CHƯƠNG 1. 1.1. Tổng quan về sữa chua
1.1.4. Cơ sở lý thuyết về quá trình lên men sữa chua
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rất nhiều trong việc chế biến các loại thức ăn chua như sữa chua, muối chua rau quả, thịt chua, nem chua…
Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacter teriaceac. Mặc dù các vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về sinh lý chúng tương đối đồng nhất. Tất cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn gram dương, không tạo bào tử. Trừ Sporolactobacilus inunilus, hầu hết không có khả năng chuyển động. Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải các hợp chất cacbonhydrat và bài tiết acid lactic ra môi
trường. Vi khuẩn lactic là nhóm lên men bắt buộc không chứa các xitocrom và enzyme catalaze. Tuy nhiên, chúng có thể sinh trưởng và phát triển khi có mặt của oxy không khí. Mặc dù chúng thuộc nhóm kỵ khí nhưng cũng thuộc nhóm hiếu khí. Nhu cầu về chất dinh dưỡng của vi khuẩn lactic rất phức tạp, không có một loài nào có thể phát triển thuần khiết trên môi trường chứa glucose và ion NH+4. Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin và acid amin. Vì thế người ta thường nuôi cấy chúng trên các môi trường phức tạp chứa một lượng cao nấm men, dịch cà chua hoặc thậm chí cả máu. Nhìn chung các vi khuẩn lactic là nhóm khó nuôi, dễ giảm hoạt lực.
b. Bản chất của quá trình lên men
Lên men là một quá trình oxy hóa khử xảy ra trong cơ thể sinh vật nhằm cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật, bởi lẽ cơ thể sống luôn cần năng lượng mà năng lượng đó tàng trữ dưới dạng ATP [1].
Các phản ứng hóa sinh trong quá trình lên men là phản ứng tách và vận chuyển hydro ở dạng (H+ +e) dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase. Trong quá trình đó hydro được tách ra khỏi cơ chất chuyển đến tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất hữu cơ đó được khử tạo thành sản phẩm lên men rồi tích tụ lại trong môi trường dinh dưỡng. Tùy theo sản phẩm tích lũy nào chiếm ưu thế mà ta có lên men lactic, lên men rượu...
Vì vậy bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử, quá trình oxy hóa đó lại xảy ra trong cơ thể vi sinh vật dưới tác dụng của hệ thống enzyme, cho nên quá trình lên men còn gọi là quá trình oxy hóa khử sinh học.
Lên men khác với hô hấp yếm khí và hô hấp hiếu khí. Hô hấp yếm khí được tiến hành trong điều kiện không có oxy tham gia. Hydro được chuyển qua mạch hô hấp đến chất tiếp nhận cuối cùng như nitrat hoặc sunfat.
Hô hấp hiếu khí được tiến hành trong điều kiện có oxy tham gia. Hydro được chuyển qua mạch hô hấp đến chất tiếp nhận cuối cùng là oxy tạo thành nước.
Còn lên men có thể thực hiện cả trong điều kiện yếm khí và hiếu khí, nhưng hydro trung chuyển qua hệ thống enzyme oxy hóa khử và chất tiếp nhận cuối cùng là một chất hữu cơ, chất hữu cơ bị khử tạo thành sản phẩm lên men tích lũy trong môi trường.
Tuy nhiên, lên men và quá trình hô hấp đều là quá trình oxy hóa khử sinh học.
Cần phân biệt sự khác nhau giữa quá trình oxy hóa khử sinh học và quá trình đốt cháy các vật liệu tương tự trong lò hay nhiệt lượng kế mặc dù các chất ban đầu và các sản phẩm cuối cùng giống nhau. Khi đốt cháy năng lượng tỏa ra cùng một lúc dưới dạng nhiệt, trong đó lên men và hô hấp chỉ có một phần năng lượng thoát ra dưới dạng nhiệt. Phần nhiệt chủ yếu được tích lũy dưới dạng những hợp chất photpho giàu năng lượng hoặc trong các liên kết cao năng. Từ đó có thể chuyển thành hóa năng, nhiệt
năng hoặc cơ năng để cung cấp cho hoạt động sống. Hợp chất giàu năng lượng quan trọng của cơ thể ATP. Trong cơ thể sinh vật sự tích lũy năng lượng và giải phóng năng lượng sử dụng cho hoạt động sống của cơ thể là những quá trình thuận nghịch theo sơ đồ như:
Như vậy, lên men và sự hô hấp tế bào đều là những quá trình oxy hóa khử sinh học.
