành phần hoá học chính trong dược

liệu theo giáo trình Dược liệu và Tài liệu hướng dẫn thực tập, bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội Dược liệu đã sấy khô được nghiền thành bột, chiết xuất và thử sự có mặt của các hợp chất tự nhiên:

(1) Alkaloid: Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón 50ml,

thêm 10ml dung dịch H2SO4 đặc, đun sôi để nguội, lọc lấy dịch Dịch lọc cho vào bình gạn, kiềm hoá bằng amoniac đặc, lắc 3 lần với cloroform, mỗi lần 5ml, gạn lấy lớp cloroform chia vào các ống nghiệm Bốc hơi cách thuỷ thu được cắn Hoà tan cắn trong các ống nghiệm bằng 1ml H2SO4 1N, tiến hành các phản ứng định tính alkaloid :

- Phản ứng Mayer: Thêm 2 giọt thuốc thử Mayer, phản ứng dương

tính nếu có tủa màu vàng nhạt

- Phản ứng Bouchadat: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchadat, phản ứng

dương tính nếu xuất hiện tủa màu nâu

- Phản ứng Dragendorff: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff, phản

ứng dương tính nếu xuất hiện tủa đỏ cam

Nếu các phản ứng đều dương tính, sơ bộ kết luận dược liệu chứa alcaloid

(2) Flavonoid: Cho bột dược liệu trắng vào bình nón 50ml, thêm

khoảng 15ml ethanol 90o, đun cách thuỷ sôi vài phút, lọc nóng lấy dịch chiết Dịch lọc đem cô bớt cồn, cho vào bình gạn, lắc 3 lần với ether dầu hoả, mỗi lần 5ml để loại chất béo, gạn lớp cồn để tiến hành các phản ứng định tính :

- Phản ứng với hơi amoniac : Cho 3 giọt dung dịch lên giấy lọc, để

khô giấy lọc có màu hơi vàng, đặt lên miệng lọ amoniac đặc Phản ứng dương tính nếu màu vàng của giấy lọc tăng lên rõ rệt, hoặc chuyển thành màu đỏ, xanh dương

- Phản ứng với dung dịch kiềm loãng : Cho khoảng 1ml dịch chiết

vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính nếu dung dịch chuyển thành màu vàng, hoặc đỏ, v.v

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 : 1ml dịch chiết, thêm 3 giọt FeCl3 5% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh đen, lục hoặc nâu

- Phản ứng cyanidin: Lấy 1ml dịch chiết, thêm bột kẽm, nhỏ vài giọt

HCl đặc Phản ứng dương tính nếu dung dịch chuyển sang màu hồng hoặc đỏ

- Phản ứng diazo hóa: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hoá

bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3 ), thêm vài giọt thuốc thử diazoni, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thuỷ trong vài phút) xuất hiện màu đỏ

Nếu các phản ứng dương tính, sơ bộ kết luận dược liệu chứa flavonoid

(3) Glycosid tim: Cân 10g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 100ml

cồn 25o, ngâm 24h, sau đó gạn lấy dịch chiết Dịch chiết cho vào cốc mỏ 100ml, thêm dung dịch chì acetat 30%, khấy đều, lọc lấy dịch (lượng chì acetat 30% đủ khi dịch lọc cho thêm dung dich chì acetat không tạo thêm tủa) Dịch lọc cho vào bình gạn, lắc 3 lần với cloroform, mỗi lần 5ml Lớp cloroform chia vào các ống nghiệm và đem cách thuỷ lấy cắn tiến hành các phản ứng định tính

- Phản ứng Libermann : Hoà tan cắn bằng 1ml anhydrid acetic Đặt

nghiêng, thêm từ từ 1ml dung dịch H2SO4 đặc dọc theo thành ống nghiệm để sao cho 2 lớp dung dịch không bị trộn lẫn Phản ứng dương tính nếu mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng đỏ tím, nếu lắc đều dung dịch chuyển màu xanh lá

- Phản ứng Baljet : Hoà tan cắn trong 0.5ml ethanol 90o, nhỏ thuốc thử Baljet (1ml acid picric 1% + 9ml NaOH 10%) Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ cam

