Improved rifamycin b production by nocardia mediterranei MTCC 14 under solid state fermentation through process optimization

Cải tiến sản xuất kháng sinh Rifamycin B nhờ Nocardia mediterranei MTCC 14 trong quá trình lên men ở trạng thái rắn thông qua tối ưu hóa quy trình. (Improved Rifamycin B Production by Nocardia mediterranei MTCC 14 under SolidState Fermentation through Process Optimization)

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài 2: Cải tiến sản xuất kháng sinh Rifamycin B

nhờ Nocardia mediterranei MTCC 14 trong quá trình lên

men ở trạng thái rắn thông qua tối ưu hóa quy trình.

(Improved Rifamycin B Production by Nocardia mediterranei MTCC 14 under Solid-State

Fermentation through Process Optimization)

Trang 2

NỘI DUNG

2

1 2

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3 4

GIỚI THIỆU

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

TỔNG KẾT

8/27/22

Trang 3

Được phân tách lần đầu tiên tại Italia

năm 1959 bởi nhà khoa học Sensi và các đồng nghiệp

Được phân tách trong dịch lên men

của Amycolatopsis mediterranei trong

điều kiện lên men đặc biệt, có sự có mặt acid diethylbarbituric

Rifamycin B có cấu trúc hoá học

được xác định năm 1964

Rifamycin B

Phần 1: GIỚI THIỆU

38/27/22

Trang 4

Chức năng kháng sinh

4

Được sản xuất bởi chủng Nocardia mediterranei

Kháng khuẩn mạnh, ít độc, dễ phân huỷ sinh học

Ức chế tổng hợp RNA bằng liên kết với RNA polymerase.

Phương thức chính trong điều trị bệnh lao, bệnh phong, AIDS, nhiễm trùng

Ansamycin

8/27/22

Trang 5

• Môi trường lên men gần giống với môi trường

tự nhiên

• Tận dụng phế phẩm nông nghiệp để làm chất nền cung cấp Carbon và năng lượng

Ưu điểm

• Khó kiểm soát về điều kiện về độ ẩm, nhiệt độ.

Nhược điểm

8/27/22

Trang 6

Bánh dầu hoa hướng dương

6

 Số lượng lớn do hạt hướng dương là nguồn cung cấp dầu ăn lớn thứ hai thế giới

 Nguồn nguyên liệu đa dạng, giá thành rẻ

 Giàu Nito, Carbon, khoáng chất.

8/27/22

Trang 7

Phương pháp tm bề mặt đáp ứng và thiết kế Placket-Burman (RSM)

8/27/22

Trang 8

Vật liệu

- Nocardia mediterranei MTCC14 thu được từ Ngân hàng Gen, Chandigarh, India

- Nguyên liệu thô: dầu hướng dương(sấy khô, xay nhỏ với kích thước hạt 200 –

500 µm) từ Raja Fat và Feeds Private Limited, Rapura, Punjab, India

Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Trang 9

Nuôi cấy vi sinh vật

Agar 20 Thu bào tử sao cho đạt 2.10

6 bào tử/mL, giữ trong nước cất chứa 0,01% Tween 80

Trang 10

Lên men tạo Rifamycin B

pH: 7; 7.5; 8; 8.5; 9

Môi trường

Bánh dầu hướng dương

Độ ẩm: 40, 45, 50, 55, 60 (%) Barnital : 1, 2, 3, 4, 5 (%)

Trang 11

Lên men tạo Rifamycin B

MÔI TRƯỜNG LÊN MEN

Trang 12

Chiết và ước lượng Rifamycin B

Khuấy (1h, 200rpm)

Lọc (vải mỏng)

Ly tâm (2070 vòng – 10 phút) Rifamycin B 0.1 mL

+ 5 mL đệm acetate (pH = 4.63)

Đo ở bước sóng 425 nm

0.1% NaNO2

Trang 13

Tối ưu hóa môi trường lên men

Thiết kế thí nghiệm: phương pháp bề mặt đáp ứng+ Thiết kế Plackett-Burman

+ Thiết kế cấu trúc có tâm (central composite design - CCD)

Trang 14

Trang 15

Thiết kế Plackett-Burman

Trang 16

Trang 17

Trang 18

Thiết kế cấu trúc có tâm – CCD ( hay thiết kế Box-Wilson (BW))

Trang 19

Thiết kế cấu trúc có tâm – CCD ( hay thiết kế Box-Wilson (BW))

Mức mã hóa (coded level) được tính như sau:

Sản lượng Rifamycin B được phân tích bằng cách sử dụng

phương trình đa thức bậc hai. Phương trình mô hình để

phân tích:

