BÀI GIẢNG: CÔNG NGHỆ HOÁ SINH docx

Babes 1885 đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tínhtổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng.. Ngày 25/05/1940 penicillin đã

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

CHƯƠNG 1 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH VÀ KHÁNG SINH BÁN

TỔNG HỢP

1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH

2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁN SINH PENICILLIN

3 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT β-LACTAM BÁN TỔNG HỢP

1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU

Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để

mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên

động vật nhiễm bệnh

Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tínhtổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng

Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus

subtilis có liên quan đến quá trình hình thành loài bào tử.

Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng điềutrị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn và ông là người đầu tiênxây dựng hoàn thiện phương pháp tìm kiếm và phát hiện vi sinh vật sinh tổng hợpchất kháng sinh trong tự nhiên

Năm 1929 thuật ngữ “chất kháng sinh” mới được Alexander Fleming mô tả một cáchđầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về penicillin

Năm 1931, các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt Năm 1938 ở Oxford, Ernst Boris Chain và Howara Walter Florey đã tiếp tục triển khai nghiên cứu này các ông đã tinh chế được một lượng lớn penicillin (1939) đủ để thử nghiệm trên các loạt động vật thí nghiệm Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột và chính thức được dùng điều trị thành công trên người (1941) trong nỗ lực cuối cùng nhằm cứu sống các thương binh bị nhiễm khuẩn nặng trong chiến tranh thế giới thứ hai.

Trong thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc của ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh non trẻ như:

* Khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh như: griseofulvin (1939), gramicidin S (1942), streptomycin (1943), bacitracin (1945), chloramphenicol và polymycin (1947), clotetracyclin và cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), vancomycin (1956), kanamycin và rifamycin (1957),

* Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến đã tạo ra những biến chủng công nghiệp có năng lực “siêu tổng hợp” các chất kháng sinh cao gấp hàng vạn lần các chủng ban đầu.

* Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công nghiệp để sản xuất penicillin G (1942) và hoàn thiện công nghệ lên men này trên những sản phẩm khác trong những năm tiếp theo.

* Năm 1959, phát hiện và tinh chế sử dụng thành công 6-aminopenicillinic acid (6APA) làm nguyên liệu

để sản xuất các chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp

1.2 KHÁI NIỆM CHẤT KHÁNG SINH

• Theo các nhà sinh học, kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp.

• Còn các nhà hoá học thì muốn định nghĩa kháng sinh sinh phải bao hàm cả các chất tổng hợp bằng hoá học có tác dụng diệt khuẩn như các chất thuộc quinolon.

“ Chất kháng sinh (antibiotic) là các chất hoá học xác định, không

có bản chất enzyme, có nguồn gốc sinh học với đặc tính ngay ở nồng độ thấp có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo được an toàn cho người hay động vật được điều trị”.

Tên kháng sinh Vi sinh vật sản xuất kháng sinh Hoạt phổ

Penicillin Penicillium chrysogenum Kháng khuẩn

Cephalosporin Cephalosporium acremonium Kháng khuẩn

1.3 CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH

• Làm rối loạn cấu trúc thành tế bào

• Rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào chất

• Làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein

• Rối loạn quá trình tổng hợp DNA

• Hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hoá trao đổi chất.

Đánh giá hiệu quả ứng dụng của chất kháng sinh:

• hoạt tính kháng sinh đặc hiệu, phổ kháng sinh

• tương tác qua lại giữa các loại thuốc khi sử dụng phối hợp

1.4 CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA CHẤT KHÁNG SINH

• Việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó.

• Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao cho chủng vi sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là đối với các loài có bào tử.

1.5 ĐIỀU CHỈNH SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH

• Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh

• Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá trình lên men.

