Do vậy, việc phân tích xác định hàm lượng của các độc tố trong đó có nitrate có trong rau quả là hết sức cần thiết nhằm đánh giá chất lượng rau quả trên thị trường đồng thời có thể giúp
Trang 1KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
-o0o -
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG
NITRATE CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành chương trình nghiên cứu và viết bài đồ án tốt nghiệp này, chúng tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô trường Đại học Kỹ thuật_ Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và các cô chú trong viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh
Trước hết, chúng tôi xin chân thành cảm ơn đến quí thầy cô trường Đại học Kỹ thuật công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo cho chúng tôi suốt thời gian học tập tại trường
Chúng tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến các Cô chú trong Lab hóa lý viện Pasteur, đặc biệt là thầy Nguyễn Thanh Tùng
đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết để chỉ dạy, hướng dẫn nghiên cứu và giúp chúng tôi vượt qua mọi khó khăn trong lúc thực hiện đề tài
Mặc dù chúng tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện bài đồ án này bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn
TP Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2010
Học viên
Phan Ngọc Lâm _ Bùi Quang Đạt
Trang 3Bảo vệ thực phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm giữ vị trí quan trọng trong bảo vệ sức khỏe cộng đồng Ngoài ra còn liên quan đến sự phát triển về kinh tế văn hóa và xã hội của đất nước, nhằm nâng cao đời sống, hạnh phúc của nhân dân và dảm bảo lợi ích tính mệnh của người tiêu dùng Và ngày nay càng
có nhiều trường hợp ăn rau củ quả bị ngộ độc nitrate, do lượng nitrate dư quá nhiều Để xác định chính xác hàm lượng nitrate trong rau củ quả có nằm trong
sự cho phép của WHO hay không thì cần phải có phương pháp tốt
Để xác định hàm lượng nitrate trong rau quả trước hết phải chiết tách nitrate ra khỏi rau và sau đó xác định nó bằng một trong các phương pháp như trắc quang, sắc ký, cực phổ, cực chọn lọc ion Ở đây chúng tôi đưa ra phương pháp nghiên cứu chiết tách nitrate bằng phương pháp nghiền và xác định hàm lượng nitrate trong rau củ bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Nội dung đồ án của chúng tôi bao gồm:
Tổng quan về nitrate, lí thuyết HPLC, hệ thống HPLC, cách chọn điều kiện sắc ký
Đưa ra quy trình thử nghiệm và thẩm định lại quy trình thử nghiệm nitrate
Khảo sát hàm lượng nitrate trên một số loại rau củ quả
Đưa ra kết luận và kiến nghị
Trang 4Đề mục Trang
Trang bìa i
Nhiệm vụ đồ án
Lời cảm ơn ii
Tóm tắt đồ án iii
Mục lục iv
Danh sách hình vẽ v
Danh sách bảng biểu vi
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1
1.1 Lý do chọn lựa đề tài 1
1.2 Mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 1
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 3
2.1 Tổng quan về nitrate 3
2.1.1 Giới thiệu về nitrate 3
2.1.2 Nguồn gốc của nitrat Vì sao nitrate có nhiều trong đất? 3
2.1.3 Ảnh hưởng của nitrate đối với sức khỏe con người 5
2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate trong một số loại rau củ 8
2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate 10
2.2 Tổng quan về HPLC 18
2.2.1 Giới thiệu HPLC 18
2.2.2 Khái niệm HPLC 18
2.2.3 Phân loại sắc ký 18
2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 20
2.2.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 21
2.3 Hệ thống HPLC 27
Trang 52.3.3 Hệ thống bơm 31
2.3.4 Bộ phận tiêm mẫu 34
2.3.5 Cột sắc ký 35
2.3.6 Detector 40
2.3.7 Bộ phận xử lý và ghi tín hiệu 45
2.4 Chọn điều kiện sắc ký 46
2.4.1 Lựa chọn pha tĩnh 46
2.4.2 Lựa chọn pha động 47
2.4.3 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 49
2.4.4 Chuẩn bị dung môi pha động 50
2.4.5 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 50
2.4.6 Cách sử dụng máy HPLC 50
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52
3.1 Quy trình thử nghiệm 52
3.1.1 Thuốc thử 52
3.1.2 Thiết bị - dụng cụ 53
3.1.3 Cách tiến hành 56
3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm 59
3.2.1 Độ đúng 60
3.2.2 Độ chính xác 61
3.2.3 Tính đặc hiệu 61
3.2.4 Giới hạn phát hiện 62
3.2.5 Giới hạn định lượng 62
3.2.6 Tính tuyến tính 63
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64
4.1 Kết quả thẩm định 64
Trang 64.1.3 Tính tuyến tính 67
4.1.4 Độ đúng 68
4.1.5 Giới hạn phát hiện 70
4.1.6 Tính đặc hiệu 72
4.2 Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên 1 số loại rau củ quả bằng 2 phương pháp 74
4.3 Một số hình ảnh về sắc kí đồ của mẫu phân tích 75
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79
5.1 Kết luận 79
5.2 Kiến nghị 79
Tài liệu tham khảo I
Trang 7Đề mục Trang
Hình 2.1 : Công thức cấu tạo của nitrate 3
Hình 2.2 : Công thức của Nitrosamine 6
Hình 2.3: Xác định nitrate bằng FIA 13
Hình 2.4: Hình biểu diễn sự tương tác các chất trong quá trình sắc ký 20
Hình 2.5: Hình minh họa cho quá trình tách các chất trong cột sắc ký 21
Hình 2.6: Sắc ký đồ 21
Hình 2.7: Sắc ký đồ biễu diễn thời gian lưu của các chất 22
