Virus free plant tissue culture

2. Kỹ thuật nuôi cấy meristem Qua nghiên cứu của các nhà khoa học White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952): Nồng độ virus trong các cây bị bệnh phụ thuộc vào tốc độ phân chia của các tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào. Tế bào phân chia càng mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn.  Từ đây các ông đã đưa ra một kỹ thuật: kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã nhiễm bệnh. Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp lá hoặc thân cây nơi có thể sinh ra những phần mới từ đó, đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh sáng, nó chứa nhiều Auxin, nơi diễn ra trao đổi chất rất mạnh Kỹ thuật nuôi cấy meristem là phương pháp sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3 4 tiền phát khởi lá, tức lá đỉnh, có kích thước 0,10,5 mm tính từ chóp đỉnh sinh trưởng...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BÁO CÁO HỌC KỲ

MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

ĐỀ TÀI: VIRUS-FREE-PLANT TISSUE CULTURE

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 3 NĂM 2022

MỤC LỤC

I Mở đầu 3

II Nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus 4

1 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

2 Kỹ thuật nuôi cấy meristem 5

3 Tại sao nuôi cấy meristem lại tạo ra cây sạch bệnh 6

III Các cách nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus in vitro. 6

1 Các cách nuôi cấy meristem 6

2 Cách tiến hành nuôi cấy 8

3 Ứng dụng vào một cây cụ thể 11

IV Các cách kiểm tra đánh giá bệnh virus 13

V Các phương pháp ngăn chặn quá trình tái lây nhiễm virus trên đồng ruộng 16

VI Tài liệu tham khảo: 16

I Mở đầu

Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mở ra rất nhiều hướng ứng dụng khác nhau sản xuất sinh khối các chất có hoạt tính sinh học ở quy mô lớn, nhân nhanh các giống cây trồng bằng phương pháp invitro, bảo tồn nguồn gen in vitro,

Trong lĩnh vực bệnh cây, hiện nay, có khoảng hơn 2000 loại vi rút thực vật đã được phát hiện và nghiên cứu, trong số đó khoảng một n l những loài gây hại chính cho cây trồng Mứ độ thiệt hại do các bệnh virus gây ra cho cây trồng là rất nghiêm trọng, ó thể l n tới 5-100% Sự thiệt hại không những chỉ dừng ở mứ độ su giảm về năng suất mà còn ảnh hưởng cả đến chất lượng sản phẩm thu hoạch Các ví dụ về thiệt hại do bệnh virus gây ra ở nướ t ó thể kể đến như: á dịch virus vàng lùn xoắn lá trên lúa ở đồng bằng sông u ong những năm vừa qua, và gần đâ l dịch lúa lùn sọ đ n mới uất hiện ở các tỉnh phía bắ , đ dọa nghiêm trọng đến sản lượng lương thực Bệnh virus hại thực vật l một loại bệnh ngu hiểm,dễ lan truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các mô sống), qu m giới tru ền bệnh (các loại n trùng như rệp, bọ phấn, nhện,v.v) qua tiếp ơ giới (vết cắt, xây xát, v v ) Tác hại củ virus l v ùng lớn ó l m ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩm chất nông sản

ột số hình ảnh về bệnh do virus trên cây trồng:

 Do đó, việc tạo ra các cây giống sạch bệnh là vô cùng cần thiết và là biện pháp bắt buộc cho tất cả các cây nhân giống v tính v ũng l một biện pháp để phục tráng giống cho các giống đã bị thoái hóa do nhiễm virus

- Kỹ thuật tạo cây sạch bệnh virus

- Hiện n ó 2 phương pháp hính đó l :

 Kỹ thuật RNA interference (RNAi – RNA can thiệp)

 Kỹ thuật làm sạ h virus invitro : 4 phương pháp

 Nuôi cấ m phân sinh đỉnh

 Nuôi cấ m phân sinh đỉnh kết hợp l nhiệt độ o

 Nuôi cấ m phân sinh đỉnh kết hợp l hó hất

 Vi ghép

II Nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus

1 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, tr n m i trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

- Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ hữu hiệu để tạo ra các cây trồng sạch bệnh Để tạo cây sạch bệnh người ta có thể dùng á phương pháp s u:

 Dùng các phương pháp huẩn đoán bệnh virus để thanh lọc các mẫu nhiễm bệnh trướ khi đư v o nu i ấy, s dụng biện pháp nhân nh nh in vitro để nhân nhanh mẫu sạch

 Làm sạch virus ở mẫu đã bị nhiễm, s u khi đã tạo mẫu sạch thì tiếp tục s dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân mẫu sạch