1.5.1 Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh

Trải qua 6 giai đoạn cơ bản:

• Nghiên cứu xử lý tạo các biến chủng siêu tổng hợp có hoạt lực cao

• Tuyển chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm

• Thử nghiệm và tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot

sản xuất lớn công nghiệp

1.5.2 Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá

trình lên men

• nguồn cacbon thường được lựa chọn là: các loại bột và hạt ngũ cốc, cám

mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, các loại đường, dextrin, glyxerin, axit axetic, dịch thuỷ phân gỗ,

• Nguồn nitơ có thể là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chiết nấm men, pepton, các loại muối vô cơ chứa nitơ,

• Các nguyên tố khoáng đa lượng như: P, S, Mg, Fe, Ca, K, Na Các nguyên tố

vi lượng như: Cu, Zn, Co, Mo, và các chất kích thích sinh trưởng.

• Khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố khác trong môi trường như: nhiệt độ lên men tối ưu, pH, nồng độ oxy, thế oxy hoá - khử, cường độ sục khí, cường độ khuấy trộn dịch lên men,

1.6 CÁC BƯỚC CƠ BẢN TẠO CHẤT KHÁNG SINH DÙNG TRONG Y HỌC

Bước 1: Phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh dưới dạng thuần khiết Chọn lọc chủng cóhoạt phổ kháng sinh mong muốn Định tên chủng vi sinh vật tuyển chọn được

Bước 2: Nuôi cấy vi sinh vật sinh kháng sinh trong thiết bị lên men dung tích từ 5 – 100 lít.Chiết xuất, tinh chế để thu kháng sinh tinh khiết, xác định cấu trúc hoá học, thử sơ bộ vềđộc tính và một vài hằng số lý hoá của kháng sinh tìm được

Bước 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật sinh kháng sinh, tìm môitrường tối ưu để nuôi cấy Đột biến cải tạo giống bằng kỹ thuật di truyền cổ điển và kỹthuật gen để thu được chủng giống có năng suất cao, ổn định

Bước 4: Nghiên cứu dược lý của kháng sinh tìm được, tác dụng điều trị của kháng sinhbằng cách gây bệnh thực nghiệm trên động vật thí nghiệm

Bước 5: Nghiên cứu sản xuất kháng sinh trên qui mô công nghiệp bao gồm: môi trường lênmen, các thông số kỹ thuật của quá trình lên men, phương pháp chiết xuất và tinh chế đểđạt tiêu chuẩn dùng làm thuốc,

Bước 6: Nghiên cứu kinh tế và thị trường

1.7 PHƯƠNG HƯỚNG PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG

SINH

• Nghiên cứu sản xuất thêm các chế phẩm bán tổng hợp, mở rộng phổ điều trị và mang lại các đặc tính ưu việt hơn Nghiên cứu các hoạt tính mới của kháng sinh như: kháng nấm, kháng virus, kháng sinh có khả năng kìm hãm sự phát triển của các khối u,

• Hoàn thiện các phương pháp phân lập, tuyển chọn, tạo các biến chủng siêu tổng hợp, điều chỉnh đường hướng các quá trình trao đổi chất và đường hướng quá trình lên men, áp dụng các công nghệ tách chiết và tinh chế mới, hoàn thiện và áp dụng các kỹ thuật phân tích hiện

đại (đặc biệt là kỹ thuật “in vivo assay systems”), để triển khai sản xuất công nghiệp các

chất kháng sinh.

• Tiếp tục tìm kiếm phát hiện các chất kháng sinh mới, bao gồm cả mở rộng tìm kiếm phát hiện khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh sang các nhóm sinh vật khác

• Sản xuất các chế phẩm điều trị với sự phối hợp nhiều loại thuốc, mở rộng khả năng ứng dụng

và điều trị của các chất kháng sinh đã biết; đồng thời góp phần làm giảm nguy cơ kháng thuốc và hạn chế bớt các hiệu ứng không mong muốn của mỗi chất kháng sinh.

• Mở rộng thêm khả năng ứng dụng các chất kháng sinh vào các lĩnh vực kinh tế và khoa học khác như: ứng dụng trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, nông nghiệp, bảo vệ môi trường, nghiên cứu khoa học,

2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1 GIỚI THIỆU KHÁNG SINH PENICILLIN

Hình 1.1. Cấu trúc vòng β-lactam và khung penam

Hình 1.2. Cấu trúc của penicillin

Bảng 1.3 Cấu trúc phân tử của một số penicillin tự nhiên

Cơ chế tác dụng của họ kháng sinh

β-lactam

Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn?