Qua đó tế bào vi sinh vật thu được năng lượng.
c. Cơ chế của quá trình lên men
Lên men lactic là quá trình chuyển hoá gluxit thành acid lactic nhờ hoạt động của các khuẩn lactic. Tuỳ theo đặc điểm lên men của vi khuẩn lactic mà người ta chia thành hai kiểu lên men: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình [6].
- Lên men lactic đồng hình cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (80 – 90%) và rất ít các sản phẩm khác.
- Lên men dị hình cho sản phẩm chính là acid lactic (50 – 60%) cùng với số lượng lớn những sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, CO2, diacetyl,..
Đối với nhóm vi khuẩn lactic đồng hình như Lactococcus, các loài Streptococcus thermopphilus,Lactobacillus bulgarcus, Lactobacillus helveticus, Lactobacilluslacts…
chu trình đường phân là con đường chính chuyển hoá glucose thành acid lactic, chỉ một lượng nhỏ acid pyruvic bị khử tạo thành acid acetic, ethanol, CO2, acetone.
Phương trình tổng quát quá trình lên men lactic đồng hình như sau:
C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi 2 CH3CHOHCOOH + 2 ATP
Các vi khuẩn lactic dị hình như giống Leuconostoc do không có một số enzyme cơ bản của chu trình đường phân nên chúng chuyển hoá glucose giai đoạn đầu theo chu trình pentose phosphate và tạo ra sản phẩm trung gian là xylulose-5-phosphate. Trong trường hợp này, chỉ có 50% lượng acid lactic được tạo thành và một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic, ethanol, CO2,… Phương trình tổng quát qus trình lên men lactic dị hình như sau:
C6H12O6 + ADP + Pi CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2 + ATP
Oxy hóa khử sinh học Năng lượng
ADP + H3PO4 ATP
Năng lượng
Các vi khuẩn lên men đồng hình thì thiếu enzyme phosphoketolase là một enzyme tồn tại trong các vi khuẩn lên men dị hình. Mặt khác, các vi khuẩn lên men dị hình lại thiếu enzyme aldolaza có tác dụng phân cắt hợp chất fructose –1,6 diphosphat trong lên men đồng hình.
Trong quá trình lên men lactic, ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), ethanol, CO2 (lên men dị hình), còn xuất hiện nhiều sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành mùi vị đặc trưng cho sản phẩm lên men, được thể hiện ở Bảng 1.2.
Bảng 1.2 Hàm lượng của một số sản phẩm phụ từ quá trình lên men sữa chua được tổng hợp từ vi khuẩn lactic (g/g)
Vi khuẩn Acetaldehyde Acetone Acetoin Diacetyl Streptococcus thermophilus 10 13,5 0,2 5,2 1,5 7 0,1 13 Lactobacillus bulgaricus 1,4 77,5 0,3 3,2 0,1 2 0,5 13 Hỗn hợp 2 chủng 2,0 41 1,3 4 2,2 5,7 0,4 0,9
Acetaldehyde là một cấu tử hương quan trọng trong sữa chua, chủ yếu là do Lactobacillus bulgaricus sinh tổng hợp ra. Các loài vi khuẩn khi sinh trưởng tách biệt trong sữa sẽ tạo ra khoảng 8 – 10 ppm actaldehyde, nhưng khi sinh trưởng cùng nhau, lượng actaldehyde tạo thành sẽ tăng đến hàm lượng mong muốn là 25 ppm hoặc cao hơn. Ngoài ra, diacetyl cũng là một cấu tử hương quan trọng trong sữa chua mặc dù hàm lượng của nó thấp hơn (khoảng 0,8 – 1,5 ppm). Do vi khuẩn lactic không chuyển hoá được citrate nên diacetyl được sinh tổng hợp chủ yếu từ acid pyruvic có nguồn gốc từ quá trình lên men đường [1].
d. Các vi khuẩn lactic sử dụng trong công nghệ sản xuất sữa chua
Trong sản xuất sữa chua thường dùng các chủng vi khuẩn lactic là Streptococus Salivarus Thermophilus, Lactobacillus delbrueckii Bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria. Trong quá trình lên men sữa chua có hình thành các hợp chất bay hơi tạo hương vị đặc trưng của sữa chua như axetaldehyd, exeton, diaxetyl.
Trong sữa chua có các hợp chất axetaldehyd và điaxetyl sinh ra bởi các khuẩn trong khi axeton sinh ra bởi các hợp chất lipid.
Trong sản xuất sữa chua ta thường gặp các chủng vi khuẩn lactic quan trọng sau:
- Chủng Streptococcus thermophilus.
