TH chủ động CNSHTV nhóm 1

thực hành chủ động công nghệ sinh học thực vậtKHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO Ở CÂY ĐẢNG SÂM (Codonopis Javanica (Blume) Hook.F.)KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO Ở CÂY ĐẢNG SÂM (Codonopis Javanica (Blume) Hook.F.)KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO Ở CÂY ĐẢNG SÂM (Codonopis Javanica (Blume) Hook.F.)KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO Ở CÂY ĐẢNG SÂM (Codonopis Javanica (Blume) Hook.F.)KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO Ở CÂY ĐẢNG SÂM (Codonopis Javanica (Blume) Hook.F.)

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

ĐỀ TÀI KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE VÀ

NƯỚC DỪA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO

Ở CÂY ĐẢNG SÂM (Codonopis Javanica (Blume) Hook.F.)

GVHD: Trịnh Thị Hương

Sinh viên thực hiện: Nhóm 1

QTTT

THTV

QAT

THỰC HÀNH CHỦ ĐỘNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE VÀ

NƯỚC DỪA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI

IN VITRO Ở CÂY ĐẢNG SÂM (Codonopis Javanica (Blume) Hook.F.)

1 Mục đích

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose và nước dừa đến khả

năng nhân nhanh chồi của cây Đảng sâm (Codonopis Javanica (Blume)

Hook.F.)

2 Giới thiệu tổng quan

Đảng sâm (Codonopsis Javanica (Blume) Hook.f et Thomson) hay còn gọi là sâm dây thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae), là loài thân thảo, sống nhiều

năm Bộ phận dùng làm thuốc duy nhất của đảng sâm là rễ, với thành phần chính là saponin (loại saponin chủ yếu là saponin triterpenoid), các polysaccharide, phenylpropanoid, alkaloid, triterpenoid và các acid amin thiết yếu

Các hoạt chất có trong đảng sâm giúp cho hoạt động trao đổi chất của cơ thể tốt hơn, đảng sâm có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm, giảm ho, kháng khuẩn, làm tăng số lượng hồng cầu, làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu đông khô mà không có tác dụng tán huyết Trong đông y, đảng sâm được ví là “nhân sâm của người nghèo” vì

nó có mọi công dụng của nhân sâm nhưng lại rẻ tiền hơn Từ những công dụng cũng như giá thành không quá đắt như nhân sâm đã làm cho việc sử dụng đảng sâm trở nên phổ biến rộng rãi

Tuy nhiên, nạn tàn phá rừng, cũng như sự khai thác quá mức làm cho vùng phân bố của cây đảng sâm trong tự nhiên bị thu hẹp nhanh chóng và có nguy cơ cạn kiệt, loài cây này đã được đưa vào danh mục nguy cấp của sách đỏ Việt Nam (2007) Trong khi đó nguồn cây giống đảng sâm phục vụ trồng trọt chủ yếu được cung cấp bằng phương pháp gieo hạt, mà phương pháp gieo hạt cho

ra cây có sức sống yếu, chất lượng cây không đồng đều Do đó, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống các loại cây dược liệu để sản xuất số lượng lớn cây giống sạch bệnh và tương đối đồng đều về mặt di truyền trong thời gian ngắn

Và trong nuôi cấy mô thì sự có mặt của các chất bổ sung đóng vai trò khá quan trọng Các chất bổ sung nếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng và thời gian thích hợp sẽ tạo điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng và phát triển tốt Và trong bài thực hành này sẽ đề cập về ảnh hưởng của một số chất bổ sung tiêu biểu như đường sucrose và nước dừa đến

khả năng nhân nhanh chồi của cây Đảng sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook.f in vitro

3 Thiết bị - Dụng cụ

Bảng 1: Dụng cụ - thiết bị cho bài thực hành

STT Dụng cụ - Thiết bị

1 Erlen 250ml

2 Cốc thủy tinh

6 Ống nghiệm Φ25

7 Bình tam giác

8 Đũa thủy tinh

10 Xoong nhôm

11 Máy đo pH

12 Cân 4 số

13 Nồi hấp

15 Máy khuấy từ gia nhiệt

16 Bếp điện

17 Lò vi sóng

4 Nguyên liệu - Hóa chất - Môi trường

Bảng 2: Nguyên liệu - Hóa chất cho bài thực hành

STT Tên nguyên liệu - hóa chất Đơn vị tính Số lượng

2 Cồn 98o, 70o Lít 3

Theo kế hoạch

bố trí thí nghiệm

10

Benzylaminopurine (BAP) mg/l

11 Indole-3-butyric acid (IBA) mg/l

5 Tổ chức thực hành

5.1 Chuẩn bị vật liệu, môi trường và điều kiện thí nghiệm

 Vật liệu: Cây đảng sâm được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh

 Mẫu: Đoạn thân chứa chồi ngủ có kích thước khoảng 1cm

 Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962)

 Nguyên tắc pha môi trường nuôi cấy với các thành phần và hàm lượng phù hợp:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ sung bằng các công thức môi trường khác nhau để đánh giá khả năng nhân nhanh chồi của cây Đảng sâm sau thời gian 1 tuần: Môi trường MS cơ bản có bổ sung 0,6 mg/l BAP + 0,6 mg/l IBA + 9,0g/l agar + chất bổ sung (Đường sucrose, nước dừa) với nồng độ khác nhau Lưu ý: Cần thêm 30g/l đường sucrose đối với nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi

- Cách pha môi trường:

 Thí nghiệm khảo sát về ảnh hưởng của nồng độ đường: Cân 4,4g/l môi trường MS cơ bản cho vào cốc 500mL rồi hòa tan bằng nước cất → Thêm 0,6 mg/l BAP + 0,6 mg/l IBA → Khuấy đều rồi dùng ống đong định mức đến 1000mL → Đổ toàn bộ môi trường vào xoong nhôm rồi dùng máy đo pH (Chỉnh pH bằng HCl hoặc NaOH

sao cho pH môi trường nằm trong khoảng 5.7 - 5.8) → Bổ sung 9,0g/l agar vào môi trường → Đun trên bếp điện sao cho môi trường tan đều → Rót môi trường ra 4 cốc, mỗi cốc chứa 250mL môi trường → Bổ sung hàm lượng đường sucrose vào mỗi cốc tương ứng như sau: 10g/l, 20g/l, 30g/l, 40g/l → Khuấy đều rồi đổ dung dịch vào chai thủy tinh 100mL, mỗi chai khoảng 20 - 25mL

→ Hấp khử trùng môi trường ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 121oC trong 20 phút

 Thí nghiệm khảo sát về ảnh hưởng của nồng độ nước dừa: Cân 4,4g/l môi trường MS cơ bản cho vào cốc 500mL rồi hòa tan bằng nước cất → Thêm 30g/l đường sucrose + 0,6 mg/l BAP + 0,6 mg/l IBA → Khuấy đều rồi dùng ống đong định mức đến 1000mL →

Đổ toàn bộ môi trường vào xoong nhôm rồi dùng máy đo pH (Chỉnh pH bằng HCl hoặc NaOH sao cho pH môi trường nằm trong khoảng 5.7 - 5.8) → Bổ sung 9,0g/l agar vào môi trường → Đun trên bếp điện sao cho môi trường tan đều → Rót môi trường

ra 4 cốc, mỗi cốc chứa 250mL môi trường → Bổ sung hàm lượng nước dừa vào mỗi cốc tương ứng như sau: 50ml/l, 100ml/l, 150ml/l, 200mL/l → Khuấy đều rồi đổ dung dịch vào chai thủy tinh 100mL, mỗi chai khoảng 20 - 25mL → Hấp khử trùng môi trường ở áp suất 1.1 atm, nhiệt độ 121oC trong 20 phút

 Môi trường đối chứng:

 Ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose: 4,4g/l môi trường MS

cơ bản có bổ sung 0,6 mg/l BAP + 0,6 mg/l IBA + 9,0g/l agar

 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa: 4,4g/l môi trường MS cơ bản

có bổ sung 30g/l đường sucrose + 0,6 mg/l BAP + 0,6 mg/l IBA + 9,0g/l agar

 Cách pha môi trường đối chứng tương tự như cách pha môi trường thí nghiệm khảo sát về ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose, nước dừa

 Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong thời

gian chiếu sáng 12h/ngày, độ ẩm phòng nuôi cấy 50-60%, nhiệt độ 25 ±

2oC, cường độ chiếu sáng là 2500 - 3000 Lux

5.2 Ảnh hưởng của các chất bổ sung đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Đảng sâm in vitro

5.2.1.Hàm lượng đường sucrose

- Trong tủ cấy vô trùng, dùng kẹp vô trùng gắp cây con cắt lấy một đoạn thân có chứa các chồi ngủ kích thước khoảng 1cm

- Dùng kẹp vô trùng chuyển lần lượt các đoạn thân mang mắt ngủ vào môi trường đối chứng (Môi trường MS cơ bản có bổ sung 0,6 mg/l BAP + 0,6 mg/l IBA + 9,0g/l agar) và các môi trường thí nghiệm chứa lần lượt 10g/l, 20g/l, 30g/l, 40g/l đường sucrose

- Theo dõi kết quả

Thời gian Sucrose

(g/l)

Số chồi/mẫu

Số lá/chồi

Chiều cao chồi

Hình thái chồi

1 tuần

xanh tốt

xanh tốt, chồi to

về bề ngang

xanh tốt, chồi ốm

và cao

nhưng không xanh tốt

Hình 1 Hình ảnh cây Đảng sâm sinh trưởng và phát triển sau 1 tuần

trên các nghiệm thức môi trường khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường

5.2.2.Hàm lượng nước dừa

 Trong tủ cấy vô trùng, dùng kẹp vô trùng gắp cây con cắt lấy một đoạn thân có chứa các chồi ngủ kích thước khoảng 1cm

 Dùng kẹp vô trùng chuyển lần lượt các đoạn thân mang mắt ngủ vào môi trường đối chứng (Môi trường MS cơ bản có bổ sung 30g/l đường sucrose + 0,6 mg/l BAP + 0,6 mg/l IBA + 9,0g/l agar) và các môi trường thí nghiệm chứa lần lượt 50ml/l, 100ml/l, 150ml/l, 200mL/l nước dừa

 Theo dõi kết quả

Thời gian Nước

dừa(ml/l)

Số chồi/mẫu

Số lá/chồi

Chiều cao chồi

Hình thái chồi

1 tuần

xanh tốt

xanh tốt, chồi ốm

và cao

bề ngang

nhưng không xanh tốt, lá hơi vàng

Hình 2 Hình ảnh cây Đảng sâm sinh trưởng và phát triển sau 1 tuần trên các

nghiệm thức môi trường khảo sát ảnh hưởng hàm lượng nước dừa

6 Chỉ tiêu đánh giá

Sau 1 tuần khảo sát các chỉ tiêu sau:

 Tỷ lệ mẫu sống

 Tỷ lệ mẫu bật chồi

 Số chồi/mẫu

 Số lá/chồi

 Chiều cao chồi

 Hình thái chồi

7 Nhận xét và kết luận

 Nhận xét:

 Ảnh hưởng của đường sucrose:

 Từ kết quả thực nghiệm sau 1 tuần nuôi cấy cho thấy, các nghiệm thức môi trường có bổ sung hàm lượng đường sucrose với nồng độ thích hợp cho khả năng nhân chồi, cũng như chiều cao chồi phát triển vượt trội hơn so với môi trường đối chứng (Không bổ sung đường) Tuy nhiên, hàm lượng đường sucrose nếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng quá cao sẽ ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu giữa môi trường dinh dưỡng với môi trường nội bào của mẫu chồi, làm

giảm khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng từ đó làm suy yếu sự sinh trưởng của chồi nuôi cấy

 Trong 4 nghiệm thức môi trường có bổ sung đường sucrose thì ở nghiệm thức môi trường có bổ sung 20g/l đường sucrose cho kết quả tốt nhất với số lượng chồi nhiều, chiều cao cũng như số lá/chồi hơn hẳn các nghiệm thức môi trường còn lại Còn ở nghiệm thức môi trường chứa 40g/l đường thì số chồi ít, chiều cao chồi thấp, số lá/chồi ít nhất trong 4 nghiệm thức môi trường

 Vậy, nghiệm thức môi trường nuôi cấy chứa 20g/l đường sucrose

là môi trường phù hợp nhất cho khảo sát nhân nhanh chồi ở cây Đảng

sâm in vitro.

 Ảnh hưởng của nước dừa:

 Dựa vào kết quả thực nghiệm sau 1 tuần nuôi cấy cho thấy, hầu hết các nghiệm thức môi trường có bổ sung nước dừa với hàm lượng thích hợp cho khả năng nhân chồi, cũng như sự sinh trưởng và phát triển của chồi vượt trội hơn so với môi trường đối chứng (Không bổ sung nước dừa)

 Trong 4 nghiệm thức môi trường có bổ sung nước dừa thì ở nghiệm thức môi trường có bổ sung 200ml/l nước dừa cho kết quả tốt nhất với số lượng chồi nhiều, chiều cao cũng như số lá/chồi hơn hẳn các nghiệm thức môi trường còn lại

 Kết luận:

 Đường là nguồn carbon quan trọng trong nuôi cấy mô, tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà nồng độ bổ sung vào môi trường có thể thay đổi

 Nước dừa là hợp chất hữu cơ giàu chất khoáng và có chứa myo-instol, cùng 1 số các acid amin, Do đó, nước dừa có tác dụng kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi

 Qua 2 thí nghiệm khảo sát có thể thấy, trong nuôi cấy cây Đảng sâm in

vitro, môi trường MS cơ bản có bổ sung 0,6 mg/l BAP + 0,6 mg/l IBA

+ 30g/l sucrose + 9,0g/l agar + 200ml/l nước dừa là môi trường tốt nhất cho sự phát sinh, cũng như sự sinh trưởng và phát triển của chồi cây

Đảng sâm in vitro.

8 Tài liệu tham khảo

Bui Thi Ha, Nguyen Thi Tam (2021) “Effects of some supplements on the

growth of Dang sam (Codonopis Javanica (Blume) Hook F.) in vitro”.