- Phản ứng Legal: Hoà tan cắn với 0.5ml ethanol 90o, thêm 1 giọt natrinitroprussiat 0.5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều Phản ứng dương tính nếu dung dịch xuất hiện màu đỏ cam

- Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90% Lắc

đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ

để làm các phản ứng định tính

- Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết

+ Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

+ Ống 2 để nguyên

Ðun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội

Quan sát: Ống 1: có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng

Ống 2: trong

Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều

Quan sát: Ống 1: trong suốt

Ống 2: có tủa đục

Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2 Dựa vào độ tan trong cồn và trong nước của coumarin để giải thích quá trình mở và đóng vòng lacton

- Phản ứng Diazo: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2

ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ đến sôi, để nguội Thêm vài giọt

thuốc thử diazo, trong ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch

- Phản ứng vi thăng hoa: Cho 1 g bột dược liệu cho vào nắp chai

bằng nhôm Hơ trên đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt lên trên miệng nắp nhôm một lam kính, trên đó có để một miếng bông ướt Đặt nắp nhôm trực tiếp trên nguồn nhiệt Sau 5 phút lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi, có tinh thể nào xuất hiện

- Quan sát huỳnh quang: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ

tiếp lên đó một giọt dung dịch NaOH 5%, sấy nhẹ Che 1/2 vết bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút

cả hai phần đều phát quang như nhau

Nếu các phản ứng dương tính, sơ bộ kết luận sự có mặt các phần cấu trúc đặc trưng của coumarin

(5) Saponin:

Định tính nhờ hiện tượng tạo bọt : Cho 1g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn (20ml), thêm 5ml nước cất, đun cách thuỷ 10 phút, lọc dịch lọc cho vào một ống nghiệm lớn khác Thêm nước cất đủ 10ml, bịt miệng ống nghiệm, lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm 5 phút, sau đó để yên quan sát

Sơ bộ kết luận dược liệu chứa saponin nếu ống nghiệm có cột bọt cao và bền vững trong 15 phút

(6) Định tính tanin

Cho khoảng 5 g dược liệu vào trong bình nón dung tích 100 ml, thêm

20 ml nước Đun sôi trực tiếp trong 5 phút, lọc qua giấy lọc Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 1 ml dịch lọc đem làm phản ứng định tính:

- Phản ứng với FeCl 3 5%: thêm 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện màu xanh đen

- Phản ứng dung dịch đồng acetat 10%: thêm vài giọt dung dịch đồng

acetat 10%, thấy xuất hiện tủa

- Phản ứng gelatin: thêm 1 ml dung dịch gelatin 2%, thấy xuất hiện tủa

Nếu phản ứng dương tính, sơ bộ kết luận sự có mặt các phần cấu trúc đặc trưng của anthranoid

(8) Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin

Cho 5 g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước, đun cách thuỷ trong 10 phút Lọc lấy dịch lọc đem định tính:

- Định tính đường khử: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3

giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B Đun cách thuỷ trong 5 phút, thấy trong ống nghiệm có tủa đỏ gạch Nếu phản ứng dương tính, sơ bộ kết luận sự có mặt các phần cấu trúc đặc trưng của đường khử

- Định tính acid hữu cơ: Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm và cho

thêm một ít tinh thể Na2CO3 thấy bọt khí nổi lên Nếu phản ứng dương tính,

sơ bộ kết luận sự có mặt các phần cấu trúc đặc trưng của acid hữu cơ

- Định tính acid amin: Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ 3 giọt

thuốc thử Ninhydrin 3% Đun cách thuỷ trong 10 phút, thấy xuất hiện màu xanh tím Nếu phản ứng dương tính, sơ bộ kết luận sự có mặt các phần cấu trúc đặc trưng của acid amin

b) Định lượng các nhóm hoạt chất chính trong dược liệu

(1) Định lượng anthranoid: sử dụng phương pháp cân:

* Nguyên tắc: Chiết anthranoid bằng dung môi hữu cơ (clorofom,

ether…), loại tạp bằng bisulfit và acid HCl Bốc hơi dung môi, sấy đến khối lượng không đổi Cân và tính kết quả

