Microsoft Word 00 a loinoidau TV (moi thang1 2016) docx 94 Lê Thị Phượng KHUẾCH ĐẠI ĐẶC HIỆU VÙNG GEN ITS2 XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH HẢI DƯƠNG SPECI[.]
Trang 194 Lê Thị Phượng
KHUẾCH ĐẠI ĐẶC HIỆU VÙNG GEN ITS2 XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA NẤM
Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH HẢI DƯƠNG
SPECIFIC AMPLIFICATION OF THE ITS2 REGION FOR FUNGAL DETECTION IN
GASTRIC PATIENTS AT HAI DUONG PROVINCIAL GENERAL HOSPITAL
Lê Thị Phượng
Trường Đại học Hải Dương; Phuongsinh@ymail.com
Tóm tắt - 180 bệnh nhân viêm dạ dày đến khám và điều trị tự
nguyện tại bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương đáp ứng các tiêu
chuẩn của nghiên cứu Các bệnh nhân này được thu thập thông
tin như: tuổi, giới tính, nơi ở, công việc, số lần điều trị, đau thượng
vị, đầy bụng, khó tiêu, chán ăn sụt cân và được sinh thiết mẫu
tại các vị trí hang vị, thân vị và rìa các ổ loét hoặc các tổ chức thâm
nhiễm nghi ung thư dạ dày Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu
bệnh phẩm, khếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 và phân tích trình
tự gen, đồng thời nuôi cấy sinh thiết trên môi trường máu để xác
định sự có mặt của các loại nấm trong dạ dày người bệnh Kết quả
cho thấy, tỷ lệ nhiễm nấm là 70/180, chiếm 38,9%
Abstract - 180 gastric patients who met the standards of the study,
voluntarily came to Hai Duong Provincial General Hospital for examination and treatment Information about patients such as age, gender, residence, occupation, numbers of treatment, epigastric pain, bloating, indigestion, poor appetite and weight loss was collected These patients were taken for endoscopy to have endoscopic biopsy samples
at the antrum, body and edge of the gastric ulcer, organizations suspected of infiltrating stomach cancer DNA was extracted from
samples, specific amplification of the ITS2 region and gene sequence
analysis Simultaneously, blood and biopsy cultures were used to detect the presence of fungi in patients’ stomach The results have showed that fungal infection rate account for 38.9% (70/180)
Từ khóa - bội nhiễm nấm; gen ITS2; khuếch đại; nuôi cấy; viêm
dạ dày Key words - fungal super-infection; ITS2 gen; amplification;culture; gastritis
1 Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, công tác điều trị các bệnh
dạ dày kèm nhiễm Helicobacter pylori (H.pylori) ở Việt
Nam có tiến bộ nhờ sử dụng kết hợp các loại kháng sinh và
chất giảm tiết axit Tuy vậy ở thời điểm hiện tại, tỷ lệ chữa
khỏi các bệnh thấp, bệnh nhân phải điều trị nhiều lần với
các phác đồ điều trị khác nhau, rất tốn kém về tiền bạc và
mất nhiều thời gian điều trị do Helicobacter pylori đã trở
nên kháng thuốc kèm hiện tượng bội nhiễm các loại vi sinh
vật khác như nấm và các vi khuẩn non-H.pylori
Nhiễm vi sinh vật dạ dày tạo các nguy cơ cho sức khỏe
con người, rõ nhất là ung thư dạ dày, còn nhiễm trùng xâm
lấn của nấm dẫn tới nhiễm nấm máu, gây tử vong và tàn
phế Trong y văn thế giới, hiện tượng đã được dự đoán
nhiều năm về trước bởi Zboril V và Corea và được gọi là
sự phát triển vượt trội của các vi sinh vật dạ dày, bao gồm
C albicans, C tropical C parapsilosis, C glabrata và
C krusei [7]
Ở Việt Nam, hiện tượng nhiễm vi sinh vật dạ dày đã
được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 2000 Nấm
Candida được tìm thấy dưới đáy ổ loét dạ dày của bệnh
nhân Việt nam bởi Tạ Long và Trịnh Tiến Dũng [5] Các
nghiên cứu hợp tác với các nhà khoa học Trường Đại học
Tổng hợp New York xác nhận sự có mặt của nhiều vi
khuẩn non-H.pylori trong dạ dày người bệnh gây chảy
máu dạ dày [8] ITS2 được coi như một chỉ thị phân tử để
xác định tình trạng nhiễm nấm trong dạ dày người bệnh
[3] Hiện nay, ở tất cả các đơn vị Bệnh viện đa khoa tuyến
