1.4.2. Ứng dụng chị thị phân tử trong nghiên cứu về tính trạng chất lƣợng
1.4.2.4. Bản đồ di truyền tính trạng mùi thơm
Năm 1992, Ahn đã tiến hành sử dụng chỉ thị SSR -PCR để tiến hành nghiên cứu về gen điều khiển mùi thơm trên hai giống lúa Della và Basmati 370. Kết quả tác giả đã xác định đƣợc chỉ thị RG28 liên kết với gen fgr nằm trên nhiễm sắc thể số 8 điều khiển tính trạng mùi thơm của hai giống lúa Della và Basmati 370 (Ahn và cs., 1992).
Thông qua sử dụng chỉ thị RFLP để nghiên cứu tính đa hình của các quần thể dòng đẳng gen (NILs-population), là các dòng tạo đƣợc do hồi giao giữa con lai với một trong hai bố mẹ của nó, nên nó chỉ khác nhau ở vài đoạn mã di truyền của bố mẹ do gen (Singh và cs., 2000). Phân tích bản đồ liên kết thông qua sử dụng chỉ thị RFLP cho thấy có sự liên kết rất chặt giữa đơn gen lặn fgr với chỉ thị RG28 trên nhiễm sắc thể số 8 (Chr. 8) với khoảng cách di truyền là 4,5 cM.
Ngày nay, các chỉ thị phân tử đƣợc coi là công cụ quan trọng để xác định từ sự đa dạng hóa đến phân lập gen trong chọn giống cây trồng. Theo Lorieux (1995) có 4 loại chỉ thị phân tử cho gen điều khiển mùi thơm, kết quả xác định có nhiều chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 8 liên kết rất chặt với gen điều khiển sự
hiện diện của AP (2-acetyl-1-pyrroline)-hợp chất chính tạo mùi thơm ở lúa thông qua một gen chính và hai loci tính trạng số lƣợng điều khiển tính trạng mùi thơm cây lúa . Gen chính điều khiển mùi thơm đƣợc định vị và liên kết với hai chỉ thị biên RG1 và RG28 ở khoảng cách <5 cM. Hai loci điều khiển tính trạng số lƣợng có tác động đén mức độ thơm của các giống lúa. Kết quả còn chứng minh rằng nồng độ AP trong cây xảy ra ít nhất ở 2 vùng nhiễm sắc thể khi đánh giá đoạn tái tổ hợp trên nhiễm sắc thể số 8 ( Lorieux và cs., 1995).
Jin (1996) dùng 300 chỉ thị RAPD để tiến hành đánh giá đa hình tính trạng mùi thơm của con lai từ giống bố/mẹ Khao Dawk Mali 105 (thơm) và CT9993 (không thơm). Số chỉ thị RAPD cho đa hình giữa 2 giống Khao Dawk Mali 105 và CT9993 đạt 64,1%. Bên cạnh đó, tác giả cũng đã xác định đƣợc chỉ thị Jas 1.5 chỉ cho xuất hiện băng ở vị trí 1,5 kb trên các cá thể lúa thơm. Dự a vào sự hiện diện tính trội của alen không thơm để loại trừ các cá thể không có mùi thơm tác giả đã kết luận chỉ thị Jas 1.5 liên kết chặt với gen (fgr) quy định tính trạng hương thơm nằm trên nhiễm sắc thể số 8 với khoảng cách di truyền là 3,9 cM. Nó không những rất hữu dụng cho việc xác định gen thơm mà còn phát hiện ra khối liên kết tại vị trí chuyển dần các gen thơm thông qua backcross (Jin và cs., 1996).
Yoshihashi (2000) đã thành công khi dùng chỉ thị SSR với mồi RM17 để xá định giống gạo thơm Khao Dawk Mali 105 với các giống khác cũng mang cùng tên thị trường thông qua ADN được li trích từ hạt gạo xay chà.
Bergman (2002) phân tích trên quần thể con lai từ ba tổ hợp lai giống lúa giống thơm và không thơm của mỹ cho kết quả xác định đƣợc 9 chỉ thị SSR liên kết locus RG28. Trong đó chỉ thị RM223 liên kết với locus RG28 tại vị trí của gen fgr với khoảng cách liên kết là < 5cM (Bergman và cs., 2002).
