CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.4. Phương pháp thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành một đợt với 80 quả trứng vịt mới đẻ trong buổi sáng, cân toàn bộ số trứng. Sau đó 5 quả sẽ được đem đi xác định chất lượng ban đầu (cân khối lượng, đo chiều cao lòng trắng trứng, kiểm tra hàm lượng lipid, albumin và globulin), 75 quả còn lại được chia làm các nhóm như sau:
- Nhóm đối chứng (ĐC): 25 quả trứng không qua xử lý vỏ, không bọc màng.
- Nhóm thí nghiệm 1 (TN1): 25 quả trứng qua xử lý vỏ, bọc màng chitosan 1,5%.
- Nhóm thí nghiệm 2 (TN2): 25 quả trứng qua xử lý vỏ, bọc màng chitosan 1,5% có bổ sung 0,05% sodium benzoate.
Khảo sát chất lượng trứng ở những thời điểm 5, 10, 15, 20, 25 ngày sau khi đẻ, ở mỗi thời điểm kiểm tra tiến hành kiểm tra 5 trứng cho mỗi mẫu, sau đó lấy kết quả trung bình. Trứng được bảo quản ở nhiệt độ thường.
2.4.1 Xử lý vỏ trứng
Trứng được lau bằng vải mềm nhúng nước ấm 32-340C, ngâm trong dung dịch H2O2 0,5% trong 3 phút rồi rửa nhanh lại bằng nước ấm và hong khô.
2.4.2 Tạo màng bọc
- Cân 4,5 g chitosan hoà tan trong 300 ml dung dịch acid acetic 1% để tạo thành dung dịch nồng độ nồng độ 1,5%.
- Chia đều dung dịch làm 2 phần: một phần (150 ml) có bổ sung 0,075 g sodium benzoate, phần còn lại không bổ sung.
- Tạo màng bọc: nhúng trứng vào dung dịch chitosan để khô tự nhiên và tiến hành 3 lần lặp lại.
- Trứng được đặt trên các khay chứa trứng và để nơi khô thoáng, tiến hành bảo quản ở nhiệt độ thường.
3.4.3. Định lượng hàm lượng protein tổng số, albumin, globulin trong lòng trắng trứng bằng phương pháp sử dụng thuốc thử Biure
Nguyên tắc: Protein của lòng trắng trứng sẽ phản ứng với thuốc thử biure cho màu tím. Cường độ màu tương ứng với nồng độ của dung dịch chuẩn. Khi sử dụng dung dịch Na2SO4 bão hoà sẽ kết tủa globulin. Vì vậy, nồng độ globulin là hiệu số giữa hàm lượng protein tổng số và albumin (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Thuốc thử biure phản ứng với liên kết peptide (-CO-NH-) trong chuỗi polypeptide.
Hoá chất
- Dung dịch NaCl 0,9%
- Dung dịch Na2SO4 bão hoà. Thuốc thử được giữ trong bóng tối.
- Dung dịch biure: cân 1,5 g CuSO4.5H2O và 6 g muối seignet (potassium sodium tartrate) cho vào bình định mức 1000 ml, cho thêm 300 ml dung dịch NaOH 30%, 2 g KI và cho thêm nước cất đến vạch 1000 ml. Dung dịch được giữ trong lọ sẫm màu, đậy bằng nút cao su.
Dụng cụ
Piette 2 ml Pipette 10 ml Ống nghiệm Phễu lọc
Bình định mức 50 ml Máy so màu
Tủ ấm
Tiến hành thí nghiệm
- Lòng trắng trứng đựơc đồng hoá, sau đó hút 2 ml và tiến hành pha loãng 10 lần.
- Lấy 2 ml vào ống nghiệm đánh dấu là T (protein tổng số).
- Cho vào ống nghiệm 5 ml lòng trắng trứng đã pha loãng và 5 ml dung dịch Na2SO4 bão hoà, lắc đều, đặt vào tủ ấm 370C trong 30 phút. Lắc đều, lọc qua phễu lọc, sau đó lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm ghi chữ A (Abumin). Ống thứ 3 ghi chữ K (ống kiểm tra) cho 2 ml dung dịch NaCl 0,9% kiểm tra.
- Thêm 8 ml dung dịch biure vào cả 3 ống nghiệm, lắc đều, sau 30 phút đem đo OD bước sóng 540 nm.
- Hàm lượng protein nghiên cứu được xác định so với đường chuẩn.
Lập đường chuẩn protein: sử dụng albumin tinh khiết Chuẩn bị các ống nghiệm sau
Số mẫu Dd albumin chuẩn (ml)
Dd NaCl 0,9% (ml)
Nồng độ protein (mg/ml)
Độ hấp thu OD
1 0,4 0,6 40 0,115
2 0,6 0,4 60 0,157
3 0,8 0,2 80 0,19
4 1,0 0 100 0,22
Đối chứng 0 0,1 0 0,04733
Chuyển 0,1 ml dung dịch của mỗi ống trong 4 ống nghiệm trên có chứa dung dịch albumin chuẩn vào 4 ống nghiệm sạch khác và thêm vào 5 ml thuốc thử biure. Lắc trộn đều. Để yên 30 phút cho phản ứng màu xảy ra.
