DINH DƯỔNG CỦA VI SINH VẬT
3. NGUỒN THỨC ẢN NITO CỦA VI SINH VẬT
Nguốn nitơ dễ hấp thụ n h át đối với vi sinh vật là N H3 và NH+. Trước đây ctí quan điểm cho ràng một sổ vi khuẩn không có khả năng đổng hóa muối amon. Quan điểm này không đúng. Ngày nay người ta cho rằ n g tấ t cả các loại vi sinh vật đểu có khả nâng sử dụng muối amon. Đôi khi cổ nhữ ng loại vi sinh vật không phát triển được trên các môi trư ờ ng chứa muối amon thì nguyên n h ân không phải ở bản th ân gốc N H + m à là ở độ chua sinh lí do các muối này tạo ra. Sau khi đống hda gốc N H + trong môi trư ờ ng sẽ tích lũy các anion vô cơ (SO^ , HPO^ , C1 ...) và vì thế mà làm hạ th ấp rấ t nhiểu trị số pH của môi trường. Muói amon của các axit hữu cơ ít làm chua môi trư ờng hơn do đó có lúc được sử dụng nhiểu hơn (mặc dâu đất hơn).
Ure là nguổn thức ân nitơ tru n g tính về m ật sinh lí. Khi bị phân giải bởi enzim ureaza, ure sẽ giải phtíng thành N H3 và COr P h ẵn N H3 được vi sinh vật sử dụng mà không làm chua môi trường như đổi với các muối amon :
ureaza
N H 2 - c o - N H 2 + H 20 --- * 2 N H j + C 02
Nhiéu khi để nuôi cẵy vi sinh vật bằng nguồn nitơ là ure người ta phải bổ sung thêm muối am on (như am on sunphat chẳng hạn). Sở dỉ như vậy là bởi vì phải có thức ân nitơ dễ hấp thụ cho vi sinh vật phát triể n đã thỉ mỏi có th ể sản sinh ra được ureaza để thủy phân ure.
Cũng có loại vi sinh vật sở di không p h át triể n được trê n môi trường chi có nguôn thức ản nitd là muối am on không phải vì không đổng hóa được muối này mà là do chúng đòi hỏi phải được cung cáp thêm một vài loại axit am in không thay th ế nào đo.
Muối n itr a t là nguổn thức ăn nitd thích hợp đối với nhiểu loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiểu loại nấm men và vi khuân. Sau khi VI sinh vật sử dụng hết gốc NOj các ion kim loại còn lại (K+, N a+, Mg2+...) sẽ làm kiềm htía môi trường. Để trá n h hiện tượng này người ta thường sử dụng muối NH4N 03 để làm nguổn nitơ cho nhiéu loại vi sinh vật. Tuy nhiên gốc N H4 thường bị hấp thụ nhanh hơn, rổi mới hấp thụ đến gốc NOJ.
Nguổn nitơ có dự trữ nhiéu n h ất trong tự nhiên là nguổn khí nitơ tự do' (N 2) tro n g khí quyển. Chúng chiếm tỉ lệ rấ t cao tro n g không khí (75,5% theo khối lượng hoậc 78,16% theo th ể tích). Số lượng nitơ trong lớp khí quyển bên trên mỗi ha đất đai nhiều tới 85000 tấn , còn tổng số nitơ tro n g cả khí quyển là khoảng 4.000.000.000.000.000 tấn. Trong khí nitơ (N2) hai nguyên tử N liên kết với nhau bàng 3 dây nối r ẫ t bển vững (N s N). N ăng lượng của 3 dây nổi này cao tới 225kcal/M.
