Virus free plant tissue culture ppt

Qua nghiên cứu của các nhà khoa học White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952): Nồng độ virus trong các cây bị bệnh phụ thuộc vào tốc độ phân chia của các tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào. Tế bào phân chia càng mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn.  Từ đây các ông đã đưa ra một kỹ thuật: kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã nhiễm bệnh. Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp lá hoặc thân cây nơi có thể sinh ra những phần mới từ đó, đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh sáng, nó chứa nhiều Auxin, nơi diễn ra trao đổi chất rất mạnh Kỹ thuật nuôi cấy meristem là phương pháp sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3 4 tiền phát khởi lá, tức lá đỉnh, có kích thước 0,10,5 mm tính từ chóp đỉnh sinh trưởng

VIRUS-FREE-PLANT TISSUE CULTURE

GIẢNG VIÊN:

SINH VIÊN:

Tổng quan

01

Nuôi cấy meristem

05

TỔNG QUAN

01

Virus thực vật là gì? Tác hại của chúng đối với cây trồng ra sao?

Tại sao lại phải phòng chống bệnh virus thực vật?

Làm thế nào tạo được cây sạch bệnh virus?

Whoa!

 Virus là một bệnh không

chữa được và có thể lây

truyền qua nhiều thế hệ

 Khoảng 600 loài virus thực

vật đã biết (ít nhất 80 loại có

thể truyền qua hạt giống)

 Gần như luôn được lây truyền qua sinh sản vô tính

 Virus có thể làm giảm năng suất, chất lượng và sức sinh trưởng của cây trồng

Tổng quan

Virus thực vật là những loại virus gây bệnh trên thực vật

Kỹ thuật tạo cây sạch bệnh virus

Hiện nay có 2 phương pháp

chính đó là:

 Kỹ thuật RNA interference

(RNAi – RNA can thiệp)

 Kỹ thuật làm sạch virus

invitro

Kỹ thuật làm sạch virus invitro:

4 phương pháp:

 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh

 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xư ̉ lz nhiệt độ cao

 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xư ̉ lz hóa chất

 Vi ghép

Nuôi cấy

meristem tạo cây sạch bệnh virus

02

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường

dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

là một công cụ hữu hiệu để tạo ra các cây trồng sạch bệnh

Khái quát

Dùng các phương pháp

chuẩn đoán bệnh virus để

thanh lọc các mẫu nhiễm

bệnh trước khi đưa vào

nuôi cấy, sử dụng biện

pháp nhân nhanh in vitro

để nhân nhanh mẫu sạch

Làm sạch virus ở mẫu đã bị nhiễm, sau khi đã tạo mẫu sạch thì tiếp tục sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân mẫu sạch

Khái quát

Để tạo cây sạch bệnh người ta có thể dùng các

phương pháp sau:

Kỹ thuật nuôi cấy meristem

(1934) (1950) (1952)

White & Cornuet Limasset Morel & Martin

Nồng độ virus

trong các cây bị

bệnh

• Tốc độ phân chia

• Khả năng sinh trưởng

 Tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã nhiễm bệnh Phân chia Nồng độ

• Mô phân sinh ngọn với 3 - 4 tiền phát khởi lá

• Có kích thước 0,1-0,5 mm

Kỹ thuật nuôi cấy meristem

Tại sao nuôi cấy meristem lại

tạo ra cây sạch bệnh

Các cách nuôi cấy meristem

03

Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt

Vi ghép

Các cách nuôi cấy meristem

Nuôi cấy đỉnh phân

sinh

Nuôi cấy merstem

kết hợp xử lý hóa

chất

 Tách chính xác meristem có kích thước < 0,3mm

 Nuôi cấy trên môi trường dinh

dưỡng thích hợp để tái sinh thành cây hoàn chỉnh

 Kiểm tra độ sạch của các cây tái sinh bằng các biện pháp khác

nhau để thu được cây sạch bệnh

Nuôi cấy đỉnh

phân sinh

 Ở nhiệt độ cao từ 36°C - 37°C thì một số

loại virus không có khả năng nhân lên

Lợi dụng đặc tính này có thể kết hợp

phương pháp nuôi cấy meristem với xử

lí nhiệt độ để tẩy sạch virus khuôn mẫu

 Biện pháp này cho phép có thế tách

meristem ở kích thước lớn hơn (0.5 -

1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây

thuận lợi hơn so với phương pháp tách

ở kích thước 0.1 - 0.2mm

Nuôi cấy meristem kết hợp

xử lý nhiệt

• Có thế nuôi cấy meristem với kích thước lớn (0.5 - 1mm) kết hợp với việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh

• Các chất kháng virus như: thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng đề kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus

2-• Phương pháp này đã được áp dụng trong việc tạo cây sạch virus ở thuốc lá, khoai tây, hoa loa kèn và đã thành công

Nuôi cấy meristem

kết hợp xử lý hóa

chất

 Là kĩ thuật ghép mô phân sinh đỉnh lên cây gốc sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro Thường được áp dụng trên những cây thân gỗ đặc biệt là

họ cam, chanh vì meristem của chúng không thể sinh trưởng

và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp trên môi trường nhân tạo

Vi ghép

Các cách nuôi cấy meristem

 Từ cây mẹ bị nhiễm bệnh ta vặt lá chăm sóc bình thường khoảng 2 tuần cho cây mọc chồi mới

 Đồng thời ta tiến hành gieo hạt trong ống nghiệm đợi cây phát triển hoàn chỉnh

 Tiến hành ghép chồi mới của cây bị bệnh với cây nuôi trong ống nghiệm

 Tiếp tục cho phát triển bình thường ta sẽ được cây mới có tỉ

lệ sạch bệnh virus khá cao

Cách tiến hành:

Chọn cây giống

đủ tiêu chuẩn

Rót môi trường

Ứ ng dụng vào một

cây cụ thể

Các cách kiểm tra

đánh giá bệnh

virus

04

Các cách kiểm tra đánh giá

Các cách kiểm tra đánh giá

 Phụ thuộc ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm

giống

Chẩn đoán bằng mắt

Các cách kiểm tra đánh giá

 Một số bệnh virus không tiến hành được (bệnh cuốn lá)

Chẩn đoán bằng cây chỉ

thị

Các cách kiểm tra đánh giá

Chẩn đoán bằng kính hiển

vi điện tử

Các cách kiểm tra đánh giá

 Ưu:

 Nhạy, đặc hiệu (kết quả thu được trong 48h), chi phí thấp;

 Không cần có nhà cách ly nuôi cấy chỉ thị

 Nhược:

 Có thể lẫn với một số dạng kết tủa khác;

 Phản ứng khó xảy ra với nồng độ dịch cây bệnh thấp

Huyết thanh

Các cách kiểm tra đánh giá

ARN virus => cDNA virus

=> phản ứng lai với ARN virus => nhận biết khi cDNA gắn phản xạ hoặc enzyme

Phân tích DNA

Các cách kiểm tra đánh giá

 Enzyme thông dụng là photphataza kiềm

 Cơ chất phản ứng là 4 nitrophenylphosphat khi

bị tách phosphate sẽ thành α-nitro phenol sẽ có màu vàng

 Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu được khuếch đại khá rõ

 Có thể định tính, định lượng

ELISA

Thông thường

Bắt kháng nguyên

Thông thường

Gắn kháng nguyên

vào bản nhựa

Che chắn phần trống bằng protein

Thông thường

Bắt kháng nguyên Cho kháng thể vào các lỗ của bản thử ủ ở 370C

trong 2-4h, sau đó rửa

Bổ xung cơ chất phản

ứng chờ một vài giờ

Cho dịch mẫu thử vào các lỗ của bản thử ủ ở 40C trong 12h, rồi đem rửa lại

Bổ xung kháng thể gắn với enzyme ủ ở 370C trong 1 h

Đọc trên máy so màu

và đánh giá được kết quả

Bắt kháng nguyên

Các phương pháp ngăn chặn quá trình tái lây

nhiễm

05

Các phương pháp ngăn chặn quá trình

tái lây nhiễm

xuyên

Phòng tránh sự lây nhiễm cơ giới trong quá trình chăm sóc cây trồng.is a gas giant and it has several rings

Các phương pháp ngăn chặn quá trình

tái lây nhiễm

Thanks!