Đo độ hấp thu OD 540 – 560 nm của mỗi ống.
Ống đối chứng: 0,1 ml NaCl 0,9%, 5 ml dung dịch biure.
Vậy ta có đường chuẩn tỉ lệ giữa nồng độ protein và OD là:
Nồng độ protein (mg/ml) OD
40 0,067
60 0,109
80 0,142
100 0,172
Đường chuẩn tỉ lệ giữa nồng độ protein và độ hấp thu OD
y = 568.59x R2 = 0.9938
0 20 40 60 80 100 120
0 0.05 0.1 0.15 0.2
OD Nồng độ
protein (mg/ml)
Đồ thị 3.1. Đường chuẩn protein
3.4.4. Định lượng hàm lượng lipid trong lòng đỏ trứng bằng phương pháp Adam – Rose – Gottieb
Nguyên lý: Ở môi trường amoniac và cồn, chiết xuất lipid bằng ether và ether dầu hoả. Để bay hơi hết ether và ether dầu hoả, cân lipid và từ đó tính ra hàm lượng trong 100g thực phẩm (Bùi Thị Thu Nhuận, 1991).
- Amoniac có nhiệm vụ hoà tan protein, làm thay đổi sức căng mặt ngoài của các chất béo, làm thay đổi sức căng mặt ngoài của các chất béo, cắt dây nối giữa chất béo và đạm để lipid hoà tan dễ dàng hơn.
- Cồn có tính chất hút nước làm cho lipid hoà tan trong ether, tham gia vào việc cắt dây nối giữa béo và đạm và sau cùng làm ether hoà hợp trong dung dịch mẫu hơn.
Ether còn gọi là ether thường hay ether sulfuric, có tính chất hoà tan lipid nhưng cũng hoà tan các chất khác như nước và các chất hoà tan trong nước như: lactose, muối khoáng. Do đó, người ta dùng thêm ether dầu hoả.
- Ether dầu hoả ít hút nước hơn ether thường, có tính chất đẩy nước và các chất hoà tan trong nước ra khỏi ether thường, làm cho ether thường chỉ chứa chất béo và ether dầu hoả. Người ta cũng không thể dùng ether dầu hoả thay cho ether thường được vì ether dầu hoả không hoà tan các chất béo có chứa nước.
Hoá chất
Ether thường Ether dầu hoả Phenolphtalein 1%
Dung dịch cồn – amoniac: Cồn 900C 208,5 ml NH4OH 7,5 ml Nước cất vừa đủ 250 ml
Dụng cụ
Pipette
Bình lắng gạn Chén thuỷ tinh Bình hút ẩm Cân phân tích Tủ sấy
Tiến hành thí nghiệm
Trứng sau khi đã tách lấy lòng trắng, dùng pipette lấy 1 ml lòng đỏ, sau đó tiến hành pha loãng 10 lần với 9 ml nước cất.
Cho vào bình lắng gạn: Mẫu (đã pha loãng) 10 ml Dung dịch cồn – amoniac 10 ml
Ether 11 ml
1 giọt phenolphtalein
Lúc đầu lắc nhẹ, sau lắc mạnh dần và cuối cùng lắc mạnh. Để yên trong 30 phút, trong bình sẽ chia ra làm hai lớp:
- Lớp dưới là lớp amoniac hoà tan protein và các thành phần khác của thực phẩm.
- Lớp trên là ether hoà tan chất béo và có lẫn một số chất.
Tách lấy lớp ether, bỏ lớp dung dịch amoniac. Thêm vào lớp ether 10 ml ether dầu hoả, lắc thật mạnh, rồi để yên 15 phút, các chất không phải là chất béo sẽ tách ra và lắng xuống dưới đáy bình lắng gạn, được dồn vào lớp dung dịch amoniac.
Chuyển hết phần ether vào chén thuỷ tinh đã sấy khô, cân sẵn theo nguyên tắc cân kép. Rữa bình lắng gạn hai lần, mỗi lần với 5 ml ether ở nhiệt độ thường, sau đó cho vào tủ sấy 1050C trong 30 phút. Lấy ra để vào bình hút ẩm cho đến nguội và cân.
Tính kết quả
M = m2 – m1 Trong đó: m1: khối lượng chén không (g).
m2: khối lượng của chén và mẫu chiết (g).
M: hàm lượng lipid chiết được (g).
3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu, tính toán, đồ thị đều được thực hiện trên phần mềm Excel.