Chính vỉ vậy mà N2 rấ t khố kết hợp với các nguyên tố khác và nitơ cd rấ t nhiéu chung quanh ta m à cả người, cả động vật lẫn cây trổ n g đêu luôn luôn thiếu thốn thức ân nitơ. Muốn phá vỡ 3 liên kết này người ta phải sử dụng tới những nâng lượng rấ t lớn. Chảng hạn ở nhà máy phân đạm hđa học, m uốn làm cho N2 liên kết được với H để tạo thành N H3 người ta đã phải dùng m ột n h iệt độ là 500°c và m ột áp su ất cao tới 350 atm
Da số vi sinh vật không cđ khả nâng đổng hda N2 tro n g không khí. Tuy nhiên cố nhữ ng vi sinh vật có th ể chuyển hổa th àn h NH^ nhờ h o ạt động xúc tác của một hệ th ống enzim có tên gọi là nitrogenaza. Người ta gọi các vi sinh v ật này là vi sinh vật cđ định nitơ (nitrogen - fixing m icroorganism s) còn q u á trỉn h này được gọi là quá
150
tr ìn h cố định nitơ (nitrogen íìxation). Chúng ta sẽ xem xét quá trìn h này ở một c:hương khác.
Vi sinh vật còn có khả n âng đống hđa rấ t tốt nitơ chứa trong các thức ân hữu c:ơ. Các thức ăn này sẽ vừa là nguổn cacbon vừa là nguổn nitơ cung cấp cho vi sinh v/ật. Vi sinh vật không cđ khả năng hãp thụ trực tiếp các protein cao phân tử. Chi c ó
c:ác polipeptit chứa không q u á 5 gốc axit am in mới cd th ể di chuyển trự c tiếp qua imàng tế bào chất của vi sinh vật. R át nhiéu vi sinh vật C (5 khả năng sản sinh proteaza xú c tác việc thủy phân protein th àn h các hợp chất phân tử th ấp cđ khả n ăn g xâm rahập vào tế bào vi sinh vật.
Nguổn nitơ hữu cơ thư ờ ng được sử dụng để nuôi cẫy vi sinh vật là pepton loại c:hế phẩm thủy phân không triệ t để của m ột nguổn protein nào đấy. Chúng khác nhau-
V 'é lượng chứa các loại polipeptit và lượng chứa axit am in tự do
Chế phẩm Phản ứng Biure
Các th àn h phẩn (tỉ lệ % so với N tổng số)
1 2 3
Pepton Pharm acon + 63,5 9,7 27,8
Pepton Vitte + 44,1 26,7 29,2
Pepton Canbaum + 40,2 27,4 32,4
Pepton Gee + 44,5 23,2 32,3
Sản phẩm thủy phân nhờ
pepxin + 42,1 25,2 32,7
Pepton Roche + 25,3 11,7 63,0
Sàn phẩm thủy phân nhờ
tripxin + 2 , 0 14,9 83,1
Dịch thủy phân gluten - 0 0 1 0 0
Dịch thủy phân gelatin - 0 0 1 0 0
Ghi chú 1 Các polipcptit cao phân tủ được kết tủa bằng lannin khv có mặt 2%
2. Các polipẹptit đuợc kết tủa bằng tannin khi môi iriíòng có phản ứng trung tinh.
3. Những axit amin tự do và các peptit khổng bị tannin làm kết tùa.
Vé axit amin người ta nhận thấy cd th ể cố ba quan hệ khác nhau đối với từ ng loại vi sinh vật. c<5 những loại vi sinh vật không cấn đòi hỏi phải được cung cấp bất kì loại axit amin nào. Chúng cò khả nâng tổng hợp ra toàn- bộ các axit amin mà chúng cán thiết từ NH* và các chất hữu cơ không chứa nitơ. Người ta gọi nhdm vi sinh vật này là nhóm tự dưỡng amin. Có những loại vi sinh vật ngược lại bát buộc phài được cung cấp một hoậc nhiều axit amin mà chúng cấn thiết. Chúng không cổ khả nâng tự tổng hợp ra được các axit amin này. Người ta gọi chúng là nhòm dị dường amin. Loại thứ ba là loại các vi sinh vật không có các axit am in trong môi trường vẫn phát triển được, nhưng nếu có mặt một số axit amin nào đđ thì sự phát triển của chúng sẽ được táng cường hơn nhiéu.