Hình 2.8: Hình biểu diễn độ chọn lọc α 24
Hình 2.9: Hình biễu diễn hệ số không đối xứng T 26
Hình 2.10: Mô hình máy sắc ký HPLC 27
Hình 2.11: Bộ phận lọc dung môi 28
Hình 2.12: Hệ thống khử dung môi ngay trên dòng 31
Hình 2.13: Bộ phận tiêm mẫu tự động 35
Hình 2.14: Cột phân tích 36
Hình 2.15: Cột bảo vệ 36
Hình 2.16: Detector UV 43
Hình 3.1: Bộ siêu lọc 54
Hình 3.2: Cân điện tử 54
Hình 3.3: Bình lọc dung môi 54
Hình 3.4: Bộ chiết SPE với bơm hút chân không 55
Hình 3.5: Máy rung siêu âm 55
Hình 3.6: Máy sắc ký Agilent 1100 55
Hình 3.7: Quy trình xử lý mẫu 56
Hình 4.1: Đường chuẩn nitrate 64
Hình 4.2: Đường chuẩn nitrate 67
Trang 8Hình 4.5: Đường nền của chuẩn Nitrate ở nồng độ 0.01ppm 70
Hình 4.6: Chồng phổ 2 chất chuẩn nitrate và blank 71
Hình 4.7: Phổ của nitrate (bên phải) 72
Hình 4.8: Phổ của nitrate (bên trái) 72
Hình 4.9: Phổ của nitrite 73
Hình 4.10: Chồng phổ nitrate của mẫu củ dền, khoai tây với chuẩn nitrate 75
Hình 4.11: Chồng phổ nitrate của mẫu hành lá C18 và Carrez 75
Hình 4.12: Sắc ký đồ chuẩn nitrate 5ppm 76
Hình 4.13: Sắc ký đồ mẫu củ dền 76
Hình 4.14: Sắc ký đồ mẫu cải bẹ xanh 77
Hình 4.15: Sắc ký đồ mẫu cà rốt 77
Hình 4.16: Sắc ký đồ mẫu khoai tây 78
Hình 4.13: Sắc ký đồ mẫu hành lá 78
Trang 9Đề mục Trang
Bảng 2.1: Hàm lượng nitrate cho phép trong một số loại rau quả theo tiêu
chuẩn của WHO (đơn vị: mg/kg sản phẩm) 9
Bảng 2.2: Tính ứng dụng của các ion đếm khác nhau 16
Bảng 2.3: Tính chất đặc trưng của một số loại Detector 44
Bảng 2.4: Độ phân cực của 1 số dung môi 49
Bảng 3.1: Yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích 60
Bảng 4.1: Kết quả chuẩn nitrate 64
Bảng 4.2: Kết quả mẫu xà lách 65
Bảng 4.3: Kết quả mẫu xà lách tinh sạch bằng Carrez 66
Bảng 4.4: Kết quả mẫu xà lách tinh sạch bằng cột C18 66
Bảng 4.5: Kết quả chuẩn nitrate 67
Bảng 4.6: Kết quả chuẩn nitrate 68
Bảng 4.7: Kết quả mẫu mồng tơi tinh sạch bằng cột C18 69
Bảng 4.8: Kết quả mẫu mồng tơi tinh sạch bằng Carrez 69
Bảng 4.9: Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên một số mẫu rau quả (C18) 74
Bảng 4.10: Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên một số mẫu rau quả (Carrez) 74
Trang 10CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Lý do chọn lựa đề tài
Hiện nay, an toàn vệ sinh lương thực, thực phẩm đang là vấn đề cấp bách được rất nhiều người quan tâm Số người phải cấp cứu vào bệnh viện do ăn phải thức ăn bị nhiễm độc ngày càng tăng trong những năm gần đây Do chạy theo năng suất, một bộ phận nông dân đã sử dụng quá liều lượng các loại phân bón và thuốc bảo vệ thực vật làm nhiễm độc cho các loại rau quả đẫn đến gây độc thậm chí nguy hiểm đến tính mạng con người Rau quả là sản phẩm nông nghiệp cực kỳ quan trọng đối với việc cung cấp vitamin, khoáng và các chất bổ dưỡng khác liên quan đến sức khoẻ con người Nhiều loại rau quả được con người sử dụng ở dạng tươi sống vì thế các tác nhân hoá học sử dụng cho rau quả dễ bị hấp thụ và chuyển trực tiếp vào cơ thể con người
Nitrate là một ion độc có trong rau quả, hàm lượng của nó liên quan chặt chẽ đến liều lượng phân đạm sử dụng Sự có mặt của nitrate với hàm lượng lớn gây hai tác động xấu đến sức khoẻ :
• Sự tạo thành methemoglobinemia làm mất khả năng vận chuyển oxi của hemoglobin Trẻ em mắc chứng bệnh này thường xanh xao (blue bay) và dễ
bị đe doạ đến cuộc sống đặc biệt là trẻ em dưới sáu tháng tuổi
• Sự tạo thành các hợp chất gây ung thư (Nitrosamine)
Do vậy, việc phân tích xác định hàm lượng của các độc tố (trong đó có nitrate) có trong rau quả là hết sức cần thiết nhằm đánh giá chất lượng rau quả trên thị trường đồng thời có thể giúp các cơ quan chức năng trong việc kiểm tra giám sát chất lượng lương thực, thực phẩm nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng Đó là lí do mà chúng em thực hiện đề tài nghiên cứu đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate có trong rau củ quả
1.2 Mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
Mục tiêu nghiên cứu:
¾ Tìm hiểu tính chất vật lí, hoá lí, tác hại của nitrate có trong rau củ quả
Trang 11¾ Đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
¾ Khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại rau củ quả có mặt trên thị trường
Đối tượng nghiên cứu: một số loại rau củ quả phổ biến trong bữa ăn hàng ngày Phạm vi nghiên cứu: rau củ quả được mua từ một số chợ trên địa bàn thành phố Hồ
Chí Minh
Trang 12CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
2.1 Tổng quan về nitrate
2.1.1 Giới thiệu về nitrate
Nitrate là muối của acid nitrite Trong
muối nitrate, ion NO3- có cấu tạo hình tam giác
đều với góc ONO bằng 1200 và độ dài liên kết
N-O bằng 1,218 A0
Ion NO3- không có màu nên các muối
nitrate của những cation không màu đều không
có màu Hầu hết các muối nitrate đều dễ tan
trong nước Một vài muối hút ẩm trong không
khí như NaNO3 và NH4NO3 Muối nitrate của
những kim loại hoá trị hai và hoá trị ba thường
ở dạng hydrat Hình 2.1: Công thức cấu tạo của nitrate
Muối nitrate khan của kim loại kiềm khá bền với nhiệt (chúng có thể thăng hoa trong chân không ở 380- 5000C) Còn các nitrate của kim loại khác dễ phân huỷ khi đun nóng
