Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về vòng đời của vi tảo H.pluvialis đã chỉ ra rằng sinh trưởng của loài tảo này trải qua 4 giai đoạn với hình thái, kích thước TB, hàm lượng sắc tố và protein
nội bào khác nhau.
• Giai đoạn tế bào sinh dưỡng: TB hình elip, chuyển động bằng 2 roi, phân chia TB để gia tăng số lượng. Hàm lượng carotenoid trong TB thấp.
• Giai đoạn tạo bào nang: Các tế bào sinh dưỡng chuyển sang dạng màu nâu, hình khối cầu, mất roi. Mức độ sinh tổng hợp carotenoid và protein tăng lên.
• Giai đoạn TB nang hoàn chỉnh: Lúc này tế bào bất động, tích lũy hàm lượng carotenoid cao nhất.
• Giai đoạn nảy mầm: Xảy ra sự tổng hợp chlorophyll và protein, xuất hiện sự phân giải carotenoid.
IV) Tổng quan về Astaxanthin
Astaxanthin là một oxycarotenoid, có công thức phân tử C40H52O4, khối lượng phân tử M = 595, điểm nóng chảy xấp xỉ 224˚C, một chất thuộc nhóm carotenoid.
- Astaxanthin được tìm thấy trong nhiều loại hải sản như cá hồi, cá vền, tôm, cua, trứng cá, đôi khi nó cũng được phát hiện ở một số loài chim.
- Ngoài tự nhiên, astaxanthin tồn tại ở dạng liên kết với protein tạo phức chất màu xanh đen. Khi gia nhiệt hay bị oxy hoá, liên kết bị cắt đứt, giải phóng
astaxanthin tự do có màu đỏ cam.
- Ở H. pluvialis, astaxanthin được tổng hợp ở giai đoạn tạo bào nang và là loại sắc tố rất đặc trưng, có giá trị kinh tế cao.
- Astaxanthin có vai trò là một chất chống oxi hóa với hoạt tính cao hơn các carotenoid khác nhiều lần nên được gọi là một “siêu Vitamin E”.
- Astaxanthin là một chất chống oxy hóa hòa tan trong chất béo nên nó có khả năng đi qua màng để đến mắt, não và hệ thần kinh trung ương.
- Nó còn có vai trò thúc đẩy sự thành thục, tăng tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ sống sót của trứng và cải thiện sự phát triển của phôi.
V) Nguồn cung cấp
- Nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học: Đây là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồng thủy hải sản, tuy nhiên nguồn astaxanthin này có giá thành rất cao, không tinh khiết và tiềm ẩn nhiều sản phẩm phụ có nguy cơ gây hại.
- Các nguồn astaxanthin trong tự nhiên: Được tìm thấy trong nhiều đối tượng như giáp xác thủy sản, một số chủng nấm mem; vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên hàm lượng astaxanthin tích lũy được lại quá ít, quá trình sinh trưởng và phát triển diễn ra chậm không phù hợp để sản xuất trên qui mô công nghiệp.
Hiện nay nguồn cung cấp astaxanthin có triển vọng nhất là từ tảo lục
Haematococcus pluvialis, chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn astaxanthin (7.000 – 55.000 àg/g tế bào, tương ứng 0,7 – 5,5 % TLK).
- Trong nuôi trồng thủy sản Haematococcus pluvialis được đánh giá là nguồn cung cấp astaxanthin phù hợp, có giá thành thấp mà lại tích lũy được một lượng lớn astaxanthin nên được dùng làm nguồn thức ăn bổ sung rất tốt.
- Để sinh khối tảo nuôi trồng có hàm lượng astaxanthin cao, Haematococcus pluvialis cần phải được nuôi cấy theo 2 pha liên tục:
+ Giai đoạn tăng sinh khối: Bắt đầu từ khi nuôi tảo trong nhà từ khuẩn lạc rồi tiếp tục nuôi ngoài trời trong các photobioreactor sử dụng năng lượng ánh sang mặt trời. Đây là giai đoạn để tảo sinh trưởng và phát triển nhằm tang sinh khối tối đa.
+ Giai đoạn kích thích sinh tổng hợp astaxanthin: Thay đổi môi trường theo hướng bất lợi, chủ yếu là chiếu sáng với cường độ cao và thay đổi môi trường sinh trưởng. Lúc này Haematococcus pluvialis bắt đầu hình thành nang bào, tổng hợp và tích lũy dần astaxanthin dưới dạng ester hóa. Sau giai đoạn này hàm lượng astaxanthin trong tế bào tảo có thể đạt 4-6 % TLK.