Cơ chế tác dụng

2.2 CƠ CHẾ SINH TỔNG HỢP PENICILLIN Ở NẤM MỐC P

CHRYSOGENUM

Hỡnh 1.3 Sơ đồ cơ chế tổng hợp penicilin ở nấm mốc P chrysogenum

H2N CH C (CH2)3

OH O

C OH O

H2N CH C

CH2

OH O

2

CH C CH

(CH 2 ) 3 CONH

N SH

O

CH

H 2 N HOOC

(CH 2 ) 3 CONH

N S

COOH O

RCONH

N S

COOH O

H 2 N

N S

COOH O

Isopenicillin N

Penicillin N

Phenylacetic acid

Benzylpenicillin (Penicillin G)

axit aminoadipic Cystein Valin

aminoadipyl- cystein - valin

6-APA (6 amino penicillinic acid)

axit aminoadipic (H

ướ

ng 1 )

(Hướng 2)

H ướ

ng 3

2.3 QUY TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG

NGHIỆP 2.3.1 Đặc điểm chung

Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan) thì toàn bộ dây chuyền sản xuất penicillin có thể phân chia làm 4 công đoạn chính như sau:

• Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc G).

• Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên.

• Sản xuất các penicillin bán tổng hợp

• Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại

2.3.2 Chuẩn bị lên men

a Giống, bảo quản và nhân giống cho sản xuất

• Giống công nghiệp P chrysogenum được bảo quản lâu dài ở dạng đông

khô, bảo quản siêu lạnh ở -70oC hoặc bảo quản trong nitơ lỏng.

• Giống từ môi trường bảo quản được cấy chuyền ra môi trường thạch hộp

để hoạt hoá và thu bào tử Dịch huyền phù bào tử được cấy chuyền tiếp sang môi trường bình tam giác, rồi thiết bị nhân giống nhỏ, thiết bị nhân giống trung gian, và cuối cùng trên thiết bị nhân giống sản xuất.

b Chuẩn bị môi trường và thiết bị lên men

 Các thành phần môi trường thường được cân đong rồi pha chế riêng rẽ trong các thùng chứa phù hợp, sau đó thanh trùng gián đoạn ở 121oC (hay thanh trùng liên tục ở khoảng 140-146oC) hoặc bằng phương pháp siêu lọc rồi mới bơm vào trong thùng lên men.

 Thiết bị lên men trước khi đưa vào sử dụng phải được vô khuẩn, thường được thanh trùng bằng hơi nước ở áp suất 2,5-3 at trong thời gian 1-3h Sau khi khử trùng xong thiết bị được đưa vào sử dụng ngay Không khí thường được khử khuẩn sơ bộ bằng nén đoạn nhiệt, sau đó được lọc khử khuẩn bằng cách lọc qua màng vô khuẩn hoặc siêu lọc.

Bảng 1.4 Thành phần môi trường lên men cơ bản để lên men sản xuất

 Tiền chất tạo nhánh bổ sung liên tục theo nhu cầu Theo lý thuyết nhu cầu

về phenylacetat là 0,47g/g penicilin G hoặc 0,5g phenooxyacetat/g penicillin V

 Chất chống tạo bọt bổ sung liên tục theo nhu cầu

2.3.3 Kỹ thuật tiến hành lên men

• kỹ thuật lên men chìm được áp dụng trong hầu hết các cơ sở sản xuất penicillin vàthường được vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục gồm phương ánlên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hoặc bán liên tục) một hay một vàicấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại một phần hệ sợi của mẻ lên mentrước

khuấy trộn được điều chỉnh để duy trì nồng độ oxy hoà tan khoảng 30%.Dịch lên men ban đầu thường có pH khoảng 6,5-6,8; trong quá trình lên

thường khống chế trong khoảng 0,3-0,4 kg/m3 Chất phá bọt thường sửdụng là các loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, Thờigian lên men mỗi mẻ thường kéo dài trong khoảng 144-180h