Streptococcus thermophilus là cầu khuẩn có kích thước 0,7 – 0,9 m, phát triển tốt ở nhiệt độ 37 – 40oC, có khả năng chịu nhiệt ở 65oC trong 30 phút, pH tối thích từ 6,6 – 6,8. Đối với chủng này môi trường dung dịch và nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hình thái của chúng. Trong sữa ở nhiệt độ 450C, nó tạo thành những chuỗi ngắn. Còn ở
những nơi tự nhiên với nhiệt độ 300C, nó ở dạng cầu đôi. Nó có thể tạo thành những chuỗi dài ở nồng độ acid cao trong sữa [7], [8], [9], [10].
Streptococcus Thermophilus thuộc nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình sản xuất acid lactic từ đường với hàm lượng từ 85÷98% và một lượng nhỏ các sản phẩm phụ khác. Vi khuẩn này thể hiện hoạt tính phân giải protein rất yếu trong sữa.
Hình 1.2 Streptococcus Thermophilus - Chủng Lactobacillus bulgaricus và Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus bulgaricus là vi khuẩn hình que có kích thước 0,8 – 1 m, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 40 – 45oC trong môi trường có độ acid cao, pH tối thích là 5,2 – 5,6. Lactobacillus Bulgaricus thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình sản xuất 1,7%
D(-) acid lactic trong sữa [11], [9], [12].
Hình 1.3 Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus acidophilus là vi sinh vật độc đáo có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật đường ruột, tăng trưởng trong môi trường acid pH từ 5,5 – 6, nhiệt độ tối ưu 35 – 38oC (Ozbas, 2004). Chúng có khả năng lên men đường fructose, glutose, galactose, mannose, trehalose, saccharose, esculin và maltose. Lactobacillus acidophilus sản xuất từ 0.3÷1.9% DL acid lactic. Lactobacillus acidophilus có tác dụng kháng khuẩn do hình thành các acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic), H2O2 và các chất kháng sinh, giúp kiểm soát được các bệnh nhiễm trùng đường ruột, kháng acid mật và kháng sinh đối với các chủng E.coli trong phân và các mầm bệnh đường ruột khác.
Hình 1.4 Lactobacillus acidophilus
Khối lượng nhỏ các sản phẩm phụ tạo thành các hợp chất thơm chủ yếu là các axetaldehyt do enzyme threonin thành axetaldehyt và glycerin. Các sản phẩm phụ tiếp theo có thể là: axeton butanol 2 và chút ít axeton. Các acid béo quan trọng nhất là các acid axetic, propionic, butyric, isovaleric caproic. Lactobacillus bulgaricus thể hiện hoạt tính phân giải protein trung bình trong sữa dẫn đến sự tích luỹ các acid amin tự do cao. Khi sử dụng hỗn hợp các chủng có Streptococcus thermophilus thì sự giảm hàm lượng đường saccaroza thành đường hexoza như fructoza thì nhanh chóng hơn môi trường chỉ có một chủng Streptococcus Thermophilus. Điều này thể hiện vai trò gián tiếp của Lactobacillus Bulgaricus.
- Chủng Lactobacillus casei
Lactobacillus casei là vi khuẩn được tìm thấy hệ thống tiêu hoá của người (chủ yếu là ruột và miệng), thích nghi tốt ở độ pH rộng. Lactobacillus casei là loại vi khuẩn gram dương, không vận động, không cân bằng và âm tính catalase, nhiệt độ tối ưu ở 30oC, không tăng trưởng ở nhiệt độ quá 45oC [13].
Hình 1.5 Lactobacillus casei - Các chủng Bifidobacterium.ssp.
Các vi khuẩn Bifidobacterium không thuộc nhóm Clostridium của các vi khuẩn Gram dương giống như các vi khuẩn lactic khác. Tế bào của vi khuẩn này có dạng hình que, hơi cong, có phân nhánh, không điển hình. Mặc dù vậy người ta vẫn xem
chúng như là các vi khuẩn lactic vì có khả năng tạo ra phần lớn các vi khuẩn lactic trong quá trình lên men [14].
Bifidobacteria không phát triển trong môi trường sữa bò do trong sữa bò thiếu các yếu tố sinh trưởng cần thiết như N_axetyl_D_glucozamin.
Qua việc tìm hiểu về đặc điểm sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn có khả năng lên men tạo sữa chua ta thấy việc phối hợp một số chủng vi khuẩn lactic sẽ góp phần làm tăng khả năng lên men của sữa chua [15],.