VI) MÔ TẢ THÍ NGHIỆM VÒNG ĐỜI H. PLUVIALIS:
- Thí nghiệm được tiến hành ở 2 môi trường C và RM cấp độ bình tam giác 250 ml.
- Chủng tảo Haematococcus pluvialis được nuôi trong môi trường khoảng 2-3 ngày. Thu dịch rồi ly tâm ở 6000 vòng/5 phút. Loại bỏ dịch trên, thu cặn TB rồi bổ sung môi trường mới. Lắc đều rồi chia dịch tảo vào 2 bình tam giác 250 ml chứa 150 ml dịch tảo/ bình.
- Mật độ ban đầu trong các công thức thí nghiệm là 6x104 TB/ml.
- Các bình tam giác được nuôi đến khi màu sắc dịch tảo chuyển từ màu xanh sang màu đỏ đậm. Khi đó lượng dịch này được ly tâm ở 6000 vòng/5 phút và chuyển sang môi trường mới để nảy mầm trở lại.
- Các bình tam giác được nuôi quang tự dưỡng dưới điều kiện nhiệt độ 25˚C và chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang với cường độ 2-3 klux với chu kì sang tối 12:12.
Vòng đời tự nhiên của tảo H.pluvialis trong 2 môi trường C và RM được xác định thông qua sự thay đổi hình thái tế bào, mật độ tế bào, hàm lượng sắc tố (chlorophyll a, astaxanthin) và hàm lượng protein qua các giai đoạn sinh trưởng khác nhau:
– Xác định hình thái tế bào: quan sát TB dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 và chụp lại hình thái.
– Mật độ tế bào: Mật độ TB tảo được đếm bằng buồng đếm hồng cầu.
– Xác định sinh trưởng bằng phương pháp đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 680 nm. Phân tích hàm lượng sắc tố chlorophyll a và astaxanthin theo
Strickland và Person.
– Phân tích hàm lượng protein định lượng theo phương pháp Lowry.
Giai đoạn 2: TB nang (encyst) Giai đoạn 3: TB chín (cyst)
+ Trong suốt quá trình nuôi, hàm lượng protein nội bào có xu hướng giảm dần. Khi TB tảo hoàn toàn chuyển sang giai đoạn bào nang hoàn chỉnh thì hàm lượng protein nội bào của TB H. pluvialis có giá trị nhỏ hơn 100 pg/TB
Giai đoạn 1: TB sinh dưỡng
- Từ 0-10 ngày: TB ở dạng sinh dưỡng có 2 roi chuyển động.
- Kớch thước TB 13x16 ữ 19x25 ± 0,5 àm
- Từ 20-30 ngày: TB chuyển sang dạng cyst.
Kớch thước TB: 18ữ35± 0,5 àm
- Sau 50 ngày TB chuyển dạng đỏ hoàn toàn.
Kớch thước: 40 ± 1àm Giai đoạn 4: Nảy mầm
- Sau 48 giờ cho nảy mầm lại, TB chuyển về trạng thái có 2 roi, chuyển động.
- Sau 15 ngày TB trở lại trạng thái sinh dưỡng bình thường.
+ Hàm lượng chlorophyll a trong TB tăng dần theo thời gian nuôi tảo và đạt giá trị cực đại là 816,79 àg/lit ở thời điểm 40 ngày.
+ Ở 40 ngày đầu nuôi cấy, hàm lượng astaxanthin bắt đầu được tích luỹ và tăng chậm khi TB tảo chuyển từ dạng sinh dưỡng sang dạng tạo bào nang. Hàm lượng sắc tố này tăng đột ngột khi thời gian nuôi khoảng từ 40 đến 50 ngày. Đây là lúc môi trường trở nên thiếu dinh dưỡng. Hàm lượng astaxanthin tích lũy cao nhất là 942,23 àg/l ở 46 ngày nuụi. Ngoài ra, kớch thước tế bào ở giai đoạn này tăng mạnh
và đạt cực đại vào khoảng 40 àm.
+ Vòng đời của TB tảo H. pluvialis trong môi trường C cũng xảy ra tương tự như trong môi trường RM.
+ TB tảo trong môi trường C có hàm lượng protein nội bào, hàm lượng sắc tố đều chỉ đạt giá trị thấp hơn so với khi nuôi trong môi trường RM. Hàm lượng
astaxanthin đạt giỏ trị cao nhất là 912,56 àg/l. Hàm lượng chlorophyll a cao nhất đạt 811,45 àg/l ở 40 ngày nuụi.