Trang 20

+ Chất lượng của sự phù hợp của phương trình

mô hình đa thức được thể hiện qua hệ số xác định R2

+ Ý nghĩa thống kê của nó đã được kiểm chứng bởi F-test. Mức ý nghĩa được đưa ra khi giá trị Prob>F nhỏ hơn 0,1

Phân tích dữ liệu

Trang 21

 SÀNG LỌC CÁC NGUỒN CACBON VÀ NITO, BARBITAL, ĐỘ

ẨM, pH ĐỂ SẢN XUẤT RIFAMYCIN B

LÝ THỰC SỰ TĂNG NỒNG ĐỘ RIFAMYCIN B CỦA MTCC14

Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Sàng lọc các nguồn cacbon và nitơ, Barbital, pH và độ ẩm để sản xuất Rifamycin B

218/27/22

Trang 22

Nguồn cacbon, nito trong môi trường cơ bản ở mức 5% (w/w)

Trang 23

Bảng 1: Mức độ của các thông số sản xuất để sản xuất Rifamycin B từ Nocardia mediterranei MTCC14

bằng cách sử dụng thử nghiệm thiết kế Plackett-Burman.

238/27/22

Trang 24

Bảng 2: Sản lượng Rifamycin B từ Norcadia mediterranei MTCC14 sử dụng các mức biến sản xuất

khác nhau theo phương pháp Plackett-Burman.

1 glucose, 2 maltose, 3 ribose, 4 galactose, 5 cao thịt bò, 6 bột đậu phộng, 7 ammonium

Trang 25

Bảng 3: Dữ liệu kiểm tra thiết kế ANOVA của Plackett-Burman cho các thông số sản xuất quan trọng.

258/27/22

Trang 26

Bảng 4: Các biến số sản xuất và các giá trị được mã hóa và thực tế của chúng được sử dụng để tối ưu hóa sản xuất

rifamycin B từ MTCC14 bằng cách sử dụng thiết kế hỗn hợp trung tâm.

268/27/22

Trang 27

Kết quả

- Nguồn cacbon ở mức 5% (w/w) tác động tích cực đến việc sản xuất Rifamycin B (hình 1)

- Việc bổ sung glucose, maltose, ribose và galactose cho thấy sản lượng Rifamycin

B thu được cao nhất ở 5.78, 4.89, 4.35 và 3.87 g/kgds oil cakes ở ngày ủ thứ tám

278/27/22

Trang 28

Hình 2: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau (7% w/w) lên rifamycin B sản xuất bởi Nocardia mediterranei MTCC 14 sử dụng bánh dầu hướng dương trong quá trình lên men ở trạng thái rắn Cl: kiểm soát, PM: bột đậu phộng, Be: cao thịt bò, SM: bột đậu nành, AS: amoni sunfat, và AC: amoni

clorua.

288/27/22

Trang 29

Bột đậu nành không ảnh hưởng đến năng suất rifamycin B (Hình 2) so với đối chứng (CL) Hầu như tất cả các nguồn nitơ được thử nghiệm đều làm tăng rifamycin B sản xuất ở ngày thứ tám của quá trình ủ

298/27/22

Trang 30

Hình 3: Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của barbital (% w/w) đến sản xuất rifamycin B bởi Nocardia mediterranei MTCC14 bằng cách sử dụng bánh dầu hướng dương trong quá trình lên men ở trạng thái rắn

308/27/22

Trang 31

Barbital điều hòa thụ động hệ thống vận chuyển electron và tăng khả năng tiếp cận oxy với hoạt động tế bào, do đó cải thiện sản xuất Rifamycin B

Việc bổ sung với các nồng độ barbital khác nhau cho năng suất Rifamycin

B cao hơn đáng kể ở ngày thứ 8 của ủ

318/27/22

Trang 32

Hình 4: Ảnh hưởng của các mức độ pH khác nhau đến sản xuất rifamycin B bởi Nocardia mediterranei MTCC 14 sử dụng bánh dầu hướng dương lên men ở trạng thái rắn.

328/27/22

Trang 33

pH 8,5 là tối ưu cho sản xuất tối đa Rifamycin B từ bánh dầu hoa ở trạng thái rắn.

338/27/22

Trang 34

Hình 5: Ảnh hưởng của các mức độ ẩm khác nhau (%) đến rifamycin B sản xuất bởi Nocardia mediterranei MTCC 14 sử dụng bánh dầu hướng dương trong quá trình lên men ở trạng thái rắn.

348/27/22

Trang 35

Bánh dầu hướng dương khô 8,65 g/kgds ở độ ẩm 55% => thu được lượng Rifamycin B tối đa.