Nhu cấu vé axit am in của các loại vi sinh vật khác nhau là rấ t khác nhau. T rong khi các loài động v ật khác nhau rấ t xa thường cũng chỉ có nhu cấu giống n h au vé các axit am in thì giữa các loài vi sinh vật r ấ t giống nhau vé hình thái và rá t gấn nhau vể vị trí phân loại lại cd th ể đòi hỏi rất khác nhau vé các axit am in. Các axit amin m à cơ th ể sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp (cũng tức là các ax it am in m à cơ thể sinh vật không tự tổ n g hợp được) gọi là các axit am in khổng thay thế. Danh
151
sách các axit am in khổng thay th ế đối với mỗi loài sinh v ật được gọi là am inogram của loài ấy. Aminogram của các loại động vật thường chênh nhau rấ t ít. Các axit amin không thay th ế chủ yếu ở động vật là m etionin, treonin> valin, lơxin, izolơxin, acginin, lizin, phenylalanin, triptophan và histidin. Aminogram của vi sinh vật r ấ t khác nhau.
Nhiéu loại vi khuẩn tùy thuộc nhổm dị dường am in nhưng chỉ đòi hỏi 1-2 loại axit am in nào đố. Trong khi đđ cđ loại vi sinh vật nếu không được cung cấp đủ 17-18 loại axit am in thỉ không th ể phát triể n được. Không cổ các axit am in không th ay th ế chung cho tă t cả các vi sinh vật. Cái là cấn th iết với loại vi sinh vật này cò th ể là hoàn toàn khổng cẩn th iết đối với loại vi sinh vật khác.
Đổi với đa số các loài vi khuẩn người ta thường nuôi cấy cò th àn h p hán như sau :
Nếu làm môi trường đặc thỉ bổ sung thêm 15-20g thạch (tùy theo chất lượng của thạch).
Tuy vậy cổ những vi sinh vật để nuôi cấy được ta phải chuẩn bị môi trư ờ ng với rá t nhiều thành phán khác nhau. Dưới đây là ví dụ vể môi trư ờ n g dinh dưỡng của vi khuẩn Leuconostoc citrovorum :
Nước : lOOOml ; Glucozơ : 25g ; N H4C1 : 3g
KH2P 04 : 600mg ; K2H P 04 : 600mg ; MgS04.7H20 : 200mg F eS 04.7H20 : lOmg ; M nS 04>4H20 : 20mg
NaCl •: lOmg ; Na a x etat : 20g ; D L-A lanin : 200m g
L -acginin : 242mg ; L -asp arazin : 400m g ; axit L -asp a rtic : lOOmg L-xixtein : 50mg ; axit L-glutamic : 300mg ; Glixin : lOOmg
L -h istid in -H C l : 62m g ; DL-izolơxin : 250mg DL-lơxin : 250m g ; D -lizin-H C l : 250mg
D L -m etionin : lOOmg ; Phenynalanin : lOOmg
L -prolin : lOOmg ; D L -serin : 50mg ; D L -treonin : 200m g D L -trip to p h an : 40m g ; L“tirozin : 100 mg ; D L -valin : 250m g Adenin su n p h at H 20 : lOmg ; G uanin-H C1.2H 20 : lOmg
U raxin ; lOmg ; X antin - HC1 : lOmg ; Tiam in : 0,5m g Piridoxin-H C l : l,0 m g ; Piridoxam in-H C l : 0,3mg
Piridoxal-H C l : 0,3mg ; Ca p a n to ten a t : 0,5mg ; RiboAavin : 0,5m g Axit nicotinic : l,0m g : APAB : 0,1 mg ; Biotin : 0 ,0 0 lm g Axit folic : 0,01mg
Các đóng phân axit am in dây D thường không được vi sinh v ật hăp thụ. Chúng thường m ang độc tín h đổi với tế bào. Người ta biết các D -a x it aiiiin cđ th ể cổ m ặt trong m ột số loại ch ất kháng sinh (như gram ixidin, polimixin, actonom ixin...). Chỉ có một sổ loại nẩm mốc cđ chứa enzim raxem aza mới cđ khả n ă n g chuyển hóa D -ax it am in th àn h L -ax it am in.