* Tiến hành: Cân chính xác 1g dược liệu cho vào bình cầu 50ml, thêm vào đó 25ml CHCl3- Đun hồi lưu trên cách thủy có sinh hàn ngược trong 2,5 giờ Lọc qua phễu có giấy lọc vào 1 bình gạn Thêm vào bình gạn 25ml dd natri bisulfit, lắc 5 phút, gạn lấy lớp chloroform Để lắng gạn lấy riêng lớp chloroform Lắc dung dịch chloroform này với 50 ml HCl 1% (thủy phân hết glycoside về dạng tự do) Để lắng , gạn lấy lớp chloroform vào 1 cốc đã biết trọng lượng Sấy ở 50-60 ˚C, đến khối lượng không đổi Cân và tính kết quả

(2) Định lượng coumarin

* Nguyên tắc: Chiết coumarin bằng dung môi hữu cơ (ether dầu hỏa) và dung dịch kiềm nhiều lần Bốc hơi dung môi, sấy đến khối lượng không đổi Cân và tính kết quả

* Tiến hành: Cân chính xác 10g dược liệu cho vào bình cầu 50ml, thêm vào đó 250ml CHCl3 Đun hồi lưu trên cách thủy có sinh hàn ngược trong 2,5 giờ Lọc qua phễu có giấy lọc vào 1 bình gạn Lắc dịch chiết với NaOH 10% Tách riêng lớp kiềm, lặp lại 3 lần Acid hóa dịch kiềm bằng aicd HCl 10% Dịch acid hóa cho vào bình gạn, thêm ether, gạn lấy lớp ether Bốc hơi dung môi Thu cắn, cân cắn (M) Hàm lượng coumarin được tính theo công thức: X% =M× 104/A(100 – P)

Trong đó:

X (%): Tỷ lệ % coumarin trong dược liệu

A (g) : Khối lượng dược liệu dùng để định lượng

M (g): Khối lượng cắn saponin đã sấy khô tuyệt đối

P (%): Hàm ẩm tính theo dược liệu

(3) Định lượng saponin

* Nguyên tắc: chiết saponin dưới dạng tinh khiết bằng ether dầu hỏa và methanol Kết tinh saponin lại trong ether hoặc aceton Sấy ở 50-60˚C đến khối lượng ko đổi Cân và tính kết quả:

* Tiến hành: Cân chính xác 5g dược liệu Loại tạp chất bằng ether dầu hỏa 16 h với dụng cụ Shoxhlet Cất thu hồi dung môi, tiếp tục chiết saponin bằng methanol đến khi hết saponin (thử bằng hiện tượng tạo bọt) Làm đậm đăc dịch chiết còn 20-25ml, để nguội Thêm 50ml ether hoặc aceton để tủa saponin Tủa lại được hòa tan trong 20; 10; 5ml methanol va kết tinh trong ether hoặc aceton Tủa thu được lại được hóa tan trong methanon Cất thu hồi dung môi, thu cắn saponin Sấy cắn ở nhiệt độ 50- 60˚C đến khối lượng ko đổi (M) Hàm lượng saponin được tính theo công thức:

X% =M× 104/A(100 – P)

Trong đó:

X (%): Tỷ lệ % saponin trong dược liệu

A (g) : Khối lượng dược liệu dùng để định lượng

M (g): Khối lượng cắn saponin đã sấy khô tuyệt đối

P (%): Hàm ẩm tính theo dược liệu

(4) Định lượng flavonoid toàn phần

* Tiến hành: Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu, chiết xuất bằng n-hexan trong dụng cụ Soxhlet đến khi dịch trong suốt, không màu Sấy dược liệu ở 500C đến khô Tiếp tục chiết xuất bằng cồn ethanol 960 trong dụng cụ Soxhlet liên tục trong 8 giờ đến khi dịch trong suốt, không màu và không cho màu vàng với dung dịch NaOH 0,1 N Thu được dịch chiết cồn Cất thu hồi cồn thu được cao đặc, xử lý với 50 ml nước nóng, lọc, chiết với ethyl acetat (5 lần, mỗi lần 15 ml) Dịch chiết ethyl acetat được cất thu hồi dung môi đến cặn Sấy cặn ở 700C đến khối lượng không đổi và cân trên cân phân tích