Tăng độ ẩm vượt quá 60% gây ra giảm sản xuất rifamycin B, có thể là do trao đổi khí kém do nước thấm vào khoảng trống giữa các hạt môi trường rắn

358/27/22

Trang 36

3.2 Sàng lọc các tham số sản xuất bằng PlackettBurman Design Test.

368/27/22

Trang 37

Ảnh hưởng của Galactose, Glucose, Ribose

và pH lên Rifamycin B

378/27/22

Trang 38

 Sử dụng phương pháp mặt mục tiêu nhằm

tối ưu hóa quy trình phân tích

 Một thiết kế mặt mục tiêu kết hợp với mô

hình lặp tâm với 30 thí nghiệm đã được xây

dựng cho bốn yếu tố khảo sát ảnh hưởng

của Galactose (X4), ribose (X3), glucose

(X1) và pH (X10) lên năng suất rifamycin

Trang 39

Tính toán

 Giá trị trung bình của năng suất rifamycin B được lấy để phân tích hồi

quy bội trên dữ liệu thực nghiệm

 Phương trình đa thức bậc hai sau đây đã được phát triển:

3.3 Ảnh hưởng của Galactose,Glucose, Ribose và pH lên Rifamycin B

398/27/22

Trang 40

Bảng 7: Hệ số của các mô hình quá trình đa biến

cho sản xuất rifamycin B từ chủng Mediterranei

MTCC

Galactose (X4), ribose (X3), glucose (X1) và pH (X10)

 GA và RI có ảnh hưởng tuyến tính dương

 GL và pH ảnh hưởng tuyến tính âm

 GA có tác động lớn nhất lên sản lượng

Rifamycin B

 Tương tác giữa RI và pH và giữa GA và RI

ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất Rifamycin B

3.3 Ảnh hưởng của Galactose, Glucose, Ribose và pH lên Rifamycin B

40

8/27/22

Trang 41

Hình 7:Biểu đồ giữa galactose

và ribose trong quá trình sản

Trang 42

Hình 8 :Biểu đồ giữa Galactose

và Glucose trong quá trình sản xuất rifamycin B

 Rifamycin B tối đa (5,57 g / kgds) khi:

Trang 43

Hình 9 :Biểu đồ giữa Galactose và pH

trong quá trình sản xuất rifamycin B

Trang 44

Hình 10 :Biểu đồ giữa Glucose và RI trong

quá trình sản xuất rifamycin B

Rifamycin B tối đa tại

Trang 45

Hình 11 :Biểu đồ giữa pH và RI trong quá trình sản xuất rifamycin B

Rifamycin B tối đa tại

Trang 47

3.4 Phân tích thống kê

478/27/22

Trang 48

Đồ thị giữa sản lượng thực tế và dự đoán của rifamycin B

3.5 Sự phù hợp của mô hình

48

8/27/22

Trang 49

3.6 Xác nhận mô hình

Các giá trị tối ưu được tìm thấy như sau: galactose 8% w/w, ribose 3% w/w,

glucose 9% w/w, và pH 7,0.

Mức tối ưu của các thông số sản xuất để sản xuất rifamycin B từ Nocardia

mediterranei MTCC 14 là 9,87 g/kgds, rất gần với giá trị dự đoán là 10,35 g/kgds.

498/27/22

Trang 50

Tối ưu hóa thông số trong quy trình sản xuất rifamycin

Chủng VSV được lên men trong môi trường rắn (SFF) => Kháng sinh sẽ được chiết xuất => ước lượng => Thiết kế thử nghiệm với 11 thông số (glucose, maltose, ribose, galactose, beef extract, peanut meal, ammonium chloride, ammonium sulphate, barbital, pH và độ ẩm)

Phương pháp bề mặt đáp ứng: Plackett-Burman => xác định những thông số quan trọng ; Thiết kế cấu trúc có tâm => tối ưu hóa những thông số

Phần 4: KẾT LUẬN

508/27/22

Trang 51

Các thông số để sản xuất rifamycin B cao nhất từ Nocardia

mediterranei MTCC 14 được tìm thấy là galactose (8% w/w), ribose

(3% w/w), glucose (9% w/w) và pH (7.0)

Sản lượng rifamycin B tối đa từ Nocardia mediterranei MTCC 14 là

9,87 g / kgds bánh dầu hướng dương khô

Phần 4: KẾT LUẬN

518/27/22

Trang 52

CẢM ƠN CÔ VÀ

CÁC BẠN

ĐÃ LẮNG NGHE

Trang 53

8/27/22 53

Định dạng
Số trang	53
Dung lượng	3,04 MB