Độ bền nhiệt của muối nitrate phụ thuộc vào bản chất cation kim loại
2.1.2 Nguồn gốc của nitrat Vì sao nitrate có nhiều trong đất?
Nitrate (NO3-) được tạo thành tự nhiên từ nitơ trong lòng đất Nitơ tồn tại trong thiên nhiên chủ yếu dưới dạng phân tử hai nguyên tử N2 và là một nguyên tố khá phổ biến trong thiên nhiên, chiếm 78,03% thể tích của không khí Một cách gần đúng có thể coi thể tích của không khí gồm có 4 phần N2 và 1 phần O2
Trong phân tử N2, nitơ liên kết với nhau bằng ba liên kết hoá trị Để phá vỡ liên kết này cần một năng lượng rất lớn khoảng 942 kJ/mol Điều này giải thích tính trơ của phân
tử N2 và giải thích tại sao đa số hợp chất đơn giản của N2, mặc dù trong đó có liên kết bền, đều là hợp chất thu nhiệt Cũng chính vì thế mà phần lớn các sinh vật sống không thể sử dụng trực tiếp nó được
Trang 13Nitơ có trong mọi sinh vật dưới dạng hợp chất hữu cơ phức tạp như prôtêin, acid nucleic, một số sinh tố và kích thích tố, chất màu của máu, clorophin Nitơ là một trong những nguyên tố dinh dưỡng chính đối với thực vật Bởi vậy trong nông nghiệp, những lượng lớn hợp chất của nitơ được thường xuyên cung cấp cho đất dưới dạng phân đạm để nuôi cây trồng Trong nước mưa có một lượng nhỏ acid nitrous (HNO2) và acid nitrite (HNO3) được tạo thành do hiện tượng phóng điện trong khí quyển
Nitơ tồn tại ở nhiều trạng thái oxi hoá khác nhau như NO3- (+5), NO2- (+3) và NH4+(-3).Trong các dạng này thì NO3- và NO2- được quan tâm hơn cả vì chúng là những ion có khả năng gây độc cho con người Ngoài các trạng thái trên nitơ còn tồn tại ở trạng thái khí như N2, NO, N2O Trong các dạng tồn tại của nitơ thì NO3- là dạng bền nhất và được tìm thấy nhiều trong nước ngầm tại các khu vực đất trồng trọt
Quá trình hình thành nitrate là một giai đoạn không thể thiếu trong vòng tuần hoàn của nitơ trong tự nhiên Quá trình này xảy ra mạnh trong điều kiện ẩm độ của đất đạt 60-70%, nhiệt độ từ 25-30oC và pH = 6,2-9,2
Chu trình của nitơ chủ yếu là các phản ứng liên quan đến sinh học Tất cả các phản ứng trong chuỗi:
N2 -> NH3 -> NO2- -> NO3- -> NH4+ -> Protein
và các phản ứng ngược lại thành N2 đều có thể do vi sinh vật thực hiện
• Các hợp chất của nitơ xuất hiện trong nước như NH4+, NO2-, NO3- là sản phẩm của quá trình phân huỷ vi sinh yếm khí (NH4+), hiếu khí (NO2-, NO3-) các chất hữu
cơ chứa nitơ từ xác các sinh vật, chất thải hữu cơ ở giai đoạn đầu các chất đạm dưới tác dụng cuả vi khuẩn yếm khí sẽ phân huỷ thành NH3:
(NH2)2CO + H2O -> 2 NH3 + CO2
Ion amoni (NH4+) trong nước sau một thời gian tương đối dài sẽ chuyển dần thành NO3-
• Các nguồn thải từ một số ngành công nghiệp hoá chất, công nghiệp thực phẩm chứa acid nitrite ( hoà tan trong nước mưa tạo HNO3) cũng đưa vào nước một lượng khá lớn NO3-
Thành phần nitơ trong đất chủ yếu ở dạng hữu cơ, do kết quả của quá trình phân huỷ thực vật và động vật chết, phân, nước tiểu nó được chuyển hoá thành NH3, NH4+ sau đó
bị oxi hoá bởi vi khuẩn tạo thành NO2- rồi NO3- và thực vật sử dụng NO3- làm chất dinh
Trang 14dưỡng Tuy nhiên, nồng độ tự nhiên của nitrate trong đất không cao lắm, chưa đủ để đảm bảo cho cây trồng có năng suất cao Vì vậy, người nông dân phải bổ sung vào đất các loại phân đạm như urê (NH2)2CO , NH4NO3, (NH4)2SO4 đều đặn để cấp thêm nitơ cho đất, nhất là sau khi thu hoạch đất bị bạc màu Khi đó các vi khuẩn sẽ chuyển hoá NH4+ thành NO3- để cho cây hấp thụ
Ngày nay do sử dụng phân đạm trong sản suất nông nghiệp quá nhiều và chưa đúng quy định là nguyên nhân chủ yếu gây ô nhiễm NO3- trong nước Tuy nhiên, nitrate và amoni một phần chủ yếu được cây cối hấp thụ, một phần giải phóng ra ngoài khí quyển dưới dạng N2, NH3 và phần còn lại tích tụ trong đất và tan trong nước ngầm Từ đó cho thấy nếu luợng đạm đưa vào đất càng nhiều thì lượng NO3- dư thừa càng tăng
Thực phẩm và đồ uống có chứa một hàm lượng nitrate thấp thì không có hại cho sức khỏe Cây cối hấp thụ nitrate trong đất để lấy dưỡng chất và có thể sẽ tạo một dư lượng nhỏ trong lá và quả Do tính cơ động cao, nitrate dễ dàng thấm vào nguồn nước ngầm Nếu con người và súc vật uống phải nước có nhiều nitrate sẽ dễ bị mắc các chứng bệnh về máu, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ
Nitrate hình thành khi vi sinh vật chuyển hóa phân bón, phân hủy xác động thực vật Nếu cây cối không kịp hấp thụ hết lượng nitrate này thì nước mưa và nước tưới sẽ làm cho
nó ngấm vào lòng đất, làm ô nhiễm nguồn nước ngầm Rất tiếc là con người lại chính là thủ phạm tạo ra nguồn ô nhiễm nitrate lớn nhất thông qua các hoạt động nông nghiệp:
• Sử dụng phân bón hóa học hoặc hữu cơ
• Chăn nuôi
• Thải nước và rác không qua xử lý
• Hệ thống bể phốt
2.1.3 Ảnh hưởng của nitrate đối với sức khỏe con người
Nitrate là chất dinh dưỡng cho cây cỏ (phân bón) để chúng có thể sanh trưởng Khi thiếu ánh nắng, vào buổi sáng tinh mơ, mùa xuân và mùa thu hoặc trong mùa đông nếu lượng phân nitrate quá cao cây cỏ sẽ dự trữ lại trong các tế bào Tự bản thân nitrate không
có độc tố, nhưng trong cơ thể con người nitrate sẽ tạo ra nitrite ở những điều kiện nhất định
Trang 15Một người trưởng thành khỏe mạnh có thể chịu được một lượng nitrate tương đối lớn
mà không bị ảnh hưởng đến sức khỏe Trên thực tế, phần lớn lượng nitrate xâm nhập cơ thể qua thực phẩm, cụ thể là các loại rau củ Tuy nhiên, lượng nitrate này sẽ bị thải theo nước tiểu Thế nhưng, nếu liên tục phải hấp thụ nitrate có thể sẽ dẫn đến mắc phải một số bệnh do sự hình thành của các Nitrosamines (chất gây ung thư) và làm rối loạn sức khỏe như sự thay đổi hàm lượng vitamin, rối loạn việc tạo ra thyroxin của tuyến giáp, sự thay đổi trong máu, ảnh hưởng xấu đến việc tái sản xuất…Hầu hết tất cả thực phẩm đều có chứa nitrate bởi vì nitrate có mặt trong tự nhiên trong đất, nước và không khí Sự ảnh hưởng xấu của nitrate đến sức khỏe con người bắt đầu từ những sự chuyển đổi của chúng thành nitrite bởi một enzyme Enzyme này có trong tuyến nước bọt, trong dạ dày hoặc bất
cứ ở đâu trong cơ thể người có pH thấp
Nitrosamine là một hộp chất có cấu trúc hóa-học là R1N (-R2)-N=O, trong đó có carcinogenic, đó là tác nhân kích thích sự phát triển của bệnh ung thư hay bệnh ác tính nào
đó
Hình 2.2: Công thức của Nitrosamine
Tại sao có Nitrosamine?