Để tỉm hiểu mói quan hệ với axit am in của m ột chủng vi sinh v ật nào đó trước hết người ta cấy chủng vi sinh vật này lên m ột môi trường dinh dưỡng cò nguổn nitơ
Pepton Cao th ịt NaCl Nước cất
5g 3g
8g 1000 ml
152
‘duy nhất là muối am on. Nếu chúng phát triể n được thì chứng tỏ chúng thuộc nhổm
ttự dưỡng amin. Nếu chúng không phát triểr* được và sau khi bổ sung hỗn dịch axit amin (dịch thủy phân cazein cđ trộn thêm triptophan) lại phát triển tốt thỉ chứng tỏ chúng thuộc nhóm dị dưỡng amin. Nếu bổ sung hổn dịch axit amin rổi mà chúng vản không phát triển 'được thi phải tỉm xem còn những nhu cẩu nào khác chưa được đáp ứng (vể nguổn cacbon,
về vitamin, vé chất khoáng, về pH, vể thế oxi hóa khử của môi trường).
Muốn biết rố mối q u an hệ của một chủng vi sinh vật với từ ng loại ax it am in riêng biệt, người ta phài sử dụ n g những môi trường cđ chứa đấy đủ nguổn thứ c ăn cacbon, khoáng, vitam in (ở dạn g hóa ch ất tinh khiết) nhưng không chứa axit am in. Lấn lượt bổ sung từ n g loại axit a m i" vào môi trường và theo dõi ảnh hưởng của chúng đối với sự phát triể n của chủng vi sinh vật này. Cũng cđ th ể đưa vào môi trư ờ n g một hỏn dịch đáy đủ các ax it am in và các hỗn dịch đã loại bỏ một cách phân biệt từ n g axit am in một. Theo dõi sự p h át triể n của vi sinh vật sẽ xác định được nhu cấu của chúng đối với từ n g loại axit am in.
Kết quả thực nghiệm trìn h bày tro n g bảng dưới đây cho thấy tro n g số các vi sinh v ật dị dưỡng am in tùy loài, thậm chí tùy từ ng typ khác nhau, m à cđ nhữ ng mối quan hệ rất khác nhau đối với các axit amin.
Nối chung các vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn gây thối, vi khuẩn lactic (sống trong sữa)... thường đòi hỏi phài được cung cấp nhiểu axit am in cổ sản. Các loài vi khuẩn thường sống trong đ ấ t (Azotobacter, C lostridium pasteurianum , các vi khuẩn tự dưỡng hđa nâng...) cổ khả n ăn g tự tổng hợp tấ t cà các axit am in cấn th iết đối với chúng.
Nấm mốc, nấm m en và xạ khuẩn cũng thường không đòi hỏi các axit am in cđ sản.
Tuy nhiên sự có m ặt của các axit am in tro n g môi trư ờng sẽ làm nân g cao tốc độ phát triể n của chúng
Loại Axit amin
LOẠI SIN H VẬT
Dộng vật có vú
Staphy- lococcus
gây tan máu
L acto- bacterium
casei
Strepto- coccus faecalis
Corynebacterium diphtheriae
Staphy- lococcus
aureus
HY PW8
Lizin + + (+) + - - -
Acginin (+) + + + - - -
Histidin + + (+) - + - -
Phenylalanin + + + - + - -
Tirozin - + + (+) - - -
Triptophan + + + + + - +
Prolin - + - - - - -
Glixin - + - + + - -
Alanin - + (+) + - *- -
Valin + + + - + + -
Lơxin + + + + - + -
Izolơxin + + (+) + - - -
Xerin - + + ♦ - - -
Treonin + + (+) + - - -
Xixtein - + + (+) + ♦ -
Metionin + + (+) - + + +
Axit asparaginic - - + + - - -
Axit glutamic - + + • + + + —
Ghi chú : + Cần thiết - Không cần thiết
(+ ) Cố tác dụng kích thích
153
Nhiểu loại vi sinh vật cđ khà năng dùng một loại axit am in nào đđ làm nguổn thứ c ăn nitơ duy nhất. Chúng sẽ phân giải axit am in này th àn h N H3 rổi sau đổ tự tổ n g hợp nên hàng loạt các axit am in khác.
