đề tài phương pháp sắc ký

đề tài phương pháp sắc ký

Tiểu luận nhóm 3

Đề tài:

GVHD: TH.S NGUYỄN XUÂN TÒNG

Giới thiệu về một số Phương pháp sắc ký

Đại cương về phương pháp sắc ký

Các kỹ thuật định lượng của

phương pháp sắc ký hiện đại

Ứng dụng

Nội dung thuyết trình

Đại cương về phương pháp sắc ký

- Phương pháp sắc ký do nhà bác học người Nga Mikhail Tewett ( 1872-1919) phát minh vào năm 1903

-Ông đã dùng cột chứa oxit nhôm tách các pigment của lá cây thành các vùng màu riêng biệt và đặt tên là sắc ký

(chromatogrphy)

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ

Russian Botanist Thí nghiệm sắc ký củaTswatt

• Phương pháp sắc ký ngoài khả năng

tách còn là một trong những phương pháp phân tích định tính và định lượng các cấu tử có độ chính xác

• Là quá trình tách dựa trên sự dịch

chuyển hỗn hợp phân tích qua một lớp chất cố định ( được gọi là pha tĩnh)nhờ vào chất mang thường là khí hoặc lỏng ( được gọi là pha động).

Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký:

• Hằng số cân bằng của cân bằng (1)còn

được gọi là hằng số phân bố được tính như sau:

•

Hệ số phân bố

Trong đó :

• C s: : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.

• Hệ số K tùy thuộc vào bản chất của

pha tĩnh, pha động, và chất hòa tan.

• K càng nhỏ thì pha tĩnh giữ lại ít và ra

càng nhanh ngược lại k càng lớn thì chất phân tích ra càng chậm.

S

• Thời gian lưu : là thời gian cần thiết để

cấu tử đi từ đầu cột đến cuối cột hay chính là thời gian cấu tử bị lưu giữ

trong cột

• Hiệu số giữa thời gian lưu và thời gian

lưu chết gọi là thời gian lưu đã hiệu

Hệ số chọn lọc

-Là đại lượng đặt trương cho khả năng

tách của các cấu tử khác nhau trong

hỗn hợp chất khảo sát

- Hệ số chọn lọc α của cột đối với cấu tử

A và B định nghĩa như sau:

A

B A

B

K

K K

- Hệ số chứa hay còn gọi là dung lượng

là một thông số quan trọng được sử

dụng trong sắc ký ( ký hiệu là K’)

M

M R

M

S M

V K

V C

- K tùy thuộc vào bản chất tan, pha

động và pha tĩnh và pha động K’ tùy thhuộc vào các yếu tố trên vừa phu

thuộc vào các đặt tính của cột

Lý thuyết đĩa Martin và Synge

- Được áp dụng cho quá trình sắc ký

vào năm 1942 Theo thuyết này, cột sắc

ký được xem như gồm nhiều phần nhỏ gọi là đĩa Trong mỗi đĩa, cân bằng vật chất được thiết lập rất nhanh giữa pha động và pha tĩnh

-Số đĩa được biểu hiện ở hệ thức sau:

2 / 1

2

55 ,

5 16

t H

L

Trong đó :

N: số đĩa lý thuyết của cột

L:chiều dài của lớp chất nhồi tronh cột H: chiều cao của đĩa lý thuyết

W, W 1/2 : bề rộng đáy mũi sắc ký , mũi sắc ký 1/2

2 1

1 2

W W

1

α α

- Để tăng R s để tách hai mũi ra khỏi

nhau, ta có thể thay đổi:

+Tăng Δt R =t R2 – t R1 khi đó 2 mũi thang sẽ tách xa hơn.

+Giảm W 1 ,W 2 khi đó 2 mũi thang nhọn

hơn, cách này tiết kiêm được thời gian phân tích ,cho kết quả tố hơn.

Phương trình Van Deemter

-Phương trình VanDeemter ra đời bổ sung

cho một số điểm của quá trình sắc ký theo

lý thuyết đĩa chưa lột tả được các vấn đề ảnh hưởng bên trong cũng như bên ngoài của quá trình sắc ký.

-Phương trình Van Deemter sẽ mô tả ảnh

hưởng của quá trình này như sau:

u C

B

u

B A

H H

H

Trong đó :

H A: chiều cao riêng phần thể hiện chất

lượng của cột nhồi gây ảnh hưởng tốc độ dịch chuyển khác nhau của các phân tử trong cột nhồi

A = 2λdp

- λ: thông số phụ thuộc vào kích thước hạt và mứt độ đồng nhất khi nạp cột ,d p là đường

kính của hạt chất hấp phụ

-H B : chiều cao riêng phần biểu diễn sự phân

tán của cấu tử khảo sát trong pha động

M

D

B = 2 γ

: Hệ số phụ thuộc vào khoảng cách giửa các

hạt, D M là hệ số khuyết tán trong pha động

- H C : chiều cao riêng phầnbiểu diễn sự hấp phụ

và giải hấp phụ của cấu tử bên pha tĩnh và sự phân tán cùa cấu tử trong hai pha

A Sắc ký lỏng

• Sắc ký lỏng là quá trình tách do ái lực khác

nhau của cấu tử lỏng đối với chất hấp phụ

rắn

• Lực hấp phụ bao gồm lực Vande Waals, lực

cảm ứng, lực liên kết hóa học và lực liên kết hydrogen.