Khi tiến hành nghiên cứu ứng dụng SSR đánh dấu, Nguyễn Thị Lang (2002) đã tiến hành lập bản đồ tính trạng mùi thơm trên nhiễm sắc thể số 8 và kết luận RM223 liên kết chặt với gen mùi thơm frg với khoảng cách di truyền là 1,6 cM. Tác giả còn chuyển đổi RFLP thành STS để đánh giá mùi thơm thông qua chỉ thị phân tử RG28 trên quần thể F2 Khao Dawk Mali
105/ OM1490 cho đa hình giữa hai nhóm thơm và không thơm; bản đồ liên kết gen mùi thơm đƣợc thiết lập cho khoảng cách di truyền RG28 với gen fgr là 1,8cM.
Neelu Jain và cs., (2003) sử dụng 15 chỉ thị SSR đã đƣợc sắp xếp trên nhiễm sắc thể số 8 (Garland và cs., 2000) để phân tích sự đa dạng về chất lƣợng gạo của 12 giống lúa Basmati trên thị trường. Tác giả đã kết luận có 3 alen được xác định tại vị trí SCUrice-SSR1 với các chỉ thị RM342, RM42, RM195, RM223, RM284 nằm trong vùng RG1-RG28 đều cho đa hình cao giữa các giống Basmati thơm và không thơm.
Sự kết hợp giữa các phương pháp truyền thống và công nghệ ADN đã hình thành hướng chọn tạo giống mới là chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker Assitsed Selection- MAS) thông qua việc ứng dụng các kết quả về lập bản đồ gen và QTLs qui định các tính về năng suất, chất lƣợng, kháng và chống với các điều kiện bất lợi và sâu bệnh hại.
1.5. MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HÀM LƢỢNG PROTEIN Ở LÚA
Viện Cây lương thực và cây thực phẩm (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) nghiên cứu thành công giống lúa mới P6 và P290 trên cơ sở phát triển giống P4.
Viện sĩ Vũ Tuyên Hoàng với lời nhắn nhủ: “Sau P4 sẽ là P6, vừa ngon mắt, vừa ngon miệng dành cho bà con ta…”
Thạc sĩ Nguyễn Trọng Khanh cho biết, lúa P6 có nhiều ƣu điểm nổi bật so với các giống lúa khác. Đầu tiên là hàm lƣợng đạm của P6 đạt 10,5% dẫn đến năng suất
Prôtêin cao. Nếu tính năng suất lúa là 6 tấn/ha thì các giống khác chỉ đạt 400-420 kg prôtêin/ha trong khi giống P6 đạt 550-600 kg prôtêin/ha. Theo thông lệ trên thế giới nếu gạo có lƣợng đạm cao thì năng suất thấp, nhƣng P6 có năng suất cao (5,5 tấn/ha) đồng thời với chất lượng cao. Thóc thường trên thị trường có giá 5.500-6.000 đồng/kg nhưng thóc của lúa P6 có giá 7.000 đồng/kg. Nổi bật nhất là khả năng chịu rét, hiện P6 là giống lúa chịu rét tốt nhất trên miền Bắc. Giống lúa mới có chất lƣợng gạo cao: gạo trong, không bạc bụng, hạt thon dài, cơm mềm với hàm lƣợng amylose trung bình.
Theo các nhà khoa học, thức ăn động vật có lƣợng đạm rất cao, nhƣng đạm động vật thường gây ra bệnh tim mạch và nhiều bệnh tật nguy hiểm khác, trong khi đạm thực vật rất an toàn cho người. Chính vì thế, gạo từ lúa P4, P6, P290 sẽ là nguồn cung cấp đạm cho nông dân giá rẻ, an toàn, dễ kiếm, là thực phẩm hữu ích trong thời kì phát triển mới của đất nước. (Theo Báo Người Cao Tuổi)
Phát hiện các gen điều chỉnh Glutelin ở lúa: GS. WAN Jianmin và các đồng nghiệp tại trường Đại học Nông nghiệp Nanjing (Trung Quốc) vừa công bố những khám phá mới của họ về quá trình xử lý glutelin trong gạo trên Tạp chí Plant Journal số ra mới đây với tựa đề "Enzym OsVPE1 xử lý không bào là cần thiết cho xử lý glutelin". Theo cách phân loại protein dự trữ thì protein dự trữ trong nội nhũ hạt lúa bao gồm 4 loại protein: Albumin, Globulin, Glutelin, và Prolamin. Protein dự trữ ở hai thể protein (protein body, đƣợc viết tắt là PB) bao gồm PBI và PBII. PBI hay prolamin tan trong cồn, kích thước nhỏ (1-2 nm), hình cầu và cấu trúc đồng tâm trong khi PBII hay glutelin không hòa tan đƣợc trong dung dịch muối hoặc cồn nhƣng hòa tan đƣợc trong dung dịch 0.1M acid hoặc kiềm, kích thước lớn hơn (2-3 nm). Nghiên cứu quy luật di truyền của các tiểu đơn vị glutelin là vấn đề cần thiết trong công tác chọn giống lúa có chất lƣợng dinh dƣỡng cao.