Trong thức ăn, Nitrosamine do hai yếu tố tạo nên nó là nitrites và amines Ta thấy sự hợp thành của nó thường xảy ra trong các proteins Với điều kiện thích hợp, chẳng hạn như trong các điều kiện quá ư là acid, như trong bao tử chúng ta, hay tại nơi nào có chiên xào với nhiệt độ cao, thì Nitrosamine dễ hợp thành Như ta biết nitrite hợp thành nitrous acid (HNO2), và khi ta tách chúng ra làm đôi ta có hai phần: nơi cực dương ta có nitrosonium cation N = O+ còn nơi cực âm ta có hydroxide anion OH- Rồi nơi phía cực dương chính cation nitrosonium tác dụng với amine cho ta một chất gọi là Nitrosamine
Ngoài ra, Nitrosamine còn có do các hoá chất dùng hằng ngày trong kỹ nghệ hấp khô (dry cleaning industry) cũng gây độc chất cho con người Thêm nữa, hai nhà khoa học người Anh kể trên là Magee và Barnes còn nghiên cứu thêm những tính chất khác có được
Trang 16của Nitrosamine và của cả hợp chất N-Nitroso (N-Nitroso compounds) Trên 300 hợp chất Nitroso được thí nghiệm thì thấy rằng khỏang 90% đều có thấy chất carcinogenic tạo ra các bướu ác tính trên nhiều loại thú được thí nghiệm Tất cả các Nitrosamines là đều là những tác nhân gây đột biến (mutagens) bên ngoài tác dụng vào các tế bào trong cơ-thể và một số tạo thành carcinogens, cho từng phần lớn các cơ quan đặc biệt trong cơ thể Ví như: chất dimethylNitrosamine thì tạo ung thư gan (liver cancer) cho các động vật được thí nghiệm, trong khi Nitrosamine từ khói thuốc lá tạo ung thư phổi (lung cancer)
Nitrosamine có mặt trong :
Hiện diện trong các thức ăn Ngoài ra Nitrosamine còn thấy hiện diện trong nhiều thực phẩm chế biến như: beer, cá, cá chế biến, sản phẩm của thịt và cheese thường dùng muối nitrite để bảo quản và tạo màu đỏ thịt Vì sự nguy hiểm của Nitrosamine, nên chính phủ Mỹ cho một hàm lượng giới hạn được dùng nitrite trong thịt để giảm thiểu sự gia tăng ung thư trong cộng đồng Mỹ Quốc Nitrosamines trong thực phẩm ở trong giới hạn: <120 ppm (part per million) cho các nước Âu châu và Bắc Mỹ
Nitrosamine cũng được tìm thấy trong khói thuốc lá và các sản phẩm do cao su chế biến mà ra (latex products) Nhiều cuộc thử nghiệm về Nitrosamine trên các bong bóng (ballons) và các bao cao su an toàn sinh lý gọi là condoms, đều thấy rằng chúng có một lượng nhỏ Nitrosamine phóng thích ra vào nơi tiếp xúc
Khi thử trên các động vật, thì Nitrosamine hiện rõ nét báo hiệu là triệu chứng ung thư Nên người ta lo sợ rằng con người ăn phải nó sẽ bị ung thư như các loài vật Tuy nhiên, khó thấy rõ sự cấu trúc ung thư do Nitrosamine gây ra trên các ngũ tạng trong cơ thể Tuy nhiên, một sự khẳng định là những dữ kiện có được do các cuộc nghiên cứu các bệnh dịch đã xác quyết là Nitrosamine gây ra ung thư bao tử (stomach cancer) Tại sao là tại bao tử vì tại đó có hàm lượng acid rất cao
Còn một số lớn thuốc sát trùng, chính nó là nguồn chứa Nitrosamine gây ra ung thư cho những ai vô tình hay bị bắt hít nó, hay ăn phải nó, nhất là ở Việt Nam hiện nay việc dùng thuốc sát trùng xịt trên rau cải rất bừa bãi khắp nơi cùng nước tưới bị ô nhiễm
NO3- khi vào cơ thể người tham gia phản ứng khử ở dạ dày và đường ruột do tác dụng của các men tiêu hoá sinh ra NO2- Sau khi nitrite được tạo thành, sẽ tác dụng với hemoglobine (phương tiện vận chuyển oxy trong máu) để tạo thành methemoglobine dẫn
Trang 17đến tình trạng thiếu oxy trong máu (ngộ độc nitrate) hay còn gọi là bệnh da xanh, thường gặp ở trẻ nhỏ (blue baby)
4HbFe2+(O2) + 4 NO2- + 2 H2O > 2 HbFe3+ + OH- + 4 NO3- + O2
Methemoglobine là gì ?