• Sắc ký lỏng xác định được rất nhiều loại cấu

tử đặt biệt là các chất có khối lương phân tử lớn.

Giới thiệu một số phương pháp sắc ký

• Sắc ký lỏng được viết tắt là HPLC :

 High Performance Liquid

Chromatography:sắc ký lỏng hiệu nâng cao.

 High Pressure Liquid Chromatography:

sắc ký lỏng áp suất cao.

Figure P-2:HPLC column

Pha tĩnh

- Pha tĩnh trong sắc ký thường ở thể rắn,

có nhiều loại pha tĩnh khác nhau , tùy

theo nhu cầu mà người ta chọn lựa pha tĩnh phân cực hoặc không phân cực.

Pha tĩnh không phân

dụng nền silica gel

có gắn thêm mạch

cacbon C18

Pha tĩnh phân cực : thường sử dụng cực

là silosan (SiO 2 ) hoặc alumina(Al 2 O 3 ) pha tĩnh này rất háo nước, nước có thể là

một chất độc đối với các pha tĩnh loại

này.

Dung môi được chon để chạy sắc ký phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

 Có độ tinh khiết cao

 Hòa tan tốt với cấu tử cần phân tích

 Bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh

 Không phản ứng với chất cần xác

định và chất hấp phụ.

Pha động

• Để tăng khả năng tách có thể rửa giải

bằng dung môi theo thứ tự khả năng giải hấp tăng dần.

• Đối với các chất hấp phụ phân cực dung

môi có hằng số điện môi càng lớn sẻ có khả năng giải hấp càng cao đói với các

chất hấp phụ trên đó và ngược lại.

• Chất hấp phụ không phân cực dung môi

có hằng số điện môi càng cao sẽ giải hấp càng kém.

Hệ thống máy sắc ký lỏng

Hệ thống máy sắc ký lỏng

Mô hình máy sắc ký lỏng

Bộ phận tiêm mẫu

- Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu từ ngoài vào cột bằng kim bơm.

-Bộ phận tiêm mẫu gồm: kim tiêm, loop,

van xoay chiều.

-Loop có tác dụng khi lấy mẫu đảm bảo

lượng mẫu chuẩn và mẫu thật đưa vào cột như nhau

Bộ tiêm mẫu tự động

Cột sắc ký

Đầu dò ( derector)

-Trong sắc ký lỏng thường sử dụng nhiều loại

đầu dò khác nhau UV, DAD, độ dẫn, khúc xạ

- Các tín hiệu thu được từ đầu dò tỷ lệ thuận

với hàm lượng chất cần xác định và được

chuyền tài tới bộ phận ghi đo.

Đầu dò UV

Năm 1952 máy sắc ký khí đầu tiên ra

đời Dưới sự chủ trì của giáo sư

Pha tĩnh

bốc hơi hay phân hủy ở nhiệt dộ khảo sát.

Thông thường pha tĩnh trong sắc ký khí thường là sườn Dimathyl

polysiloxan,để thay đổi độ phân cực

bằng các nhóm phenil, rượu,

Pha tĩnh không phân cực :squalan, mỡ apiezon, dimethylpolysiloxan.

Pha tĩnh phân cực kỵ nước :thay thế bởi các nhóm ester, nitril, amid cetoon… Pha tĩnh phân cực háo nước: thay các nhóm metyl bằng nhóm rượu, amin.

a) Carboran modified polysiloxane

b) Silarglen polymer

• Pha động hay còn gọi là khí mang, khí mang phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

•Trơ đối với cấu tử khảo sát.

•Có tỷ khối nhỏ,độ nhớt thấp để tăng tốc độ khí

mang.

•Có độ tinh khiết cao, thông thường >99,99%.

•Khí mang nào cho cực tiểu càng trải rộng

Mô hình cấu tạo của máy sắc ký khí

Khí mang thường được sử dung trong bình nén, chịu áp cao,bình có van đo áp suất bên trong và bên ngoài bình, điều chỉnh lưu lượng khí

Người ta phân biệt các bình khí dựa vào

Bộ tiêm mẫu

 Mẫu dạng lỏng được bơm vào cột bằng kim tiêm qua một septum Đối với mẫu dạng khí dùng hệ thống headspace để đưa mẫu vào

cột

 Nhiệt độ buồng tiêm thường giữ ở nhiệt độ

cao hơn nhiệt độ hóa hơi của cấu tử cần xác

định

Bộ phận tiêm mẫu

• Cột nhồi: dài 2 -3 m,đường kính 2 – 4

mm,thường làm bằng thủy tinh, kim loại,

teflon, trong cột nhồi đầy với những hạt rắn, hình cầu diện tích riêng của hạt > 1m 2 /gam

• Cột mao quản(cột mở):chiều dài 10 – 100 m,

đường kinh 0.2 - 0.3mm,trên thành trong

của cột được phủ một lớp pha tĩnh rất

mỏng (0.03 – 0.1mm)

Cột sắc ký khí

• Có khả năng gia nhiệt và hạ nhiệt rất

nhanh.

