PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VACXIN
2. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ DNA tái tổ hợp
2.2. Biểu hiện scFV trên bề mặt bacteriophage
Các thư viện của phage trong E. coli TG1 được sinh trưởng trong môi trường chứa glucose và helper phage (ví dụ M13KO7) đƣợc bổ sung để gây nhiễm lần thứ hai (superinfect) các vi khuẩn.
Các tế bào bị gây nhiễm lần hai sau đó đƣợc ly tâm nhanh và cho sinh trưởng qua đêm trên môi trường không có glucose nhưng có bổ sung ampicillin và kanamycin, trước tiên cảm ứng gây đóng gói phagemid biểu hiện scFV phối hợp với protein của gen III và sau đó tạo thành phage.
Các vi khuẩn nguyên vẹn đƣợc tạo tiểu thể bằng ly tâm và phage được kết tủa từ các thể nổi với PEG. Các bước này cho phép tinh sạch và cô đặc phage thành stock để dùng trong chọn lọc theo vòng tròn trên kháng nguyên
3. Kháng thể đơn dòng trong nghiên cứu Sinh-Y
- Các kháng thể đơn dòng dựa theo các chỉ thị tế bào chất và bề mặt tế bào có một ảnh hưởng không chỉ trong nghiên cứu cơ bản mà còn cho phép phát triển các phương thức trong điều trị;
+ Sự biểu hiện dư thừa của thụ thể đối với nhân tố sinh trưởng biểu mô (EGFR - Epidermal Growth Factor Receptor ) và các thụ thể liên quan, một sản phẩm của proto-oncogene c-erbB-1, đƣợc tìm thấy là chỉ thị của sự tiên lƣợng nghèo nàn trong các bệnh nhân mang ung thƣ biểu mô tế bào vảy hoặc u tuyến.
Cơ chế kháng EGFR của kháng thể đơn dòng
(A) Các kháng thể đơn dòng liên kết chặt chẽ với EGFR, khiến yếu tố tăng trưởng không liên kết được với thụ thể, từ đó ức chế các con đường tín hiệu phụ thuộc EGFR;
(B) Tuy nhiên trong trường hợp KRAS bị đột biến, nó có khả năng tự phát ra tín hiệu nội bào để kích hoạt trở lại các con đường tín hiệu mà không phụ thuộc tín hiệu từ EGFR.
Con đường tín hiệu MAPK và cơ chế tác động của thuốc kháng EGFR
(A): Ở tế bào bình thường, tín hiệu bắt đầu từ thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) bằng cách phối tử (hình tam giác) gắn với EGFR và làm thụ thể này chuyển sang dạng hoạt động. Từ đó kích hoạt các protein trung gian truyền tín hiệu bao gồm RAS, RAF và 13 MEK. Con đường này dẫn đến tăng sinh tế bào, sống sót tế bào, tăng sinh mạch, xâm lấn và di căn;
(B): Kháng thể đơn dòng kháng domain ngoại bào của EGFR (thuốc kháng EGFR: cetuximab và panitumumab) ngăn chặn sự kết hợp phối tử với thụ thể, từ đó chặn sự kích hoạt con đường MAPK;
(C): Trong tế bào ung thƣ, đột biến gen KRAS và BRAF dẫn đến thay đổi cấu trúc các protein này làm nó luôn luôn trong trạng thái kích hoạt. Do RAS và RAF là các protein nằm phía hạ nguồn của EGFR nên tín hiệu vẫn luôn đƣợc kích hoạt cho dù bị chặn bằng thuốc kháng EGFR.
- Phân tích miễn dịch bằng phương pháp RIA và ELISA: dựa trên nguyên tắc dùng kháng thể đơn dòng để phát hiện kháng nguyên tương ứng của nó trong các mẫu phân tích nhờ phản ứng gắn rất đặc hiệu của kháng thể đơn dòng với kháng nguyên
+ Phương pháp ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assays):
Sƣ̣ kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
ELISA là phương pháp miễn dịch hấp phụ sử dụng enzyme liên kết dùng để phát hiện những hợp chất mong muốn (kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm), dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên (Antigen) và kháng thể (Antibody), trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thuỷ phân cơ chất thành một chất có màu. Thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
- Ức chế thải loại khi ghép cơ quan bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng chống kháng nguyên đặc hiệu của tế bào lympho T, nhằm loại bỏ phản ứng thải loại khi ghép các cơ quan của người với nhau.
- Chẩn đoán hình thành khối u, khi có sự hình thành khối u trong máu sẽ xuất hiện một số tác nhân đánh dấu. Do đó, có thể sử dụng các phương pháp phân tích miễn dịch để phát hiện các tác nhân trên trong máu hoặc trên khối u.
- Định hướng thuốc chữa bệnh, lợi dụng khả năng các phân tử kháng thể gắn rất đặc hiệu với tế bào ở vị trí xác định nào đó của cơ thể (trong đó có tế bào ung thư) để định hướng thuốc chữa bệnh hoặc độc chất tới trực tiếp khối u hoặc nơi cần chữa trị nhƣ vậy sẽ tăng hiệu quả chữa trị lên nhiều lần.