2 Kỹ thuật nuôi cấy meristem

Qua nghiên cứu của các nhà khoa học White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952): Nồng độ virus trong các cây bị bệnh phụ thuộc vào tố độ phân chia của các tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào Tế bào phân chia càng mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩ l những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứ ít virus hơn

 Từ đâ á ng đã đư r một kỹ thuật: kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ â đã nhiễm bệnh

Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp lá hoặ thân â nơi ó thể sinh ra những phần mới từ đó, đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh sáng, nó chứa nhiều Au in, nơi diễn r tr o đổi chất rất mạnh

Kỹ thuật nuôi cấ m rist m l phương pháp s dụng phần mô phân sinh ngọn với

3 - 4 tiền phát khởi lá, tứ lá đỉnh, ó kí h thước 0,1-0,5 mm tính từ hóp đỉnh sinh trưởng

3 Tại sao nuôi cấy meristem lại tạo ra cây sạch bệnh

Virus di chuyển chủ yếu trong cây nhờ hệ thống mô dẫn, hệ thống này không có ở

m phân sinh đỉnh

Trong quá trình phân chia, các tế b o m phân sinh đỉnh không cho phép sao chép thông tin di truyền của virus

Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn quá trình s o hép thông tin di truyền của virus

Hệ thống vô hiệu hóa ở vùng meristem mạnh hơn á vùng khá trong â

III Các cách nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus in vitro

1 Các cách nuôi cấy meristem

- Nuôi cấ đỉnh phân sinh (meristem-tip culture)

 Tách chính xác meristem ó kí h thước < 0,3mm

 Nuôi cấ tr n m i trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh thành cây hoàn chỉnh

 Kiểm tr độ sạch của các cây tái sinh bằng các biện pháp khá nh u để thu được cây sạch bệnh

- Nuôi cấy meristem kết hợp x lý nhiệt

Ở nhiệt độ cao từ 36°C - 37°C thì một số loại virus không có khả năng nhân l n Lợi dụng đặc tính này có thể kết hợp phương pháp nu i ấy meristem với x lí nhiệt

độ để tẩy sạch virus khuôn mẫu

Biện pháp này cho phép có thế tách meristem ở kí h thước lớn hơn (0 5 - 1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tá h ở kí h thước 0.1 - 0.2mm

- Nuôi cấy meristem kết hợp x lý hóa chất

 Có thế nuôi cấy meristem với kí h thước lớn (0.5 - 1mm) kết hợp với việc bổ sung v o m i trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh

 Các chất kháng virus như: 2-thiour il, rib virin, vid r bin l m tăng khả năng

đề kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus

 Phương pháp n đã được áp dụng trong việc tạo cây sạch virus ở thuốc lá, kho i tâ , ho lo kèn v đã th nh ng

- Vi ghép

Là kĩ thuật ghép m phân sinh đỉnh lên cây gốc sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro Thường được áp dụng trên những cây thân gỗ đặc biệt là họ cam, chanh vì meristem của chúng không thể sinh trưởng và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp tr n m i trương nhân tạo

Cách tiến hành:

 Từ cây mẹ bị nhiễm bệnh ta vặt lá hăm só bình thường khoảng 2 tuần cho cây mọc chồi mới

 Đồng thời ta tiến hành gieo hạt trong ống nghiệm đợi cây phát triển hoàn chỉnh

 Tiến hành ghép chồi mới của cây bị bệnh với cây nuôi trong ống nghiệm

 Tiếp tục cho phát triển bình thường ta sẽ được cây mới có tỉ lệ sạch bệnh virus khá cao

2 Cách tiến hành nuôi cấy

2.1 Mụ đí h

- h trùng mẫu đỉnh chồi

- Khảo sát sự tái sinh cây trực tiếp từ nuôi cấ đỉnh chồi

- Khảo sát sự thành lập protocorm từ nuôi cấ đỉnh chồi

2.2 Nuôi cấy phát triễn thành cây trực tiếp

Nguyên vật liệu: Đoạn thân non cây cam hoặc chanh

i trường nuôi cấ : i trường MS bổ sung BA 2 ppm và NAA 0,2 ppm

Cách tiến hành:

 Các cành mẫu non lấy từ vườn ươm về được cắt bỏ hết lá, cắt th nh đoạn 2 – 3cm, cho vào bécher

 sạch cành mẫu bằng nướ ph ng loãng, s u đó r sạch xà phòng bằng nướ má nhiều lần dưới v i nướ hảy mạnh

 Đư nh mẫu vào tủ cấy vô trùng, ngâm trong cồn 70% trong 2 – 3 phút

 sạch cồn bằng nướ ất vô trùng 1 lần

 l mẫu bằng (O l)2 6% trong 10 ph t s u đó th bằng dung dịch Ca(OCl)2 5% trong 5 phút

 sạch mẫu bằng nướ ất vô trùng 6 – 7 lần cho hết mùi Javel

 Cành mẫu được cắt bỏ cuống lá v 2 đầu của phần thân đã bị chất kh trùng tẩy trắng Chia cành mẩu th nh á đốt 1cm