Nghiên cứu, đã phân tích sinh sản vô tính và các chức năng của một OsVPE1, chuỗi Nucleotide biến thể của glutelin ở loại lúa mới. Nghiên cứu cũng tiết lộ một biến thể có thể làm thay đổi Cys269 thành Gly. Những phân tích di truyền cũng cho thấy rằng phenotip W379 đƣợc kiểm soát bởi một gen hạt nhân lặn đơn. Những thí nghiệm cho thấy rằng hoạt động phân chia ASN (trong chuỗi HIS, LYS, ASN, LEU) đặc trƣng của vật đột biến không lớn hơn 10% so với điều tương tự ở giống lúa Nipponbare.
Giống lúa Nipponbare có khả tạo ra các protein bình thường, trong khi
OsVPE1 lại không nhƣ vậy, có vẻ nhƣ có sự phân chia không hợp lý ở OsVPE1 và điều này do hoạt động enzym của OsVPE1 ở vật đột biến gần nhƣ bị loại bỏ.
Nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin(Proteomics).Các prôtêin mang rất nhiều trọng trách trong tế bào. Một bộ prôtêin hoàn chỉnh gọi là proteome, phụ trách nghiên cứu cấu trúc prôtêin, chức năng hoặc bất cứ hoạt động nào của prôtêin trong tế bào gọi là proteomics.Gen sao bản kích hoạt rất năng nổ, thay đổi liên tục với mỗi kích thích của môi trường. Mục tiêu của nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin là để tìm hiểu cơ chế cho phép cấu trúc và chức năng của prôtêin thực hiện nhiệm vụ của mình, nó tương tác với cái gì, và làm thế nào góp phần vào chu kỳ sống.Một ứng dụng của khoa học nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin đƣợc biết tới là bản chụp nghiêng biểu hiện prôtêin, nơi prôtêin được nhận diện trong cơ thể sinh vật dưới kích thích của môi trường. Khoa học nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin còn để phát triển một biểu đồ mạng prôtêin nơi mỗi tương tác của prôtêin được xác định cho một hệ sống nhất định.Khoa học nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin cũng đƣợc ứng dụng để vẽ sơ đồ biến đổi prôtêin nhận biết sự khác biệt giữa cơ thể sinh vật hoang dã và cơ thể sinh vật biến đổi gen. Ngành khoa học này cũng được ứng dụng nghiên cứu tương tác giữa prôtêin và prôtêin trong mỗi phản ứng bảo vệ của thực vật.Vi dụ, nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin tại đại học Iowa kết luận:
•Một thí nghiệm về thay đổi prôtêin trong bản sao gen kích hoạt của ngô dưới nhiệt độ thấp là tác động chính giúp ngô con nảy mầm.
• Phân tích những khác biệt xảy ra trong thể hiện hệ gen đậu nành trồng ở nhiệt độ cao.
•Nhận biết thể hiện prôtêin phản ứng trước các loại bệnh như giun tròn nang ở cây đậu nành.
Khoa học nghiên cứu hóa chỉ tế bào(Metabolomics):Nghiên cứu hóa chỉ tế bào là ngành khoa học “omics” mới nhất. Hóa chỉ tế bào là một bộ hoàn chỉnh các tổ hợp trọng lƣợng phân tử thấp trong một mẫu. Các tổ hợp phân tử là các chất nền hoặc sản phẩm phụ của các phản ứng enzim, trực tiếp tác dụng lên kiểu hình của tế bào. Vì thế, mục đích của nghiên cứu hóa chỉ tế bào là xác định các mẫu sao chụp của các tổ hợp này tại một thời điểm xác định dưới tác động của các điều kiện môi trường nhất định.
Nghiên cứu gen và chức năng gen, nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin giúp mở rộng thông tin về kiểu di truyền nhƣng vẫn bị hạn chế thông tin về kiểu hình. Các tổ
hợp trọng lƣợng phân tử thấp các là các liên kết gần nhất đến kiểu hình.Nghiên cứu hóa chỉ tế bào đƣợc ứng dụng để xác định sự khác nhau trong hàm lƣợng hàng nghìn phân tử giữa một cơ thể thực vật khỏe và một cơ thể có bệnh .Công nghệ này đồng thời cũng được sử dụng để xác định khác biệt dinh dưỡng giữa cây trồng bình thường và cây trồng biến đổi gen, và khác biệt trong khi nhận biết chất chuyển hóa bảo vệ thực vật.