Kết quả được tính theo công thức:

X% =M× 104/A(100 – P)

Trong đó:

- X (%) : Hàm lượng flavonoid toàn phần được biểu thị bằng phần trăm (kl/kl)

- A (g) : Khối lượng của mẫu dược liệu đem tiến hành định lượng

- M (g) : Khối lượng flavonoid toàn phần

- P (%) : Hàm ẩm của dược liệu

(5) Xác định hàm lượng tinh dầu:

Bước 1: Cất kéo hơi nước

• Dụng cụ: Bộ định lượng tinh dầu cải tiến của bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội do PGS.TS Nguyễn Thị Tâm thiết kế

• Thời gian cất kéo: 2,5- 3 giờ

• Xác định độ ẩm: Bằng phương pháp dung môi (DĐVN III)

• Hàm lượng tinh dầu được tính trên dược liệu khô tuyệt đối:

Công thức: X%= a/b ×100

X: Hàm lượng phần trăm tinh dầu (thể tích/khối lượng)

a: Thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (tính theo mililit)

b: Khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (tính theo gram)

Bước 2: Định tính, định lượng tinh dầu: Bằng máy sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS), phòng Đông dược- Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

* Chuẩn bị mẫu thử:

• Tinh dầu Pơ mu: Hoà tan 20µl tinh dầu vào 980µl n-Hexan được

dung dịch A Hoà tan 150µl dung dịch A vào 1350µl n- Hexan được dung dịch tiêm sắc ký

• Tinh dầu được hoà tan với 20µl tinh dầu vào 980µl n-Hexan được

• Nhiệt độ buồng tiêm: 260ºC

• Nhiệt độ detector: 280ºC

• Chương trình nhiệt độ: 60- 200ºC

• Tốc độ dòng: 1,2ml/phút

• Tổng thời gian chạy: 34 phút

2.2.2.3 Nghiên cứu tiêu chuẩn của nguyên liệu dược liệu “đầu vào” để sản xuất 3 chế phẩm

Các tiêu chuẩn chung bao gồm: Mô tả cảm quan: mẫu tươi, dược liệu (hình dạng, kích thước, màu sắc, mùi, vị), cấu tạo vi phẫu, soi bột, định tính,

độ ẩm, tro toàn phần, tạp chất lạ, định lượng các nhóm chất chính, chế biến, bảo quản, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, dư lượng kim loại nặng

2.2.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm

2.2.2.1 Pha chế sản phẩm tắm và ngâm chân

a Các máy móc trạng thiết bị dùng để sản xuất chế phẩm tắm và ngâm chân được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Các máy móc, thiết bị dùng trong sản xuất chế phẩm tắm và

2 Thùng pha chế nhựa Việt Nam Dung tích 10, 20 và 220 lít

4 Máy cắt dược liệu Việt Nam Hai lưỡi dao

5 Thùng nấu cao dung tích

6 Chảo cô cao 100 lít Việt Nam Inox dày 10 mm

7 Máy đóng lọ Việt Nam 6 đầu ống chiết chai bán tự

động

8 Bộ cất thu hồi dung môi

dung tích 50 lít Việt Nam Bình cất, hệ thống làm lạnh, bình hứng

b Nghiên cứu quy trình sản xuất các chế phẩm được thực hiện theo hướng đạt GMP (bao gồm nguyên liệu ban đầu đảm bảo chất lượng, quy trình sản xuất: tỷ lệ phối trộn phương pháp chế biến, các dụng cụ thiết bị, nhà xưởng Quy trình thực hiện được mô tả trong hình 2.3

Hình 2.3: Quy trình sản xuất các sản phẩm tắm và ngâm chân

Thu hái tự nhiên Thu hái trồng trọt

2.2.2.2 Pha chế sản phẩm xông hơi

Máy móc, thiết bị dùng trong sản xuất được liệt kê trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Máy móc, thiết bị dùng trong sản xuất chế phẩm xông hơi

TT Tên thiết bị Xuất xứ Đặc điểm thông số kỹ

thuật

Ống đong Trung

quốc

50ml, 100ml, 500ml 1000ml

Tank pha chế inox Việt Nam Dung tích 100 lít

Cốc có mỏ Việt Nam 50ml, 100ml, 200ml, 500mlQue khuấy inox Việt Nam

Quá trình pha chế tạo công thức cho sản phẩm xông hơi được thực hiện theo quy trình hình