 Cắm á đốt v o m i trường nuôi cấ đã huẩn bị, cho phần cuống lá hướng lên trên, chồi ngủ phải nằm trên mặt thoáng củ m i trường

 Nuôi mẫu trong điều kiện sáng 2000lux/16h/ngày ở 25 độ

2.3 Nuôi cấy phát triễn â th ng qu gi i đoạn protocorm

Nguyên vật liệu: á đoạn chồi con Dendrobium cao 10cm

i trường nuôi cấ đỉnh sinh trưởng ( ho 1 m i trường):

 hoáng đ lượng Knudson 100mL

 Khoáng vi lượng Heller 5mL

 Skoog II MS: 2mL

 Vitamin Morel: 2mL

 Glycin: 2mL

 Inositol: 5mL

 Vitamin B1: 5mL

 Đường: 30g

 ướ dừa: 150mL

 Khoai tây: 60g

 Than hoạt tính: 0,25g

 pH: 5,5

 Agar: 6g

 hoáng đ lượng của Knudson C (Morel, G.M, 1965) + NH4NO3: 500mg/L + NH4(SO4)2: 500mg/L + Ca(NO3)2: 241,3mg/L + KCl: 250 mg/L + KH2PO4:

250 mg/L + MgSO4: 122,15mg/L

 hoáng vi lượng của Heller (1953) + AlCl3.6H2O: 0,054 mg/L + CuSO4.5H2O: 0,03 mg/L + H3BO3: 6,2 mg/L + KI: 0,01 mg/L + MnSO4.H2O: 0,08 mg/L + NiCl2.6H2O: 0,03 mg/L + ZnSO4.7H2O: 1,0 mg/L

á bướ tiến hành:

 sạch chồi D ndrobium dưới v i nướ hảy Dùng dao mổ lột hết các lá non bao xung quanh chồi ho đến khi để lộ r á hồi bên và chồi ngọn

 Ngân chồi trong nướ ph ng loãng v dùng g n l u nhẹ lên thân chồi cho sạ h ph ng dưới v i nướ hảy

 Lắc chồi trong cồn 70% trong 1 ph t u đó l với dung dí h j v l thương phẩm theo tỉ lệ 1 : 5 trong vòng 25 – 30 phút

 Trong tủ cấy, dùng kẹp vô trùng cho chồi vào các bécher có chứ nướ ất vô trùng lắ như thế 3 – 5 lần cho hết mùi javel

 Đặt các chồi lên giấy vô trùng.dùng dao cắt riêng từng chồi bên và chồI ngọn

ra khỏi chồi mẹ b n đầu hớ ắt bỏ hết các mô chết đã bị chất kh trùng l m trắng ở phần gốc chồi Cấy từng chồi vào ống nghiệm có chứ m i trường đã chuẩn bị

 Nuôi trong phòng sáng

 Ghi rõ tên nhóm, ngày cấy, giống cây vào tất cả các ống nghiệm

3 Ứng dụng vào một cây cụ thể

Tạo cây khoai tây sạch bệnh virus

ột hiện trạng sản xuất khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do qua trình nhân giống vô tính.Vì vậy cần tạo ra các giống khoai tây sạch bệnh virus Đó l l do m ng n kho i

tâ đ nhân giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến Để nhân giống in vitro khoaitây cần thực hiện á bướ s u:

- ướ 1: họn cây giống đủ tiêu chuẩn â đủ tiêu chuẩn lấy mẫu có chiều cao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập th ng thường nuôi cấy 8-0 cây trong bình 250ml

- ướ 2 : rót m i trường tạo củ v o á bình 250ml đã họn i trườn tạo củ gồm

v 12% s ros ượng m i trường cho vào mỗi bình là 50-70ml

- ướ 3 : Tiến hành nuôi cấy giống trong điều kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 20-22

độ

- ướ 4: u 2 tháng â đã hình thành củ Lúc này tiến hành thu hoạch củ in vitro

hư vậ đã tạo được củ sạch bệnh virus

IV Các cách kiểm tra đánh giá bệnh virus

- Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt

phương pháp hẩn đoán dựa trên việc quan sát, nhận biết các triệu chứng bệnh của cây

 Ưu điểm: đơn giản; ít tốn kém; dễ thực hiện

 hượ điểm: phải có kinh nghiệm; khó áp dụng khi cây nhiễm tổ hợp virus; phụ thuộc ngoại cảnh, tuổi â , đặ điểm giống