Tại Hội nghị quốc gia về chọn tạo giống lúa tại Viện Lúa Đồng Bằng sông Cửu long - tháng 7/2004, một số kết quả nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật điện di Protein SDS-Page trong việc chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao đã đƣợc trình bày:Kỹ thuật điện di là một công cụ phân tích cho phép đánh giá gián tiếp dò tìm bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích tính biến dị cấu trúc của các enzym và protein. Kết quả so sánh với phương pháp phân tích điện di bằng kỹ thuật điện di isoenzyme cho thấy kỹ thuật điện di protein phát hiện đƣợc mức độ đa dạng của protein gấp nhiều lần hơn. Hơn nữa, kỹ thuật điện di protein xác định nhanh, tương đối rẻ tiền, không cần phải trồng cây chờ đến thời điểm thu hoạch và không bị ảnh hưởng do môi trường. Các nhà chọn giống sử dụng kỹ thuật điện di trên hạt giống với mục đích nhƣ sau:Phân tích các protein tinh khiết. Đánh giá đƣợc nồng độ protein.Phát hiện đƣợc quá trình phân giải protein.Xác định đƣợc các protein miễn nhiễm trầm tủa.Kiểm tra sự hiệu chỉnh protein. Phân lập và xác định nồng độ các kháng nguyên do protein để sản xuất kháng thể. Phân lập protein đánh dấu bằng bức xạ.
Ứng dụng phương pháp điện di protein, các nhà khoa học Viện Lúa ĐBSCL từ tháng 10/2000 đã tuyển chọn dòng thuần của giống lúa Nếp bè Tiền giang đang đƣợc trồng trong sản xuất. Từ 5 hạt ưu tú được chọn ra, tiến hành nhân lên trong nhà lưới và đến khi thu hoạch tiếp tục đƣợc kiểm tra lại độ thuần, hàm lƣợng protein và hàm lƣợng amylose.
Từ đó đã chọn ra đƣợc dòng Nếp Bè 1-2 có chiều dài hạt dài hơn giống đối chứng, năng suất cao hơn 15% và hàm lƣợng protein trên 10%. Kết quả này cho thấy, kỹ thuật điện di protein sẽ giúp cho nhà chọn giống chọn ra đƣợc giống lúa Nếp thuần thep yêu cầu chất lƣợng hàng hoá, giảm quy mô trồng ngoài đồng để tuyển chọn và thời gian tuyển chọn.
Hướng ứng dụng này có thể tiếp tục áp dụng cho các giống lúa nếp khác đang trồng ở vùng Đồng bằng sông Cửu long nhƣ Nếp Móng chim, Nếp Mù
u, Nếp Sáp… Việc chọn lọc dòng thuần đối với giống lúa thơm VD 20 ( Việt Đài 20 ) du nhập vào Việt Nam năm 1996 cũng đã đƣợc tiến hành. Từ 4 dòng thuần chọn lọc ra, đã tuyển chọn ra dòng C3 có đặc tính là năng suất cao, đạt 7,1 tấn/ha vụ Đông Xuân, có cơm ngon, mềm và thơm hơn đối chứng.
Trong một nghiên cứu đƣợc công bố trên Kỷ yếu của Viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia, Hoa Kỳ, các nhà nghiên cứu mô tả các hạt gạo có thể sản xuất số lƣợng lớn một protein máu gọi là albumin huyết thanh, hoặc HSA1. Ở Trung Quốc, ý tưởng sử dụng lúa, một cây trồng phong phú, để bổ sung hoặc thậm chí thay thế các nguồn cung cấp albumin hiện tại nhằm đáp ứng nhu cầu về HSA và làm giảm nguy cơ lây lan virus trong huyết tương tiềm ẩn đã được Daichang Yang, nhà công nghệ sinh học thực vật tại Đại học Vũ Hán, Trung Quốc và các đồng nghiệp thực hiện bằng cách chèn gene mã hóa HSA vào các cây lúa. Gene này đƣợc kích hoạt trong quá trình tạo hạt và protein tạo ra được lưu trữ trong hạt gạo cùng với các chất dinh dưỡng khác. Kết quả cho thấy HSA chiếm hơn 10% protein hòa tan tổng số của hạt gạo, một trong những sản lƣợng cao nhất của protein tái tổ hợp từ cây trồng tính đến thời điểm hiện nay.Các kết quả phân tích cho thấy protein có nguồn gốc từ gạo có các đặc điểm hóa học và vật lý và biểu hiện chức năng tương đương với protein huyết tương máu người trong các thử nghiệm y tế và phản ứng miễn dịch.