Hình 2.4 Sơ đồ các bước pha chế tinh dầu Bước 1: Gồm ít nhất 3 tinh dầu

Dùng pipet chính xác 100µl pha tinh dầu với tỷ lệ ban đầu 1: 1 trên đĩa Petri Dùng đũa thuỷ tinh trộn đều tinh dầu Sau đó thấm hỗn hợp tinh dầu bằng giấy lọc thử mùi chuyên dụng, đặt cách xa 15 cm và ngửi mùi thơm Sau 30 phút ngửi lại que giấy Kết quả cảm nhận mùi ưa thích thu được từ 20

Pha chế tạo mùi chủ thể cho sản phẩm

Pha chế trong dung môi, chất phụ trợ

Lưu trữ, bảo quản

người Sau đó tiến hành thay đổi tỷ lệ dựa trên cảm nhận về mùi hương vừa pha Tiếp tục như vậy cho đến khi chọn được công thức có số người hài lòng cao nhất và tỷ lệ số người chấp nhận phải cao hơn 90%

Bước 2: Dùng thêm dung môi Tween 80

Dựa trên tỷ lệ pha tạo mùi thu được ở trên, sử dụng dung môi Tween

80 để pha hỗn hợp tinh dầu Lần lượt cho từng tinh dầu với tỷ lệ từ thấp đến cao, tuân theo nguyên tắc cảm nhận mùi hương như trên

Bước 3: Lưu trữ trong lọ thuỷ tinh tối màu có nắp kín trong khoảng

thời gian ít 20 ngày để đồng nhất mùi hương và xem xét sự biến đổi về mùi,

độ trong, độ phân lớp

2.2.3 Nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của các chế phẩm

2.2.3.1 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm tắm thư giãn trên mô hình thử nghiệm dược lý

a) Mẫu nghiên cứu: Mẫu thử dạng cao lỏng, từ công thức sản phẩm tắm

(tương đương cao lỏng 1g/1ml) (mẫu M)

b) Nghiên cứu tác dụng sinh học: Được nghiên cứu tại Bộ môn Dược lý

của Trường Đại học Dược Hà Nội, bao gồm:

Tác dụng giảm đau: Được tiến hành trên chuột nhắt trắng chủng Swiss có

trọng lượng 18-22g, khỏe mạnh, cả 2 giống, có nguồn gốc từ Học viện Quân Y Chuột đuợc chia thành 3 lô, mỗi lô 12 con, bao gồm: lô chứng (NaCl 0,9%, 0,3ml/chuột), lô đối chiếu (Aspirin 0,67%, 200mg/kg) và lô thử (mẫu M được pha theo tỷ lệ 1:1,5, liều 20g/kg) Chuột được gây quặn đau theo phương pháp của Koster, dùng acid acetic tiêm màng bụng (1,2%, 0,2ml/chuột) Chỉ tiêu theo dõi là số cơn quặn đau sau từng 5 phút kể từ khi tiêm acid acetic Tác dụng giảm đau được đánh giá bằng cách so sánh số cơn quặn đau

Tác dụng trên tĩnh mạch: Được thực hiện trên tai thỏ cô lập, theo

phương pháp của Kravkov Mẫu so sánh là dung dịch (DD) Ringer Chỉ tiêu theo dõi là số giọt dịch chảy/1 phút

Tác dụng trên tim: Được thực hiện trên tim ếch nguyên vẹn Ếch thử

nghiệm thuộc cả 2 giống, khỏe mạnh, có trọng lượng từ 150-200 g/con Hoạt động của tim ếch được ghi lại theo phương pháp của Strawb Toàn bộ tác động của mẫu thử được ghi lại, có so sánh với thời điểm trước khi thử

