PHẢN ỨNG Kháng nguyên – Kháng thể docx

Kháng nguyên• Điểm quyết định KN epitope: phần trên phân tử KN có khả năng liên kết đặc hiệu vào phần liên kết với KN trên phân tử KT... Phản ứng ngưng kết- A: không xảy ra khi cả 2 vị t

PHẢN ỨNG

Kháng nguyên – Kháng thể

BM Vi sinh - Khoa Y - ĐH Y Dược TP HCM

- đo lường các nhân tố ≠ tham gia / hệ thống MD

VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể

Nguyên lý phản ứng KN-KT

 Tính đặc hiệu

αa

αb b

a

c

Kháng nguyên A

αc

Kháng nguyên

• Điểm quyết định KN (epitope):

phần trên phân tử KN có khả

năng liên kết đặc hiệu vào phần

liên kết với KN trên phân tử KT

Tương tác KN - KT

Hiện tượng vùng

PHÂN LOẠI

A PƯ dựa trên sự tạo thành “hạt”:

1 PƯ kết tủa (precipitation reaction): KN hòa tan.

2 PƯ ngưng kết (agglutination reaction): KN hữu hình

B PƯ dựa trên hoạt động sinh học của KT:

1 PƯ kết hợp bổ thể (complement binding reaction)

2 PƯ trung hòa (neutralization reaction)

C PƯ MD đánh dấu:

1 PƯ MD huỳnh quang (immunofluorescence reaction)

2 PƯ MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)

3 PƯ MD phóng xạ (radio immmuno assay - RIA).

4 Thử nghiệm xác định Westein Blot (dấu thấm MD).

Các phản ứng MD cĩ độ nhạy khác nhau

Loại phản ứng MD Ngưỡng phát hiện (µg/ml)

Kết tủa / môi trường lỏng

Kết tủa / thạch:

- khuếch tán đơn (Mancini)

- khuếch tán kép (Ouchterlony)

- MD điện di (Immuno electrophoresis )

20   10 3 50 Ngưng kết: - trực tiếp

- gián tiếp

- NK vi khuẩn

0,5 0,001 0,001 Cố định bổ thể (CF) 0,1

Miễn dịch huỳnh quang (IF) 0,1

Định lượng MD phóng xạ (RIA) 0,0001

Định lượng MD enzym (EIA) 0,0001

* Các phản ứng MD thường dùng

trong Vi sinh lâm sàng

A PƯ ngưng kết (agglutination reaction)

Phản ứng ngưng kết

- A: không xảy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một KN

- B: xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các KN

- C: rất dễ xảy ra khi KT là loại IgM

Kháng nguyên

Tạo mạng

Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp

( thụ động )

* NK hồng cầu thụ động

gắn trên giá khoác

Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp

(thụ động) - 2

* NK hồng cầu thụ động đảo ngược

KT / giá khoác KN / mẫu

PHẢN ỨNG NGĂN NGƯNG KẾT HỒNG CẦU

(Hemagglutination Inhibition - HI)

B Các phản ứng MD đánh dấu

1 MD huỳnh quang (immunofluorescence - IF)

* Đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry):

đếm & phân loại TB

2 MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA).

VD: ∆ HBV, HCV, HIV, Rubella, …

1 PƯ MD huỳnh quang

1 PƯ MD huỳnh quang: nguyên lý

Định týp virus DEN bằng IF với KT đơn dòng

Virus sởi tạo hợp bào từ các TB Vero bị nhiễm Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi đã biết.

2 PHẢN ỨNG ELISA

(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay )

* Mục đích: định lượng KN hoặc KT hòa tan / dịch sinh học.

* Nguyên lý cơ bản:

* Kỹ thuật thực hiện: - "Cạnh tranh”

- "Không cạnh tranh"

Nhỏ H2SO4, giếng phản ứng: màu vàng λ

max = 450 - 610nm

Rửa, nhỏ TMB,

giếng phản ứng: chuyển sang màu xanh

KT đã biết có enzyme sẽ gắn với KN còn lại

MD cạnh tranh ELISA

Phản ứng màu tỉ lệ nghịch

với nồng độ kháng thể

b ELISA theo phương pháp “sandwich”

c ELISA “Tóm bắt”: MAC-ELISA

(IgM antibody capture-ELISA)

Máy đo quang

Giếng đã được gắn một lượng KN nhất định

 Ưu điểm của kỹ thuật ELISA

 - xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu

 - dùng máy tự động (±) => ↓ thao tác cá nhân

 - đọc kết quả không phụ thuộc vào chủ quan người làm XN

 - dữ liệu kết quả lưu được  kiểm tra chất lượng

 - giá thành xét nghiệm rẻ.

- là cơng cụ chủ yếu / ∆ bệnh nhiễm virus

 Nhược điểm của kỹ thuật ELISA

 - Thời gian thực hiện XN lâu hơn, kỹ thuật phức tạp

 - Chi phí máy móc ban đầu, chi phí bảo hành bảo dưỡng

 - Nhân viên xét nghiệm phải được đào tạo kỹ

 - số mẫu xét nghiệm ít => tốn kém do phải làm nhiều chứng

Nhỏ mẫu

Ghi nhận kết quả

(1) : dương tính

(2) : âm tính

(3) : không ý nghĩa

CÁC THỬ NGHIỆM NHANH

(test nhanh)

 Ưu điểm:

 - xét nghiệm với số lượng mẫu nhỏ

 - dễ thực hiện, cho kết quả nhanh

 - không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo quản

 - có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở

 - xét nghiệm viên có thể được đào tạo nhanh

CÁC THỬ NGHIỆM NHANH

(test nhanh)

 Nhược điểm:

 - giá thành cao

 - không thuận lợi khi xét nghiệm số mẫu lớn

 - không lưu được dữ liệu kỹ thuật

 - một số test nhanh có độ nhạy kém hơn so với ELISA

XÉT NGHIỆM KHẲNG ĐỊNH

WESTERN BLOT

Nguyên lý :

- chuyển sang giấy nitrocellulose: các proteine định vị theo PM

- phản ứng hiện màu với cơ chất: đọc được bằng mắt

 các băng màu ở vị trí có KT đặc hiệu với KN tương ứng

BIỆN LUẬN KẾT QUẢ

WB (-) : không có băng nào

WB (+): : có ít nhất 2 băng tương ứng với proteine vỏ

HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41 HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36 ngoài ra có các băng tương ứng với sản phẩm của gen gag/pol

WB chưa xác định : có băng ở vị trí khác tiêu chuẩn WB (+)

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1 Độ nhạy (ngưỡng phát hiện hàm lượng KN&KT):

Mỗi phản ứng có ngưỡng phát hiện ≠ nhau

-> nên định lượng.

2 Hiệu giá ranh giới: ranh giới giữa bình thường & bệnh lý.

VD: hiệu giá ranh giới của ASLO là 1:200

(200 đơn vị/ml huyết thanh)

-> (+) khi ≥ 400 đ.v/ml.

- IgM: xuất hiện trước

- IgG: xuất hiện sau, thay thế nhanh chóng cho IgM.