2.4 XỬ LÝ DỊCH LÊN MEN, TINH CHẾ THU PENICILLIN 2.4.1 Lọc dịch lên men

• Thông thường, chỉ cần tiến hành lọc một lần trên thiết bị lọc hút kiểu băng tải

hoặc kiểu thùng quay rồi làm lạnh dịch ngay chuyển sang công đoạn tiếp theo

• Phần sinh khối nấm được rửa sạch, sấy khô và sử dụng để chế biến thức ăn gia

• Tỷ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn trong khoảng 4-10V dịch lọc/1V dungmôi

2.4.3 Tẩy màu

• Để tẩy màu người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứapenicillin sau trích ly Chất hấp phụ phổ biến thường là than hoạt tính Sau đó thanhoạt tính được tách và rửa lại bằng sử dụng thiết bị lọc kiểu băng tải hoặc thùngquay Phân than sau lọc tiến hành chưng thu hồi dung môi và xử lý hoàn nguyênphục vụ cho mẻ lên men sau

2.4.4 Kết tinh, lọc, rửa và sấy thu penicillin tự nhiên

hoặc Natri acetat hoặc tiến hành trích ly lại sang dung dịch KOH loãng rồitiến hành cô trong chân không ở nhiệt độ thấp Sau đó bổ sung BuOH đểpenicillin tự kết tinh

• Sau khi kết tinh, tinh thể penicillin được lọc tách bằng máy lọc hút thùngquay Khi sản phẩm đã đạt độ tinh sạch theo yêu cầu (thường độ tinh khiếtkhông dưới 99,5%) tiến hành lọc tách tinh thể Sau đó, rửa và làm khô sơ

bộ bằng dung môi kỵ nước như isopropanol hay butylalcohl, hút chân không

để tách dung môi và sấy bằng không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muốipenicillin

3 SẢN XUẤT CÁC β-LACTAM BÁN TỔNG HỢP TỪ PENICILLIN G

3.1 NHU CẦU SẢN XUẤT CÁC PENICILLIN BÁN TỔNG HỢP

3.1.1 Tác dụng điều trị của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

Tác dụng điều trị chính của penicillin và các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam là docấu trúc của penicillin có nhiều điểm gần gũi với dipeptid D-analin-D-analin, một hợpphần cấu trúc lớp peptidoglucan của thành tế bào Do đó, hoạt tính các enzyme thamgia tổng hợp thành tế bào bị biến đổi, các enzyme nhận nhầm cơ chất Kết quả làphần thành tế bào mới tổng hợp với sự nhầm lẫn sẽ không được hình thành, làm

đến chúng dễ dàng bị tự phân trong môi trường và bị hệ thống miễn dịch của cơ thểtiêu diệt

Đồng thời, các kháng sinh β-lactam còn liên kết đặc hiệu với một số protein trênmàng tế bào chất Sự liên kết này làm “bất hoạt” và “hoà tan” các protein đặc hiệu

phospholipid trong tế bào

3.1.2 Tại sao phải sản xuất kháng sinh bán tổng hợp

• Lý do 1: Nhiều trường hợp điều trị với penicillin đã xuất hiện hiện tượng kháng thuốc

• Biến chủng E coli gram âm và một số biến chủng B subtilis kháng thuốc phát triển bình

thường trong môi trường chứa penicillin

• Nguyên nhân của hiện tượng này?

• Để vô hiệu khả năng kháng thuốc, về nguyên lý có thể tiến hành như thế nào?