Đó là sản phẩm của Hemoglobine bị oxy hóa, trong đó Fe++ hóa trị 2 trong hemoglobine được chuyển thành Fe3+ hóa trị 3 Hemoglobine có khả năng chuyên chở oxy đến mô cơ thể nên làm da niêm có màu hồng trong khi methemoglobine không có khả năng vận chuyển oxy nên làm da niêm tím tái Bình thường trong hồng cầu vẫn hình thành methemoglobine (<1%) nhưng không tồn tại lâu, vì cơ thể có hệ thống men khử methemoglobine thành hemoglobine bình thường Tuy nhiên, có một số tác nhân oxy hóa mạnh như hóa chất (Chlorates, Aniline - phẩm nhuộm, Trinitrotoluene - thuốc nổ)., thuốc (Nitroglycerine, Sulfonamide, Primaquine, Chloroquine, Lidocain, Prilocain - EMLA, Benzocain - gây tê tại chỗ, Nitrate bạc - xức bỏng), thức ăn (nước giếng, củ dền, carrot, nước cải bẹ xanh, bắp cải, củ cải đường – những thức ăn này có hàm lượng nitrate cao, khi
ăn nhiều và dày ngày sẽ gây methemoglobin ở trẻ nhỏ) biến đổi hemoglobine thành methemoglobine quá khả năng bù trừ của hệ thống men khử đưa đến tăng methemoglobine máu, dẫn đến bệnh nhân bị tím tái, có thể tử vong nếu không điều trị kịp thời
2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate trong một số loại rau củ
Trong hoạt động thương mại quốc tế, các nước nhập khẩu rau tươi đều phải kiểm tra lượng nitrate trước khi cho nhập Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và cộng đồng kinh tế châu
Âu (EC) giới hạn hàm lượng nitrate trong nước uống là 50 mg/l, hàm lượng rau không quá
300 mg/kg rau tươi
Trang 18Bảng 2.1 : Hàm lượng nitrate cho phép trong một số loại rau quả theo tiêu
chuẩn của WHO (đơn vị: mg/kg sản phẩm)
Bản thân lượng nitrate dư thừa trong cây trồng là một hiện tượng bình thường cho sự dinh dưỡng của cây Tuy nhiên, để đảm bảo năng suất cao, người sản xuất thường dùng một lượng thừa phân hóa học, nhất là phâm đạm Sự tích tụ nitrate trong nông phẩm phụ thuộc vào số lượng và phương pháp bón phân đạm, bên cạnh đó còn phụ thuộc vào đặc điểm sinh học của cây trồng, kỹ thuật canh tác và nhiều yếu tố môi trường khác Sản xuất nông nghiệp hiện nay đang tiến dần đến việc sử dụng các giống lai với đặc điểm di truyền cho phép không tích lũy nitrate với lượng cao
Việc tích lũy nitrate trong cây trồng do nhiều yếu tố tác động Người ta đã nhận thấy
có gần 20 yếu tố ảnh hưởng đến việc tích lũy nitrate trong cây trồng, từ sự can thiệp của người sản xuất bằng chế độ dinh dưỡng cho đến tác động của các yếu tố môi trường Khi trời râm và độ ẩm cao, lượng nitrate tích lũy trong cây cao gấp 3 lần bình thường Lượng nitrate cũng tăng cao khi trời nắng và nhiệt độ cao Nhưng trong điều kiện trời nắng và nhiệt độ thấp thì lượng tích lũy nitrate trong cây giảm đi rất nhiều Khả năng tích lũy nitrate trong nông phẩm còn phụ thuộc vào từng chủng loại cây trồng và từng bộ phậm khác nhau của nông phẩm
• Tích lũy NO3 rất cao (5.000 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có các loại cây trồng như xà lách, bó xôi, củ cải, cải bắp, hành ăn lá, xà lách xoong
Loại cây Hàm lượng NO 3 - (mg/kg) Loại cây Hàm lượng NO 3 - (mg/kg)
Trang 19• Tích lũy NO3 trung bình (600-3.000 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có sú lơ, cà rốt, bí
• Tích lũy NO3 thấp (80-100 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có đậu các loại, khoai tây, cà chua, hành tây, dưa, các loại trái cây
• Ở cà rốt, NO3 tập trung ở phần chóp củ
• Ở bắp cải, NO3 tập trung ở phần lõi
• Ở củ cải, NO3 tập trung ở phần rễ con
Các cây trồng trong điều kiện bình thường có dư lượng NO3 thấp hơn cây trồng trong nhà kính từ 2-12 lần, nhất là các cây ăn lá Mật độ cây trồng cũng là yếu tố làm tăng hoặc giảm lượng nitrate trong cây Khi trồng dày, lượng nitrate sẽ tăng lên do điều kiện chiếu sáng yếu Tưới nước đầy đủ cho cây cũng làm giảm hàm lượng này, từ 2-8 lần Sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật không đúng phương pháp cũng là yếu tố góp phần làm tăng lượng nitrate dư thừa trong nông phẩm Khi chế biến rau quả, nhất là ăn tươi, thông thường nên loại bỏ những phần có khả năng tích lũy nhiều nitrate Quá trình nấu chín thức
ăn cũng làm giảm lượng nitrate từ 20-40%
Ở nhiều nước phát triển như Hoa Kỳ, quy định hàm lượng nitrate phụ thuộc vào từng loại rau Ví dụ: măng tây không được vượt quá 50 mg/kg, cải củ được phép tới 3600 mg/kg Ở Nga lại quy định hàm lượng nitrate trong cải bắp phải dưới 500 mg/kg, cà rốt dưới 250 mg/kg, dưa chuột dưới 150 mg/kg… Trong khi đó, lượng tồn dư nitrate ở Việt Nam là quá cao so với các quy định trên Đây là một vấn đề cần được quan tâm và giải quyết một cách hợp lý để rau sạch Việt Nam có chỗ đứng trên thị trường quốc tế
Do nitrate và nitrite có độc tính cao như vậy, ảnh hưởng rất nhiều đến sức khỏe con người nên cần có phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ để đưa ra khuyến cáo cho mọi người Dưới đây là một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate
2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate
2.1.5.1 Phương pháp thể tích
Người ta có thể xác định nitrate theo phương pháp này dựa trên phản ứng khử NO3
-về các trạng thái oxi hoá thấp hơn bằng các chất khử thích hợp Sau đó tiến hành phép chuẩn độ ( có thể sử dụng chuẩn độ trực tiếp hay chuẩn độ ngược)
Trang 20Với phép chuẩn độ ngược thì một lượng chính xác dung dịch chuẩn Fe2+ được cho
dư so với lượng cần thiết vào dung dịch mẫu Sau đó lượng dư Fe2+ được chuẩn độ bằng dung dịch Cr2O72+ với chất chỉ thị là ferroin Các phản ứng xảy ra như sau:
NO3- + 3Fe2+ + 4H+ -> NO + 3Fe3+ + 2H2O
2Fe2+ + Cr2O72+ + 14H+ -> 6Fe3+ + 2Cr3+ + 7H2O
Phản ứng giữa Fe2+ và NO3- xảy ra nhanh hơn khi đung nóng dung dịch và có mặt của lượng dư acid H2SO4 65% Do NO sinh ra phản ứng với oxi không khí tạo thành các chất có khả năng bị khử hay bị oxi hoá bởi Fe2+ nên trong quá trình phản ứng và chuẩn độ phải được tiến hành trong môi trường khí CO2 Điều này được thực hiện bằng cách thêm một lượng nhỏ NaHCO3 trước khi đun nóng và chuẩn độ
2.1.5.2 Phương pháp so màu
Các phương pháp so màu cũng được dùng để xác định NO3- dựa trên ba loại phản ứng sau:
Nitrate hoá các hợp chất phenolic