• Nhiệt độ là một thong số quan trọng

trong sắc ký khí.

• Buồng nhiệt chứa cột vì vậy phải có

nhiệt độ hoạt động thấp hơn nhiệt độ giới hạn.

Buồng ổn nhiệt (oven)

• Đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID – flame

Đầu dò ion hóa ngọn lửa

Đầu dò dẫn nhiệt

Đầu dò bắt giữ điện tử

• Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng

trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích.

• Pha tĩnh trong trường hợp này được gọi

là chất trao đổi ion.

• Bản chất của quá trình tách là do ái lực

khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung tâm trao đổi ion của

ionit.

Sắc ký trao đổi ion

Thành phần : cationit (nhựa trao đổi

cation) và anionit ( nhựa trao đổi anion)

Cationit: chứa các nhóm chức hoạt động

là cacc1 anion R-, ion linh động là Mn+.

Anionit : có dạng R+X- với nhóm hoạt

động R+ thường là nhóm amin.

• Cơ chế trao đổi của cationit:

R-SO 3 H (R) + M n+

(dd) (R-SO 3 - ) n M n+

( R) + nH +

• Cơ chế trao đổi ion của anionit:nhóm amin

của anionit tác dụng tương tự như các amin trong dung dịch nước

R-NH 2 OH - + H 2 O R-NH 3 OH

-• Ion OH - trên anionit được trao đổi với các

ion trong dung dich.

R-NH 3 + OH + HCL R-NH 3 + CL - + H 2 O

Cơ chế trao đổi ion

• Quá trình sắc ký xảy ra khi cho pha động di

chuyển qua pha tĩnh.

Hệ sắc ký bản mỏng:

 Bản mỏng: chế tạo bằng thủy tinh,

polimer, nhôm

 Pha tĩnh: có thể sử dụng: silicagel, nhôm

oxit, xenlulose, tinh bột…

 Pha động: không dùng một dung môi mà

thường kết hợp nhiều dung môi để tách các cấu tử ra khỏi nhau.

F Sắc ký bản mỏng

• Dùng để tách điện tích các cấu tử trong

dung dịch mẫu.

• Để định lượng người ta thường đo điện

tích các cấu tử hoạc cân chúng.

• Ngoài ra còn định lượng bằng cách kết

hợp chúng với phương pháp so màu

hoặc phương pháp hồng ngoại.

Phân tích định tính và định lượng bằng sắc ký bản mỏng

MÔ HÌNH SẮC KÝ GiẤY

Sự tách biệt của mực đen bởi sắc ký lớp mỏng

Máy phân tích sắc ký lớp mỏng tự động

Các kỹ thuật định lượng của phương pháp sắc ký hiện đại

A

A C

C A

C A

C

c

x c

x c

c x

Kỹ thuật nội chuẩn.

Phương pháp nội chuẩn đơn giản không tốn nhiều công sức và được áp dụng rất phổ biến , đặc biệt

trong sắc ký khí.

Chất được chọn làm nội chuẩn thỏa các yêu cầu sau:

Thời gian lưu trữ của chất nội chuẩn gần với thời

gian lưu chất của chất cần xác định

Độ nhạy của nội chuẩn phỉa xấp xỉ với độ nhạy của

chất cần xác định

Chất nội chuẩn cần được tách khỏi tất cả các chất

có sẵn trong mẫu.

Kỹ thuật thêm chuẩn

• Thêm vào mẫu một lượng biết trước chất

cần định lượng Chạy sắc ký mẫu nguyên

và mẫu thêm, đo độ tăng diện tích của

chất cần định lượng từ đó xác định được hàm lượng chất đó có trong mẫu ban

đầu.

• Ưu điểm: loại bỏ được ảnh hưởng của

chất nền trong mẫu.

• Nhược điểm: nồng độ được tính bằng

cách ngoại suy trên vùng tuyến tính của

• Trong kỹ thuật

• Chế thuốc thử hóa học.

• Điều chế hóa chất.

• Tách các ion có điện cực trái dấu.

• Cô đặc dung dịch loãng.

• Sử dung sắc ký trao đổi ion để phân tích

định tính , định lượng.

Ứng dụng của sắc ký

Kiểm định chất lượng thuốc BVTV bằng máy sắc ký lỏng phân

giải cao

Kiểm định chất lượng thuốc BVTV trên máy sắc ký khí

Chuẩn bị mẫu kiểm định chất lượng thuốc BVTV

Cảm ơn Thầy và các bạn đã chú ý lắng nghe và góp ý.