- Phương pháp chuẩn đoán bằng cây chỉ thị

Dùng dịch ép của thực vật cần được xét nghiệm để lây nhiễm trên 1 cây chỉ thị thích hợp hoặ dùng phương pháp ghép ó thể á định bệnh virus

Cây chỉ thị khi bị nhiễm virus sẽ biểu hiện nhiều triệu chứng đặ trưng

 Ưu điểm: nhạy, chính xác; có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp

 hượ điểm: Thời gian chuẩn đoán d i, ần thời gian ủ bệnh, phụ thuộc

v o điều kiện thí nghiệm, phương pháp lâ nhiễm phức tạp, tốn ng hăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh, một số bệnh virus không tiến hành được (bệnh cuốn lá)

- Phương pháp chuẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử

Kính hiển vi mang lại những kết quả đáng tin ậ đối với những xét nghiệm hàng loạt

 Ưu điểm: chính xác; tin cậy

 hượ điểm: Chi phí cao, số lượng mẫu hạn chế phương pháp lấy mẫu, x

lý mấu phức tạp, không áp dụng với một số bệnh virus

- Phương pháp huyết thanh

Phương pháp n dựa trên sự trộn lẫn huyết th nh đặc hiệu cho mỗi loại virus với dịch cây cần chẩn đoán bệnh

Có nhiều phương pháp hu ết th nh khá nh u như phương pháp kết tủa giọt, phương pháp ét nghiệm miễn dị h hướng tâm…

 Ưu điểm: nhạ , đặc hiệu (kết quả thu được trong 48h), chi phí thấp; không cần có nhà cách ly nuôi cấy chỉ thị

 hượ điểm: Có thể lẫn với một số dạng kết tủa khác; phản ứng khó xảy ra với nồng độ dịch cây bệnh thấp

- Phương pháp phân tích DNA

á định trực tiếp sự có mặt của ARN lõi của virus

hính á , đắt tiền

ơ đồ nguyên lý:

ARN virus => cDNA virus => phản ứng lai với ARN virus => nhận biết khi cDNA gắn phản xạ hoặc enzyme

- Phương pháp ELISA

Nguyên lý chung: Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể nhưng ở đâ kháng thể được liên kết với một enzyme (enzyme linked) Phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme dễ dàng nhận biết qua phản ứng mầu do hính mz m đó tác

 Enzyme thông dụng là photphataza kiềm

 ơ hất phản ứng là 4 nitrophenylphosphat khi bị tách phosphate sẽ thành α-nitro phenol sẽ có màu vàng

 Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân t ơ hất nên tín hiệu được khuế h đại khá rõ

 Có thể định tính, định lượng

Phân loại: 2 loại

 E I A th ng thường

 ELISA bắt kháng nguyên

- Phương pháp E I A th ng thường

 ước 1: Gắn kháng nguyên vào bản nhựa

 ước 2: Che chắn phần trống bằng protein

 ước 3: Bổ xung kháng thể đặc hiệu

 ước 4: Bổ xung cộng hợp enzyme

 ước 5: Bổ ung ơ hất

 ước 6: Phản ứng chuyển màu củ ơ hất được xúc tác bởi enzyme

- Phương pháp ELISA bắt kháng nguyên

 ước 1: Cho kháng thể vào các lỗ của bản th ủ ở 370C trong 2-4h, s u đó

r a

 ước 2: Cho dịch mẫu th vào các lỗ của bản th ủ ở 40C trong 12h, rồi

đ m r a lại

 ước 3: Bổ xung kháng thể gắn với enzyme ủ ở 370C trong 1 h

 ước 4: Bổ ung ơ hất phản ứng chờ một vài giờ

 ướ 5: Đọ tr n má so m u v đánh giá được kết quả

V Các phương pháp ngăn chặn quá trình tái lây nhiễm virus trên đồng ruộng

Nên trồng cây trong nhà cách ly (nhà màn, nhà kính) không chứa nguồn bệnh và các vetor truyền bệnh (rệp) hay ở nơi kh ng ó á m ng virus

Cần loại trừ thường xuyên các nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ các vật mang bệnh (côn trùng và tuyến trùng…), dọn cỏ thường xuyên

Phòng tránh sự lây nhiễm ơ giới trong quá trình hăm só â trồng

Thường xuyên chọn lọc, có thể bằng mắt hoặc qua các phân tích chuẩn đoán

Để hoàn toàn chắc chắn, nên duy trì vật liệu sạch bệnh in vitro

VI Tài liệu tham khảo:

https://pdfcoffee.com/ky-thuat-nuoi-cay-meristem-va-tao-cay-sach-benh-virus-pdf-free.html

https://123docz.net//document/3064726-ky-thuat-nuoi-cay-meristem-va-tao-cay-sach-benh-virus.htm