Cd nhữ ng chủng vi sinh vật biểu hiện mối quan hệ rấ t m ật th iết giữa nóng độ của một ax it am in nào đố trong môi trường và mức độ p h át triể n của chúng. Người ta gọi chúng là những vi sinh vật chỉ thị và dùng chúng tro n g việc định lượng axit am in.
Cò th ể dùng các phương pháp gây đột biến để tạo ra các chủng vỉ sinh vật "dinh dưỡng khuyết" (hay khuyết dưỡng), tức là những chủng m ất đi khà năng tự tổng hợp m ột ch ất nào đó, chúng trở nên m ẫn càm với sự cđ m ặt và với nổng độ của ch ất mà chúng cấn th iết (một axit am in, một vitam in hoặc một góc bazơ nitơ nào đd). Phương pháp phân tích axit am in nhờ vi sinh vật càng ngày càng được ứng dụng rộng rãi trên th ế giới. Nđ cho phép p h át hiện những nổng độ axit am in rấ t thấp và rá t thích hợp tro n g các trư ờ ng hợp không th u ận tiện sử dụng các phương pháp phân tích hda lí khác. Bên cạnh các phân tích định lượng (so với đổ th ị tiêu chuẩn) các phân tích định tín h dùng các vi sinh vật chỉ thị này nhiéu khi cũng r ấ t cđ giá trị. C hẳng hạn như việc sử dụ n g vi khuẩn chỉ thị m ẫn cảm với axit glutam ic để p h át hiện các khuẩn lạc vi sinh vật phân lập từ thiên nhiên cd khà năng sinh tổng hợp axit glutam ic.
Dưới đây là phạm vi nồng độ của axit am in m à một số vi khuẩn chl thị có khả n ăn g m ản càm.
L o ạ i a x i t a m i n V i k h u ẩ n c h ỉ t h ị P h ạ m vi n ồ n g đ ộ m ả n c ả m ( y /m l )
p - Alamin Corynebacterium diphiheriae 0-1,5
Alanin Streptococcus faecalis 0 -5 0
Lơxin Streptococcus Ịaecaỉis 0 -10
lzoIờxin Streptococcus Ịaecalis 0 -10
Acginin Streptococcus Ị'accalis 0 -8
Treonin Streptococcus /aecalis 0 -5 0
Valin Streptococcus faecalis 0 -10
Axit asparaginic Lactubacillus delbrueckii 0 -5 0
Serin Lactobacilỉus delbrueckiì 0 -25
Tirozin Lactobacilỉus deibrueckii 0 -8
Xixtein Lactobacillus mesenterơides 0 -5
Glixin Leuconnostoc mesenteroides 0-10
Histidin Leuconnostoc mcsenteroides 0 -5
Lizin Lcuconnosioc mesenteroides 0- 20
Prolin Leuconnostoc mesenteroides 0 -8
Axit gluiamic Lactobacillus arabinosus 0 -5 0
M etionin Lactubacillus arabinosus 0 -10
Phenylalanin Lacíobacillus casei 0-15
Triptophan Lactobacillus casei 0 -2,5
T hành p h ẩn các môi trư ờ ng tổng hợp dùng để định lượng ax it am in nhờ vi khuẩn chỉ th ị thư ờ ng khá phức tạp.
154