tỉnh cũng như tuyến huyện tại Hải Dương, các nghiên cứu
về bội nhiễm nấm dựa trên công nghệ gen vẫn chưa được
tiến hành Nghiên cứu này nhằm mục đích: Thiết lập
phương pháp khuếch đại PCR đặc hiệu vùng gen ITS2 để
xác định sự có mặt của nấm trong các mẫu bệnh phẩm
dạ dày
2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1 Đối tượng
180 bệnh nhân viêm dạ dày khám, điều trị tự nguyện tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương và đáp ứng các tiêu chuẩn: i) Tuổi từ 18- 80; ii) Bị viêm dạ dày mạn tính, loét hoặc ung thư dạ dày; iii) Không dùng kháng sinh trong thời gian 01 tháng cho tới khi nội soi
2.2 Phương pháp Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu bệnh phẩm được lấy dưới sự tự nguyện của người bệnh và gia đình bệnh nhân Trước khi lấy mẫu các bác sĩ
có giải thích cho bệnh nhân và gia đình bệnh nhân vì sao cần thiết phải tiến hành thí nghiệm này Các kết quả nghiên cứu khi công bố sẽ không ghi rõ họ tên của người bệnh và gia đình bệnh nhân Bệnh nhân tự nguyện tham gia làm các xét nghiệm và có thể rút khỏi chương trình nghiên cứu bất
cứ lúc nào khi cần thiết
180 bệnh nhân được tiến hành phỏng vấn về các yếu tố dịch tễ, sau đó được nội soi, chụp ảnh và xác định các thể bệnh viêm mạn, loét, ung thư dạ dày Vị trí sinh thiết của
dạ dày gồm hang vị, thân vị, rìa các ổ loét, các tổ chức thâm nhiễm nghi ung thư Mỗi bệnh nhân lấy 2 mảnh niêm mạc
dạ dày: 1 mảnh tại hang vị và 1 mảnh ở thân vị Mảnh sinh thiết cần phải có kích thước 2 - 3 mm, là mô sống, không phải là tổ chức hoại tử, không dính máu và không dính mật Thủ thuật nội soi được thực hiện bởi các bác sĩ Khoa Thăm
dò chức năng Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương
Mẫu sinh thiết được lưu trữ trong bình nitơ lỏng, sau đó bảo quản ở -700 C cho tới khi tách chiết DNA
Tách chiết DNA từ bệnh phẩm
180 mẫu bệnh phẩm được tách chiết DNA qua các
bước: phân hủy bằng Proteinase K; loại protein và mỡ bằng
Trang 2ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 11(108).2016, Quyển 1 95 Phenol/chloroform/isoamylalcohol; tủa DNA bằng cồn
nồng độ cao hoặc isopropanol
Mẫu DNA được đánh giá chất lượng và hàm lượng tách
chiết bằng điện di trên gel agarose, nhuộm EtBr, quan sát
và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại; độ tinh sạch được đánh
giá bằng đo phổ hấp thụ bước sóng 260/280 nm
DNA được hòa trong 100-200µl 1x TE Nồng độ và độ
tinh sạch của chế phẩm DNA được kiểm tra trên thiết bị đo
quang phổ ở hai bước sóng 260nm và 280nm hoặc trên máy
NanoDrop1000, Thermo Scientific
Phản ứng PCR khuếch đại gen ITS2 xác định mức độ
nhiễm nấm
1-10 ng ADN được sử dụng để khuếch đại vùng ITS2
có kích thước khoảng 350bp bằng phương pháp PCR trong
thể tích phản ứng 20µl với cặp mồi:
ITS3 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;
ITS4 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’
Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl DNA
khuôn; 2,5 µl cặp mồi (ITS3-ITS4); 2,5 µl dNTP; 2,5 µl
đệm PCR10x; 1,0 µl DNA polymerase (1 U/µl); 9,0 µl
nước cất PCR
Các thành phần phản ứng PCR được trộn nhẹ nhàng
trong ống Eppendorf và thực hiện phản ứng với chu trình
nhiệt như sau: 5 phút hot-start; 35 chu kỳ của (94°C 60
giây, 58°C 45 giây, 72°C 60 giây); 72°C trong 5 phút; hạ
nhiệt độ phản ứng PCR xuống 14°C đến khi lấy mẫu
Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 5µl sản phẩm PCR trộn
với 1µl đệm tra mẫu (loading buffer), hỗn hợp này được
nhỏ vào các giếng trên gel Tiến hành điện di các mẫu DNA
cùng với mẫu đối chứng dương và thang DNA chuẩn để
ước lượng kích thước phân tử DNA Các băng DNA sẽ hiện
hình dưới dạng những vệt sáng trên bản gel điện di So
sánh kích thước ước đoán của mẫu nghiên cứu với mẫu
chứng dương và marker phân tử để xác định sự có mặt của
gen ITS2
Đọc trình tự đoạn ITS2
Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen ITS2 đặc hiệu sẽ
được làm sạch bằng QIAquick PCR purification Kit
(Qiagen, USA) và gửi đọc trình tự gen trực tiếp từ sản phẩm
PCR bằng máy đọc giải trình tự ABI 3730XL (Macrogen,
Korea) Kết quả đọc trình tự được xử lý, căn chỉnh và so sánh
với các trình tự gen đã có trong ngân hàng gen bằng phần
mềm BioEdit 7.1.3; trình tự gen thu được được dóng hàng
cột bằng ứng dụng BLAST trong ngân hàng dữ liệu NCBI
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Tách chiết và xác định nồng độ DNA bệnh phẩm
Tách chiết DNA từ 180 mẫu mô bệnh phẩm của bệnh
nhân viêm dạ dày tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương
Sau khi tách chiết, tiến hành kiểm tra nồng độ và độ tinh
sạch DNA bằng phương pháp đo mật độ quang và điện di
trên gel agarose 1,5% Kết quả được thể hiện ở Hình 1
DNA được tách chiết theo quy trình phenol/chloroform
để phân tích trình tự gen 16S rRNA Hình ảnh điện di cho
thấy các băng ở các giếng đều gọn, đẹp và có kích thước
phân tử lớn hơn 10 kb chứng tỏ DNA đã tách chiết có độ
tinh sạch cao, ít bị đứt gãy và có thể sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
Hình 1 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số được tách chiết từ
mẫu bệnh phẩm Giếng 1-16: Các mẫu được tách chiết DNA;
Giếng 17: Thang DNA chuẩn 1 kb
3.2 Phân tích trình tự gen ITS2 phát hiện nấm trong các mẫu nghiên cứu
Sau hàng loạt thử nghiệm tối ưu hoá bằng cách thay đổi nhiệt độ gắn mồi (Ta) của mồi với DNA khuôn mẫu, nhiệt
độ gắn mồi tối ưu của phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu
đoạn gen ITS2 được chọn là 58oC
Hệ vi sinh vật dạ dày người (động vật) và các hệ lụy do chúng gây nên đối với con người phức tạp hơn chúng ta vẫn hình dung Theo Zboril, thông thường các loại vi sinh vật kị khí không có trong dạ dày người khỏe mạnh [7] Năm
2001, giáo sư người Nga Bondarenko đã nuôi cấy vi khuẩn
ở điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dạ dày và đã nhận diện được
các loài vi sinh vật thuộc 32 chi như Helicobacter pylori,
nấm Candida, Bacteroides, Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium [2] Ngoài việc nhiễm
các loại vi khuẩn, việc nhiễm nấm trong các bệnh viêm dạ dày cũng là 1 vấn đề được quan tâm, do nó ảnh hưởng đến kết quả điều trị [4] Các loại nấm nhiễm đã được tìm thấy
trong các bệnh nhân viêm dạ dày có thể là: Ascomycete sp., Engyodontium album,…[1] Tình trạng nhiễm các loại nấm
được phát hiện bằng phương pháp PCR khuếch đại đoạn
gen ITS2 kích thước khoảng 350 bp, kết hợp đọc và phân
tích trình tự gen (Hình 2)
Hình 2 Kết quả khuyếch đại vùng ITS2 của nấm từ DNA
sinh thiết dạ dày M: Marker DNA chuẩn 100 bp (Invitrogen);
Giếng 1-9: Mẫu nghiên cứu; Giếng CA: Đối chứng âm;
Giếng CD: Đối chứng dương
Kết quả ở Hình 2 cho thấy, giếng 3,4 không xuất hiện băng DNA và giống như giếng CA - mẫu chứng âm Còn các giếng 1,2,3,5,6,7,8,9 là mẫu nghiên cứu, xuất hiện một băng DNA trên bản gel điện di, vị trí băng này trùng với vị trí băng DNA của mẫu chứng dương (CD - mang đoạn
ITS2) So sánh với marker phân tử 100 bp thì băng DNA
mẫu xét nghiệm có kích thước ước đoán khoảng 350 bp
Chứng tỏ các mẫu nghiên cứu mang trình tự ITS2
Trang 396 Lê Thị Phượng
Để khẳng định chắc chắn các mẫu xét nghiệm nhiễm
nấm, chúng tôi tiến hành đọc trình tự gen vùng ITS2, đối
chiếu trên Genbank, đồng thời nuôi cấy sinh thiết trên môi
trường thạch máu Kết quả cho thấy, các nấm gây chảy máu
dạ dày Trachypithecus cristatus, Engyodontium album,
Ascomycete sp, BMP2899 (chưa định tên) đã được tìm thấy
trong mẫu bệnh phẩm của một số bệnh nhân Một số loài
nấm khác Macaca arctoides, Ascomycete, Trachypithecus
obscurus, Engyodontium cũng được tìm thấy ở sinh thiết
dạ dày các bệnh nhân, nhưng vai trò gây bệnh của chúng