Oxi hoá các hợp chất hữu cơ có nhóm mang màu đặc trưng
Khử NO3- thành NO2- hoặc NH3 rồi xác định chúng theo phương pháp thích hợp
Trong đó phương pháp nitrate hoá chủ yếu được sử dụng để xác định NO3- với thuốc thử thường dùng là acid Phenol đisunfonic
Khi sử dụng thuốc thử acid Phenol 2,4 đisunfonic, ion NO3- phản ứng với acid này tạo thành acid Nitro phenol đisunfonic Trong môi trường kiềm, acid Nitro phenol
Trang 21đisunfonic tạo thành một muối có màu vàng cho độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 410nm
Phương pháp này đơn giản và cho độ nhạy khá cao (0,05ppm) Nhưng khi có mặt các chất hữu cơ, clorua, NO2-, các ion có màu sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích Do đú cần phải loại bỏ chúng trước khi phân tích Sử dụng acid Sunfamin, urê, hay thiurê để tách loại NO2- Cl- được loại bỏ bằng cách phản ứng kết tủa với Ag2SO4 Loại trừ ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ bằng cách oxi hoá bằng H2O2 hay sử dụng than hoạt tính
Hiện nay, ở châu Âu người ta chú ý nhiều đến thuốc thử Natri salixylat Với sự có mặt của Natri salixylat, nitrate tạo thành hợp chất có màu vàng dạng p - Nitrosalixylat cho
độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 410nm
Ưu điểm của phương pháp này là sử dụng đơn giản và có độ nhạy cao
Tuy nhiên, nếu trong mẫu có mặt các hợp chất hữu cơ thì làm thay đổi màu của sản phẩm màu Do đó, cần phải loại bỏ chất hữu cơ trước khi phân tích Hơn nữa, khi có mặt Clorua sẽ tạo thành Nitrosylclorua ảnh hưởng đến kết quả phân tích Vì vậy, trước khi phân tích cũng phải loại trừ ảnh hưởng của clorua
2.1.5.3 Phương pháp dòng chảy FIA (Flow injection analysis)
FIA là một phương pháp kĩ thuật phân tích động, trong đó mẫu phân tích ở dạng lỏng được bơm trực tiếp vào dòng chất mang chuyển động liên tục Sau đó mẫu đi đến vòng phản ứng, rồi trong vòng phản ứng chất phân tích sẽ phản ứng với thuốc thử có trong chất mang để tạo ra sản phẩm có thể phát hiện được theo một tính chất hoá lí nào đó của nó nhờ một Dertector thích hợp Các tính chất hóa lí có thể phát hiện như:
• Sự hấp thụ quang phân tử UV-VIS
• Sự hấp thụ quang nguyên tử
• Tính chất huỳnh quang
• Sự thay đổi chiết suất trong pha động
Trang 22• Sự thay đổi điện thế
Để xác định nitrate bằng phương pháp FIA người ta tiến hành hai thí nghiệm sau:
Kolthoff và các cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu xác định NO3- bằng dòng cực phổ xúc tác Các tác giả cho rằng trong nền HCl (0,1M) chứa một lượng nhỏ Urani axetat sự khử U(VI) xảy ra theo hai bước:
Trang 23U(VI) + e -> U(V)
U(V) + e -> U(III)
tạo nên hai sóng cực phổ:
- Sóng thứ nhất ứng với sự khử U(VI) xuống U(V) có thế bán sóng E(1/2)=-0,18V
- Sóng thứ hai ứng với sự khử U(V) xuống U(III) có thế bán sóng E(1/2)=-0,94V Khi có mặt của ion NO3- thì chiều cao của sóng thứ hai tăng lên tỉ lệ tuyến tính với nồng độ NO3- trong khoảng 5.10-5- 4.10-4 M
2.1.5.5 Phương pháp đo khí
Hassan là người đưa ra một phương pháp đo khí đơn giản thích hợp cho việc xác định đồng thời nitrate và nitrite trong cùng một mẫu Theo ông, đầu tiên nitrite được phân huỷ bằng Urê ( CO(NH2)2 ) hoặc acid Sunfamit ( HSO3NH2 ) để tạo ra khí N2 trong môi trường acid yếu Trong điều kiện này, nitrate không tham gia phản ứng Khí Nitơ tạo ra được đo bằng một trắc đạm rất nhỏ
Các phản ứng xảy ra:
2KNO2 + CO(NH2) + 2HCl -> 2N2 + CO2 + 3H2O + 2KCl
KNO2 + HSO3 -> N2 + KHSO4 + H2O
Sau đó, đun nóng dung dịch và tạo môi trường acid mạnh thì nitrate sẽ phản ứng tạo thành khí N2O:
2KNO3 + CO(NH2)2 + 2HCl -> 2N2O + CO2 + 3H2O + 2KCl
2KNO3 + HSO3NH2 + HCl -> N2O + H2SO4 + H2O + KCl
Khí N2 và N2O được giữ lại trong trắc đạm kế bằng dung dịch KOH trên 50%
2.1.5.6 Phương pháp xác định tổng NO 3 - và NO 2 -
Người ta có thể xác định tổng NO3- và NO2- trong cùng một mẫu bằng phương pháp khá đơn giản là sử dụng hỗn hợp Cd-Cu
Nguyên tắc của phương pháp như sau:
- Ion NO3- bị khử thành ion NO2- với sự có mặt của Cd Các hạt Cd được xử lý với dung dịch CuSO4, sau đó được nạp vào cột thuỷ tinh Phản ứng khử tiến hành tốt nhất ở
pH = 6-8 Hiệu suất khử đạt 88-90%
Trang 24- Ion NO2- được xác định nhờ phản ứng tạo màu azô hoá bằng acid sunfanilic và naphtylamin Phức tạo thành có cường độ màu lớn Cực đại hấp thụ ở bước sóng 520nm Phương pháp này được dùng để phân tích NO3- với nồng độ nhở hơn 1ppm mà các phương pháp khác không đủ nhạy để phát hiện
α-2.1.5.7 Phương pháp bắt cặp ion trong HPLC
Đây là phương pháp chúng tôi sử dụng trong đề tài nghiên cứu này
2.1.5.7.1 Giới thiệu phương pháp bắt cặp ion
Sắc ký bắt cặp ion là một dạng hình thức khác của sắc ký trao đổi ion Nhiều vấn đề
có thể được giải quyết bằng một trong hai phương pháp nhưng sắc ký trao đổi ion không hiệu quả bằng sắc ký bắt cặp ion trong việc tách những hỗn hợp acid, base và trung tính trong một số tình huống Pha tĩnh sử dụng trong sắc ký bắt cặp ion là cột pha đảo
Những mẫu có ion có thể được tách ra bởi sắc ký hấp phụ pha đảo, với điều kiện là chúng chỉ chứa những acid yếu hoặc những base yếu, được xác định trong việc chọn pH, điều này được gọi là ức chế ion Một hợp chất ion hòa tan được trong nước có thể được ly trích vào trong một dung môi hữu cơ bằng cách dùng một ion trái dấu thích hợp để tạo thành phân tử hữu cơ trơ (kém phân cực) theo phương trình sau:
Mẫu+ + ion đếm- => (mẫu+ion đếm-)org
Cặp ion (mẫu+ ion đếm-) hoặc (mẫu- ion đếm+) thể hiện như một phân tử phân cực không ion hoá và tan được trong dung môi hữu cơ Bằng cách chọn một cặp đôi thích hợp
và điều chỉnh nồng độ của nó, ion Mẫu+ và ion Mẫu- có thể được ly trích một cách hiệu quả vào trong một pha hữu cơ
Việc sử dụng phương pháp sắc ký bắt cặp ion để tách những mẫu chứa ion có những điều thuận lợi được tóm tắt như sau:
• Có thể sử dụng hệ thống pha đảo để tách vì cột C18 có hiệu năng cao hơn so với cột trao đổi ion và thường nhanh chóng hơn
• Hỗn hợp của acid, base, trung tính và cả lưỡng tính (vừa có cation và vừa có anion) có thể được tách ra
Trang 25• Sắc ký bắt cặp ion có thể là một lựa chọn tốt nếu giá trị pKa của phân tích là
phù hợp
• Tính chọn lọc có thể bị ảnh hưởng bởi việc lựa chọn của ion đếm