Xác định độc tính cấp: Được thực hiện trên súc vật là chuột nhắt trắng

chúng Swiss khỏe mạnh, có trọng lượng từ 18-22 g, trọng lượng 20 2 g/con,

cả 2 giống (50% đực, 50% cái) được cung cấp bởi Học viện Quân Y Chuột được uống mẫu thử với liều tăng dần và được theo dõi trong vòng 72 giờ hoặc cho đến liều làm chết 100% súc vật thí nghiệm hoặc liều tối đa dung nạp Nếu

có chuột chết thì mổ ra quan sát đại thể phủ tạng, tính tỷ lệ chuột chết và xác định LD50 theo công thức Karber-Behrens :

LD 50 = Df - Sab/n

Trong đó: Df : Liều làm chết 100% súc vật

a : Trị số trung hình của tổng số súc vật chết ở 2 liều kế tiếp

b : Hiệu số giữa 2 liều kế tiếp

n : Số súc vật chết ở mỗi liều hoặc số trung bình các lô

2.2.3.2 Khảo sát hiệu lực và tính an toàn của chế phẩm ngâm chân trên mô hình thử nghiệm dược lý

a) Mẫu nghiên cứu: Mẫu thử dạng cao lỏng, từ công thức sản phẩm

tắm, không có thành phần tinh dầu (tương đương cao lỏng 1:1) (mẫu M)

b) Nghiên cứu tác dụng sinh học: Được nghiên cứu tại Bộ môn Dược lý

và Bộ môn Thực vật của Trường Đại học Dược Hà Nội, bao gồm:

Tác dụng trên tĩnh mạch: Được thực hiện trên tai thỏ cô lập, theo

phương pháp Kravkov, tương tự phương pháp thử nghiệm đối với chế phẩm tắm thư giãn

Tác dụng giảm đau: Được thực hiện theo phương pháp của Koster,

tương tự phương pháp thử nghiệm đối với chế phẩm tắm thư giãn

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm: Phương pháp nuôi cấy VSV được

chọn là phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch

* Nguyên tắc: Chủng vi sinh vật kiểm định cấy vào môi trường thạch dinh dưỡng Cho mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) vào các giếng thạch Trong thời gian nuôi cấy, hoạt chất từ mẫu khuyếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo vòng vô khuẩn

* Dịch nguyên liệu được sử dụng là nước sắc dược liệu tươi : mẫu cây được rửa sạch, để ráo nước Dược liệu đem sắc nhỏ lửa với 5 phần nước để thu được dung dịch sắc có tỷ lệ 1/1

* Chủng thử: Candida albicans (C.albicans) ATCC 10231, Staphylococcus aureus (S aureus) ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa ) ATCC 27853 (phòng Vi sinh, Viện Kiểm

nghiệm TW cung cấp)

* Tiến hành: Cấy truyền chủng từ ống gốc lên một ống thạch nghiêng ủ trước khi thử nghiệm 16 - 18 giờ Sau khi ủ 18 giờ, dùng que cấy gặt vi khuẩn đã phát triển trên bề mặt môi trường bằng nước muối sinh lý (107 - 108 tế bào/1ml) để tạo ra vòng ức chế có ranh giới rõ ràng

* Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (môi trường thạch thường)

Môi trường nuôi cấy nấm mốc (môi trường Sabouraud 2%)

* Cách chế tạo nhũ dịch chủng cấy truyền:

Từ ống thạch nghiêng đã có chủng vi sinh vật kiểm định + 10 ml dung dịch NaCl 9%o Æ lắc đều chuyển sang ống nghiệm sạch khô (dung dịch gốc)

+ 1ml dung dịch gốc + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-1+ 1ml dung dịch 10-1 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-2+ 1ml dung dịch 10-2 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-3+ 1ml dung dịch 10-3 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-4+ 1ml dung dịch 10-4 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-5+ 1ml dung dịch 10-5 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-6+ 1ml dung dịch 10-6 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-7+ 1ml dung dịch 10-7 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-8+ 1ml dung dịch 10-8 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10-9+ 1ml dung dịch 10-9 + 9ml NaCl 9%o Æ dung dịch có độ pha loãng 10- 10

Lấy các dung dịch có nồng độ pha loãng như trên cho vào 2 hộp Petri mỗi hộp 1ml Thêm vào mỗi hộp Petri 15 - 20 ml môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp đã đun chảy và để nguội ở 45oC Sử dụng môi trường