• Lý do 2: Trên phương diện điều trị

• Trong từng trường hợp cụ thể người thầy thuốc mong muốn có những chế phẩm khángsinh tương ứng với những đặc tính khác nhau như: thuốc có phổ kháng khuẩn rộng hoặcphổ kháng khuẩn hẹp hơn, thuốc bền với enzyme β-lactamase, thuốc dễ hấp thu, thuốc

ít phản ứng phụ, thuốc đào thải nhanh, hay đối với bệnh nhân các loại thuốc có thểuống thường an toàn và dễ được chấp nhận hơn Do đó, luôn mong muốn tìm ra các chếphẩm penicillin mới với đặc tính đa dạng và có khả năng chỉ định điều trị phong phúhơn

3.1.3 Nguyên tắc tạo kháng sinh mới

• nguyên tắc có thể hoàn thiện theo hướng lên men trực tiếp với các tiền chất tạo nhánh khác nhau để thu kháng sinh mong muốn hoặc không sử dụng tiền chất thu 6-APA làm nguyên liệu để tổng hợp các penicillin khác nhau.

• Con đường kinh tế hơn cả và được triển khai trong sản xuất lớn là chỉ lên men trực tiếp thu penicillin G hoặc V làm nguyên liệu từ đó tổng hợp các kháng sinh khác nhau bằng con đường bán tổng hợp.

3.2 SẢN XUẤT 6-APA VÀ SẢN XUẤT PENICILLIN BÁN TỔNG HỢP

3.2.1 Sản xuất 6-APA

Hình 1.7. Công thức cấu tạo của 6-APA

Có hai con đường khác nhau để tổng hợp 6-APA

kháng sinh như sơ đồ hình 1.3

• Con đường hiệu quả hơn cả hiện nay là lên men sản xuất penicillin G hoặc V;

để phân cắt mạch nhánh bên R

Con đường 1

H2N CH C

(CH2)3

OH O

2

CH C CH

COOH O

RCONH

N S

COOH O

H 2 N

N S

COOH O

Isopenicillin N

Penicillin N

Phenylacetic acid

Benzylpenicillin (Penicillin G)

axit aminoadipic Cystein Valin

aminoadipyl- cystein - valin

6-APA (6 amino penicillinic acid)

axit aminoadipic (H

ướ

ng 1 )

(Hướng 2)

H ướ

ng 3

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp 6-APA bằng con đường hoá học

Penicillin G

C 6 H 5 CONH

N S

COOSi(CH 3 ) 3 O

C 6 H 5 CONH

N S

COOSi(CH 3 ) 3 O

C 6 H 5 CONH

N S

COOSi(CH 3 ) 3 O

H 2 N

N S

COOH O

6-APA (6 amino penicillinic acid)

H 2 O

Con đường 2.1

Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp 6-APA bằng enzyme penicillin-acylase

Con đường 2.2

3.2.2 Sản xuất penicillin bán tổng hợp

Bảng 1.5 Một số kháng sinh

penicillin bán tổng hợp

• Từ 6-APA có thể dễ dàng tạo ra được nhiều chế phẩm penicillin bán tổng hợp khácnhau bằng cả hai con đường: acyl hoá trực tiếp từ 6-APA theo phương pháp hoáhọc hay sử dụng enzyme penicillin-acylase Tuy nhiên trong thực tế thường ápdụng phổ biến con đường acyl hoá trực tiếp theo phương pháp tổng hợp hoá học.

Ví dụ: Sản xuất Ampicillin bán tổng hợp từ 6-APA

Phương pháp A:

Phương pháp B:

3.3 SẢN XUẤT CEPHALOSPORIN BÁN TỔNG HỢP

3.3.1 Giới thiệu cephalosporin

Hình 1.10. Công thức cấu tạo vòng β-lactam và khung cephem

Hình 1.11. Công thức cấu tạo chung của họ kháng sinh

cephalosporin và cephalosporin C

Công thức cấu tạo chung của họ kháng sinh

cephalosporin

Kháng tốt Gram (+), rất kém với Gram (-)

Tăng hoạt tính kháng Gram (-) nhưng kém hơn thế hệ thứ 3

hoạt tính kháng Gram (+) kém nhưng kháng được Enterobactericeae bao gồm

cả vi khuẩn sinh β-lactamase

Mở rộng hoạt tính kháng hơn thế hệ 3 và bền với β-lactamase