2.1.5.7.2 Sắc ký bắt cặp ion trong thực tế
Sắc ký bắt cặp ion phù hợp cho tất cả các hợp chất chứa ion nhưng không phải tất cả
các ion đếm đều tốt như nhau trong mọi trường hợp Bảng 2.2 liệt kê một số ion đếm phù
hợp cho sắc ký hấp phụ pha đảo với pha động Methanol- Nước hoặc Acetonitril- Nước
Bảng 2.2: Tính ứng dụng của các ion đếm khác nhau
Các amine bậc 3 Ví dụ: Trioctylamine Sulphonate
Alkyl- và arylsuphonate Ví dụ: Methane-
và Heptanesulphonate,
Camphorsulphonic acid
Base mạnh và yếu, muối Benzalkonium, Catecholamine
Acid Perchloric Bắp cặp ion rất mạnh với những mẫu có Base
Alkylsuphonate Ví dụ: Laurysulphate Thích hợp với Sulphonic acid
Có nhiều hỗn hợp thuốc thử thích hợp để pha trong dung dịch đệm, tuy nhiên nhiều
nhà phân tích thích trộn lại tạo thành “cocktail” pha động phù hợp với vấn đề của họ Một
vài ví dụ:
- Tetrabutylammonium (C4H9)4N+, dung dịch đệm có pH 7.5, tạo thành cặp ion với
acid mạnh và yếu và ion base yếu của dung dịch đệm
- Alkylsulphonic acid CH3 (CH2)nSO3- với n = 4-7, dung dịch đệm có pH 3.5, tạo
thành cặp ion với base yếu và mạnh và ion acid yếu của dung dịch đệm Chuỗi alkyl càng
dài, thời gian lưu càng đẹp
Gloor và Johnson đã cung cấp một số hướng dẫn cho sắc ký bắt cặp ion:
¾ Nên sử dụng phương pháp này khi mẫu vừa chứa cả hợp chất ion và không ion
Trang 26¾ Hỗn hợp Methanol- Nước nên dùng làm pha động, vì thế làm giảm tối thiểu vấn
đề tính tan của ion đếm Sử dụng Acetonitril nếu tính chọn lọc không phù hợp, nhưng trong trường hợp này tính tan có thể khác
¾ Việc chọn đúng ion đếm rất quan trọng, nếu ít sự khác biệt trong cấu trúc phân tử của mẫu thì sử dụng các chuỗi ion đếm ngắn, sử dụng chuỗi dài hơn hay các loại kỵ nước nếu thời gian lưu được yêu cầu dài hơn
¾ Tính tan của ion đếm nên được kiểm tra cho các tỉ lệ pha trộn của tất cả pha động
để đảm bảo rằng nó sẽ xuất hiện trong suốt quá trình phân tích
¾ pH của pha động nên được chọn để tạo sự ion hóa mẫu cao nhất
¾ Pha đảo C8 hoặc C18 nên được chọn làm pha tĩnh Chuỗi alkyl ngắn hơn dường như thiếu sự ổn định
¾ Pha động nên được khử khí trước để tránh tạo bọt khí
Trang 272.2 Tổng quan về HPLC
2.2.1 Giới thiệu HPLC
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm, đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng
2.2.2 Khái niệm HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách
Trang 28một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Trong trường hợp loại này có 2 loại hấp phụ:
• Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP – HPLC): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực
• Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP – HPLC): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, thuốc hạ nhiệt, giảm đau…
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng loại sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau:
- L1: RP 18 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10
- L7: RP 8 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10
- L3: Si 60 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10
- Và một số loại cột khác như cột Diol, cột NH2, CN…
2.2.3.2 Sắc ký trao đổi ion
Pha tĩnh chứa những nhóm ion (NR3+ hay SO3-) tương tác với những nhóm ion của phân tử mẫu Phương pháp này phù hợp tách các chất (ví dụ như amino acid), những sản phẩm chuyển hóa ion và ion hữu cơ
2.2.3.3 Sắc ký ghép cặp ion
Phương pháp ion ghép cặp có thể cũng được sử dụng cho sự tách ra của những hỗn hợp ion và vượt qua một số vấn đề cố hữu của phương pháp trao đổi ion
2.2.3.4 Sắc ký rây phân tử- sắc ký gel
Chế độ này có thể được chia thành sắc ký thấm chất gel ( với những dung môi hữu
cơ) và sắc ký lọc gel (với những dung dịch nước)
Sắc ký rây phân tử tách phân tử dựa vào kích thước, tức là dựa vào khối lượng phân
tử Những phân tử lớn nhất được tách ra đầu tiên và những phân tử nhỏ nhất được tách
Trang 29cuối cùng Đây là phương pháp tốt nhất để lựa chọn khi hỗn hợp chứa các chất khác nhau
về khối lượng phân tử ít nhất 10%
Ngoài ra còn có sắc ký phân bố, sắc ký chiết
Nhưng thực tế hiện nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu
2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký:
¾ Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo
¾ Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion
¾ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết
¾ Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử
Cùng với với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất A, B, C…vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C…sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác:
Hình 2.4: Hình biểu diễn sự tương tác các chất trong quá trình sắc ký
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại
Trang 30 Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó F1
và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn
Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột
Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột
Hình 2.5: Hình minh họa cho quá trình tách các chất trong cột sắc ký
2.2.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
Hình 2.6: Sắc ký đồ
Trang 31Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ như hình trên
Sắc ký đồ gồm nhiều peak :
- Các peak có thể tách rời nhau hoàn toàn
- Các peak có thể chập nhau một phần
- Các peak có thể chập nhau hoàn toàn
Từ các thông số của peak trên đây, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa
ra để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực
tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký
2.2.5.1 Thời gian lưu thực t’ r : Retention time
Hình 2.7: Sắc ký đồ biễu diễn thời gian lưu của các chất
Chú thích:
T0 : Thời gian lưu chết
t’r1 : Thời gian lưu thực chất A
t’r2 : Thời gian lưu thực chất B
tr1 : Thời gian lưu chất A
tr2 : Thời gian lưu chất B
Trang 32Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất
đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại
Thời gian lưu của một chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :
¾ Bản chất sắc ký của pha tĩnh