Bifidobacterium longum là một loài vi khuẩn Gram dương có dạng hình que. Nó hiện diện tự nhiên trong đường tiêu hóa của con người. Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng là 37 – 41oC. Tế bào không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 20oC và trên 46oC. Giá trị pH tối ưu cho sự tăng trưởng là 6,5 – 7, không tăng trưởng ở pH thấp hơn 4,5 và pH trên 8,5. Bifidobacterium longum có khả năng chuyển hoá các nguồn đường lactose, sucrose, galatose.
Hình 1.6 Bifidobacterium longum e. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men sữa chua
Ảnh hưởng của pH môi trường
pH môi trường ảnh hưởng đến phát triển của vi khuẩn lactic, sự có mặt của ion H+ sẽ tác động lên tế bào theo nhiều cách:
- Ảnh hưởng trực tiếp lên bề mặt tế bào làm thay đổi sự tích điện trên bề mặt của màng từ đó dẫn đến độ hoạt độ của các enzyme bị giảm.
- Nồng độ ion H+ ảnh hưởng đến độ phân ly của các chất dinh dưỡng trong môi trường lên men.
- pH môi trường còn làm độ phân tán chất keo và độ xốp của thành tế bàokhoong đồng đều nên việc chống lại các tác động bên ngoài sẽ khác nhau dẫn đến làm thay đổi hình dạng của tế bào.
Đối với các vi khuẩn lactic loại cầu khuẩn chịu ph kém hơn so với trực khuẩn.
Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình, pH môi trường không ảnh hưởng đến sản
phẩm đặc trưng của quá trình lên men, còn đối với vi khuẩn lên men lactic dị hình thì ngược lại.
Khi pH môi trường càng cao thì sản phẩm tạo thành chủ yếu là acid lactic. Khi pH môi trường thấp thì sản phẩm tạo thành ngoài acid latic còn có thêm acid acetic và nhiều sản phẩm khác [16].
Ảnh hưởng của nồng độ đường
Trong quá trình lên men, đường là nguồn carbon quan trọng để tích tụ acid lactic. Nếu dịch sữa lên men không đủ lượng đường thì lượng acid tích tụ sẽ không đủ để đạt mức yêu cầu về độ acid cần thiết của sản phẩm sữa chua, sản phẩm sẽ có vị kém, chất lượng sản phẩm không tốt, dễ hư hỏng trong quá trình bảo quản. Tuy nhiên, nếu hàm lượng đường quá nhiều sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic do áp suất thẩm thấu tác động vào thành tế bào vi khuẩn.
Đường giúp tạo vị cho sản phẩm, duy trì sự sống và điều hoà các quá trình chuyển hoá trong tế bào vi khuẩn. Nguồn đường quan trọng cung cấp cho vi khuẩn là lactose, hầu hết các vi khuẩn lên men lactic đều có enzyme lactase để thuỷ phân lactose thành glucose và galatose. Đường được bổ sung vào quá trình lên men dưới dạng đường thực phẩm glucose hay saccharose, mật ong, sữa cô đặc, syrup,..
Ảnh hưởng của sự hiện diện oxy
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hô hấp yếm khí, chỉ hoạt động tốt trong môi trường không có oxy hoặc có thể một ít oxy. Nếu môi trường có nhiều oxy thì vi khuẩn lactic sẽ bị giảm hoạt động, đồng thời tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật khác gây hư hỏng sản phẩm như: vi khuẩn acetic, nấm men, nấm mốc,.. [1].
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men
Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến cường độ phát triển mà còn ảnh hưởng đến khả năng phát triển của vi khuẩn lên men lactic. Nhiệt độ có thể kìm hãm sự phát triển các vi sinh vật có lợi trong lên men hoặc tiêu diệt, tạo điều kiện cho vi sinh vật có hại làm hư hỏng sản phẩm. Nhiệt độ quá cao hay quá thấp sẽ ức chế quá trình lên men của vi khuẩn lactic. Ngoài ra, lượng acid lactic sinh ra cũng thay đổi tuỳ theo nhiệt độ lên men.
Điều chỉnh nhiệt độ lên men thích hợp sẽ giúp rút ngắn thời gian lên men, hạn chế sự nhiễm của vi sinh vật lạ đồng thời tạo ra sản phẩm có chất lượng tốt.
Ảnh hưởng của các chất khoáng
Nhu cầu muối khoáng và các nguyên tố vi không lớn cho quá trình lên men lactic, do đó không cần bổ sung thêm từ ngoài vào mà chỉ cần sử dụng những chất có sẵn trong nguyên liệu sữa. Tuy nhiên, nồng độ muối NaCl trong môi trường lên
men không được quá 6% vì sẽ tiêu diệt vi khuẩn lactic, ức chế quá trình lên men diễn ra.