vẫn chưa được biết rõ Kết quả tại Hình 3 cho thấy hình
ảnh bội nhiễm các loại nấm
Hình 3 Bội nhiễm nấm khi nuôi cấy sinh thiết trên
môi trường thạch máu
Sản phẩm PCR vùng gen ITS2 được làm sạch và được
phân tích trình tự Kết quả được thể hiện tại Hình 4
Một số kết quả trình tự gen ITS2 của các bệnh nhân:
Hình 4 Trình tự gen đoạn ITS2 ở một số mẫu nghiên cứu
Trong số các loại nấm được tìm thấy, có 6 loại nấm đã
định tên là: 1 Nấm Macaca arctoides; 2 Nấm
Engyodontium album, loài gây bệnh cho người, gây chảy
máu dạ dày; 3 Nấm Ascomycete sp, loài gây bệnh cho
người; 4 Nấm Trachypithecus obscurus; 5 Nấm
Ascomycete sp; 6 Nấm Trachypithecus cristatus hiếm gặp,
gây chảy máu dạ dày và 1 loại nấm chưa định tên (This fungus, rarely seen as a human pathogen dealing with gastric bleeding - nấm này hiếm khi thấy, nhưng được coi
là một tác nhân gây chảy máu dạ dày người)
Theo kết quả phân tích PCR, trong số 180 mẫu bệnh
nhân viêm dạ dày, có 70 mẫu dương tính với cặp mồi ITS2,
tương ứng với tỷ lệ nhiễm nấm là 38,9% Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu của Mallory (2015) sử
dụng phương pháp phân tích trình tự gen ITS2 cho thấy sự
có mặt của hàng loạt các loại nấm Alternaria, Aspergillus,
Cladosporium, Fusarium và Penicillium [6]
4 Kết luận
Qua nghiên cứu 180 mẫu DNA từ bệnh nhân viêm dạ dày đến khám và điều trị tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải
Dương, khuếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 xác định sự có
mặt của nấm, đồng thời nuôi cấy sinh thiết trên môi trường thạch máu, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm là khá cao 70/180 (chiếm 38,9%) Trong số các loại nấm được tìm
thấy, nấm Macaca arctoides và Trachypithecus obscurus
chiếm tỷ lệ cao hơn các loại nấm khác
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Alga Zuccaro, Conrad L Schoch, Joseph W Spatafora, Jan Kohlmeyer, Siegfried Draeger,and Julian I Mitchell, 2008 Detection and Identification of Fungi Intimately Associated with the
Brown Seaweed Fucus serratus Appl Environ Microbiol 74(4):
931–941
[2] Bondarenko VM , 2001 Bacterial pathogenicity islands Zh
Mikrobiol Epidemiol Immunobiol (4):67-74
[3] Consuelo Ferrer, Francisca Colom, Susana Frasés, Emilia Mulet, José L.Abad, and Jorge L Alió, 2001 Detection and Identification of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S
Ribosomal DNA Typing in Ocular Infections J Clin Microbiol;
39(8): 2873–2879
[4] Nguyen Thi Hong Hanh, Nguyen Van Thinh, Nguyen Thi Nguyet,
Ta Long, Nguyen Quoc Khang, Tran Van Hop, 2008 Fungi – status
and gastritis in Viet Nam 7 th congress on gastroenterology of Shouth East Asian nations joint 14 th VNGE Annual Scientific Meeting, pp 742 – 748
[5] Tạ Long, Nguyễn Văn Thịnh, Trịnh Tiến Dũng và cs, 2007, ”Phát hiện nấm Candida parapsilosis trong mảnh sinh thiết dạ dày bệnh
nhân viêm dạ dày mạn tính“, Tạp chí Khoa học tiêu hóa Việt Nam,
II(6), pp 355 – 361
[6] Mallory J Suhr, 2015 Characterization and investigation of Fungi inhabiting the gastrointestinal tract of healthy and diseased humans
University of Nebraska - Lincoln Dissertations & Theses in Food Science and Technology Food Science and Technology Department
[7] Prucek R., Tuček J, Kilianová M, Panáček A, Kvítek L, Filip
J, Kolář M, Tománková K, Zbořil R., 2011 The targeted antibacterial and antifungal properties of magnetic nanocomposite
of iron oxide and silver nanoparticles, Biomaterials Jul;32(21):
4704-13
[8] Nguyễn Văn Thịnh, Tạ Long, Trần Văn Hợp, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2009, „Nghiên cứu mật độ Helicobacter pylori và tổn thương
mô bệnh học trong viêm dạ dày mạn“, Báo cáo tại Hội nghị nghiên
cứu khoa học lần thứ III - Hội khoa học Tiêu hóa Hà Nội
(BBT nhận bài: 19/8/2016, phản biện xong: 03/10/2016)