¾ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
¾ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
¾ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tr quá lớn thì peak
bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hóa chất, độ chính xác của phép phân tích kém
Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày
2.2.5.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity factor
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng
Trang 33Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :
¾ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh
¾ Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động
¾ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột
Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau :
N = 5.54 (t R / W 0.5 ) 2
Trong đó : tR : thời gian lưu của chất phân tích
W0.5 :Độ rộng tại điểm ½ của peak
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ
2.2.5.5 Độ phân giải R : (Resolution)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của 2 peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau :
R = 2(t’ RB – t’ RA ) / (w A + w B )
Trang 34Trong thực tế nếu các peak cân đối (Gass) thì độ phân giải tối thiểu để 2 peak tách ra
lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các peak ta phân tích
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích
2.2.5.6 Hệ số không đối xứng T (Tailing factor)
Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký đồ thu được
T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa peak tại điểm 1/10 chiều cao peak :
T = a/b
Trang 35Hình 2.9: Hình biễu diễn hệ số không đối xứng T
• Khi T ≤ 2.5 thì phép định lượng được chấp nhận
• Khi T ≥ 2.5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định
Vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho peak cân đối hơn theo cách sau :
Làm giảm thể tích chết tức là giảm đoạn ống nối từ cột đến Detector
Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên
Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu
Trang 364 Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample)
5 Cột sắc ký (pha tĩnh) ( để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt)
6 Detector (nhận tín hiệu)
7 Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lí dữ liệu và điểu khiển
hệ thống HPLC
8 In dữ liệu
Trang 372.3.1 Bình đựng dung môi
Cấu tạo :
• Thủy tinh màu, trung tính, 100 – 2000ml, kín (tránh bay hơi dung môi)
• Xử lý dung môi : lọc qua màng lọc 0.45 hoặc 0.22 μm và đuổi khí hòa tan Vật liệu lọc dung môi :
• Nước : cellulose nitrate, cellulose acetat
• Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước : màng lọc RC (Regenerated cellulose), polyamid hay nylon
• Dung môi hữu cơ : màng lọc teflon
Hình 2.11: Bộ phận lọc dung môi
Bình luôn luôn có một cái nắp bảo vệ không cho bụi rơi vào trong bình, nắp có lỗ hở
để bình luôn thông với khí trời Trong bình , có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc
ký, ở đầu này có gắn nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng chất lỏng Các nhà sản xuất có những bình chuyên dùng để cho nút lọc bằng kim loại nói trên lọt vào một lỗ giếng, bảo đảm đầu ống luôn chạm sát đáy bình,
có thể sử dụng đến giọt dung môi cuối cùng trong bình
Trước khi lắp một bình dung môi vào vị trí hoạt động, cần phải loại bỏ phần không khí đã hòa tan vào dung môi trước đó, gọi là khử bọt khí (degassing), bởi vì nếu còn lẫn
Trang 38những bọt không khí vào trong luồng dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt động kém hiệu quả
Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%
Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 2 hay 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định, tránh nhiễu đường nền gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích
Lưu ý : Nhằm mục đích tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các
peak tạp trong quá trình phân tích :
¾ Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích
¾ Tất cả các hóa chất dùng pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích
Có hai cách sử dụng pha động trong việc rửa giải: rửa giải đơn nồng độ (isocratic elution) và rửa giải nồng độ tăng dần tuyến tính (gradient elution) :
• Rửa giải đơn nồng độ: với một pha động lựa chọn (một dung môi hay hỗn hợp hai dung môi với tỉ lệ xác định) được sử dụng trong suốt quá trình sắc ký cột Muốn thay đổi qua một loại pha động khác, phải ngưng quá trình sắc ký, thay bình chứa dung môi, cho pha động hoạt động trở lại
• Rửa giải nồng độ tăng dần tuyến tính: trong quá trình sắc ký, tính phân cực của pha động được thiết kế để tăng dần lên từ từ đều đặn, tương tự như sắc ký khí, nhiệt độ của cột phân tích được chỉnh lên tăng dần
Hai kiểu chương trình dung môi :
- Trộn dung môi ở áp suất thấp
Trang 39- Trộn dung môi ở áp suất cao
2.3.2 Bộ phận khử khí (Degasse)
Mục đích : loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại ngay trong bình chứa dung môi (lọc dưới
áp suất giảm, siêu âm, sục khí trơ) hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi dung môi vào bơm
Các cách khử khí :
• Lọc dưới áp suất giảm : vừa loại khí hòa tan vừa loại tạp
• Siêu âm : đuổi khí thừa khỏi dung môi, kết hợp với đuổi khí bằng áp suất giảm
• Sục khí trơ (Helium) : đuổi khí hòa tan khỏi dung môi
• Khử ngay trên dòng (online membrane degassing)
Trang 40Hình 2.12: Hệ thống khử dung môi ngay trên dòng
Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót lại các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra :
- Tỷ lệ pha động của các dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi
- Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai
2.3.3 Hệ thống bơm
Mục đích: của hệ thống bơm là bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Pump phải tạo được áp suất cao khỏang 3000-6000 PSI hoặc 250 at-500 at (1 at= 0.98 bar) và pump phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar)
Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa là 412 bar Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút
Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục
Có 2 loại bơm:
