Đây là phương pháp rất hữu hiệu áp dụng để định tính, định lượng và chiết tách các thành phần hoá học của dược liệu, về cd sở lý thuyết sắc ký, sinh vicn đã được học ở môn phân tích. Ở đây chĩ nhắc lại một sô" loại sắc ký hay áp dụng cho dược liệu: sắc ký cột, sắc ký giây, sắc ký lđp mỏng và sắc ký khí.
Sắc ký cột: Sác ký cột bao gồm sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột hiộn đại hay còn gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp.
Trong sắc ký cột cổ điển người ta thường dùng các cột thuý tinh đường kính l-5cm đài 30-100cm. Hạt nhổi cột đường kính từ 150-300|im. Sau khi các chất được tách trên pha tĩnh ta có thể lấy từng phần của pha tĩnh có mang chất đem ra chiết lấy từng chất. Nếu các được chất được tách ra ngoài pha tĩnh thì ta hứng lấy các phân đoạn dịch rửa giải có hoà tan các chất nhờ một bộ phận góp tự động.
Trang bị cho sắc ký cột cổ điển rất đơn giản, không tôn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các thành phần hoá học của dược liệu.
Trong sắc ký lỏng cao áp, chất nhồi cột có cỡ hạt 3-1 o^m. Vì hạt rất nhỏ, dung môi chảy khó nên phải đùng bơm để nén. sắc ký lỏng cao áp có khả năng tách các chất rất tốt.
Đô phân tư ghi
Sơ đồ tổng quát máy sắc ký lỏng cao áp
Dung môi (pha di động) để rửa giải phải rất tinh khiết, cần lọc loại vẩn và đuổi hết khí hoà tart bằng siêu âm hoặc đun nóng, khuây hứt hoặc sục khí trơ. Bơm nén phải tạo được áp suất cao 200-500atm. Cột bằng thổp không rĩ có đường kính trong 4-10mm> dài 10-30cm. Có loại nhỏ chiều dài 3-10cm, đường kịnh l-4mm. Cột
This is trial version WWW. adultpdf. com
thuỷ ; 1 dùng ở áp suất dưới 50atm. Khi dung môi hoà tan chất ra khỏi cột thì đi cua detectơ rồi được ghi trển bộ phận ghi tự động. Có nhiểu loại detectơ nhưng loại detectđ hay được dùng là đetectơ quang phổ tử ngoại và khả kiến.
Tuỳ theo bản chất hiện tượng sắc ký người ta chia ra sắc ký hâp phụ, sắc ký phân bô', sắc ký trao đổi ion, sắc ký irên gel.
Trong sắc ký hấp phụ, nhôm oxyd, silicagel hay được sử dụng, Trong quá trình khai triển hoặc rửa giẳi thì các chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh, về pha động ta có thể sử dụng các dung môi vđi độ phân cực tăng dần:
Dung môi e°
Ether dầu 0 ,0 1
Hexan 0 ,0 1
Heptan 0 ,0 1
Cycỉo hexan 0,04
Carbon tetrachlorid 0,18
Ether isopropylic 0,28
Toluen 0,29
Benzen 0,32
Ether ethylic 0,38
Chloroform 0,40
Methylen chlorid 0,42
Dichlor ethan 0,49
Aceton 0,56
Dioxan 0,56
Butanol 0,56
Ethyl acetat 0,58
Acetonitril 0,65
Pyr ’in 0,71
Dimethylsulfoxid 0,75
Alcol isopropylic 0,82
Alcol ethylic 0 ,8 8
Alcol methylic 0,95
Muốn có dung mổi vđi trị giá trung gian không có trong
bảng trên, ta đùng hỗn hợp pha với hai dung môi theo tĩ lệ thích CHj
hợp. '
Si— o — Si— R Trong sắc ký phân bô', pha tĩnh được chia làm hai loại. I Loại thứ nhất, chất lỏng được mang ừên bề mặt của hạt chất CH3 mang, qua quá ưình rửa giâi dần dần bị dung mổi hoà tan, hiện Siloxan nay ít được dùng. Loại thứ hai pha tĩnh được liên kết vđi chất mang. Ví đụ chất mang có thể là silicagel đã tạo thành những dẫn chất siloxan. Nếu R là nhóm kém phân cực như octyl (C8) octadecyl (C18) và pha động là dung môi phân cực như
This is trial version www.adultpdf.com
methanol, acetonitril thì gọi là sắc ký pha đảo. Hiện nay sắc ký pha đảo hay được dùng vì tách tốt áp dụng cho nhiều nhóm hợp chất hoá học. NgƯỢc lại nếu R là nhóm phân cực thì ta có sắc ký pha thuận.
Trong sắc ký qua gel, pha tĩnh là dung mổi nằm trong các lỗ xốp của hạt gel, pha động là dung môi chảy giữa các hạt. Các chất phân tích có phân tử lượng lđn sẽ di chuyển theo dung môi và đi ra khỏi cột trước. Các phân tử nhỏ thì khuếch tán vào lỗ xôp và sẽ đi ra chậm.
Sắc ký giấy: sác ký giấy chủ yếu thuộc sắc ký phẳn bố”. Pha tĩnh được thấm trên một tờ giấy thấim đặc biệt gọi là giấy sắc ký. Có nhiều loại giấy có sổ" khác nhau tuỳ theo độ thấm và nhiều hãng sản xuất khác nhau. Khi tiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp. Có 2 phương pháp: sắc ký đi lên và sắc ký đi xuống tuỳ thuộc vào chiều đi của pha động. Tỷ lệ giữa khoảng cách đường đi của chất phân tích vđi đường đi của pha động tính từ điểm đặt chất phân tích gọi là Rf. Tỉ lệ giữa khoảng cách đường đi của chất phân tích vđi đường đi của một chất đối chiếu được goị là Rr. Các trị sổ' Rf của của nhiều hoạt chất quen thuộc trong dược liệu thường được ghi trong các bảng trong các sách để tra cứu đối chiêu. Các vết của chất được phân bổ' trên giây sắc ký gọi là sắc phổ. sắc phổ được phát hiện bằng màu sắc, kích thưđc, hình dạng các vết hiện ra khi quan sát ở ánh sáng thường hoặc ính sáng đèn phân tích tử ngoại trước và sau khi phun các thuốc thử. Người ta dựa vào Rf hoặc Rr hoặc vào các sắc phổ để xác định đối chiếu các thành phần hoá học của một dược liệu. Để có kết luận chắc chắn thường phải tiến hành trên 3 hệ dung môi. Trong nhiều trường hợp cần phải tiến hành sắc ký hai chiều trên một tờ giấy vuông mới hy vọng tách được các vết (các thành phần) trên một sắc phổ. Muôn vậy, đặt dung địch cần phân tích ở góc một tờ giây. Sau khi triển khai lần một thì chuyển tờ giấy đó sang một buồng sắc ký thứ hai, quay giấy một góc 90° và nhúng vào dung môi thứ hai để triển khai lần hai. Sau khi hiện màu, các vết sẽ phân bô" trên mặt phẳng chứ không phải trên một đường thẳng.
Sắc ký lớp mỏng', sắc ký lđp mỏng chủ yếu là sắc ký hấp phụ tuy nhiên cũng có thể là sắc ký phân b ố hoặc kết hợp cả hai tuỳ thuộc vào bột để tạo lớp mỏng và dung môi sử dụng. Người ta trải một lđp mỏng có chiều dày 0,2-0,3mim thật đều bằng tay hay bằng dụng cụ các bột mịn silicagel hoặc nhốm oxyđ, kieselguhr... trên một tấm kính. Bột có thể không thêm chất dính (tráng khô) hoặc có thể thêm chất đính ví dụ silicagel có trộn thêm CaSƠ4 (tráng ưđt). Hiện nay có nhiều hãng sản xuất các bản sắc ký tráng sẵn trên tấm nhôm hoặc trên tâm nhựa. Thời gian triển khai đôi với sắc ký lđp mỏng nhanh hơn sắc ký giấy, lượng chất phân tích cần ít hơn, ngoài ra có thể sử dụng các thuốc thử như acid sulfuric, nitric đậm đặc... Cũng như sắc ký giấy, ở đây sắc ký hai chiều cũng được ứng dụng.
Đốì vđi sắc ký giây cũng như sắc ký lớp mỏng, diện tích của một vêt tách ra sau khi khai triển vđi một loại dung môi thì tỷ lệ vđi lượng chât có trong vêt đó nên có thể làm cơ sở định lượng. Người ta có thể cắt (nếu là SKG) hoặc cạo bột
This is trial version w w w. adultpdf. com
(nếu là SKLM) từng vết rồi hoà tan hoạt chất chứa trong đổ bằng một dung mỏi thích hợp, sau đó định lượng bằng các phương pháp thích hợp như đo huỳnh quang, đo màu, đo phổ tử ngoại.
Sắc ký khí: Đây là loại sắc ký phân bô", ở đây tưđng tĩnh là chấì lỏng được bao ưên những hạt rất nhỏ goị là chất mang: kiegelguhr, gạch chiụ lửa hoặc điatomit.
Chromo-sorb w là chất mang được điều chế bằng cách nung diatomid vđi lượng nhỏ natri carbonat và sau đó đem nghiền nhỏ theo độ mịn thích hợp, bột có màu
trắng. Chromosorb p thì màu hổng và được điều chế bằng cách đốt nóng chứ không nung. Sự chọn lựa pha tĩnh tuỳ thuộc vào nhiệt độ tiến hành trên cột và tuỳ thuộc vào chất phân tích. Pha tĩnh không bay hơi ở nhiệt độ khai triển và không được có phản ứng vđi chất mang cũng niụf chất phân tích. Sau đây là một sổ' chất dùng làm pha tĩnh cùng với nhiệt độ: không phân cực như dầu silicon 200-250°, dầu apiezon 275-300°, squalen 75°; hơi phân cực như các alcol cò độ sôi cao và những ester của chúng 100-225°C; rất phân cực như các chất polypropylen glycol và những estcr của chúng 225°. Tỉ lệ pha tĩnh cũng có thể được dùng đến 25% trên cột. Người ta cổ thể phân tán pha tĩnh trên chất mang trơ bằng cách hoà tan nó trong một dung môi có điểm sôi thấp ví dụ ether, ưộn thật cẩn thận với chất mang, trải ra để bốc hơi ether.
Người ta còn đùng loại kết hợp vừa chất mang vừa pha tĩnh ví dụ bột "Porapak”
(tổn thương mại) là chất polymer tạo thành do trùng hợp giữa elhylvinyl benzen với divinyl benzen có những mạch nối chéo lạo thành lỗ xốp. Pha động là một khí Irơ. Việc chọn khí phụ thuộc vào detector. Các khí thường dùng là hydrogen, nitrogen, helium và argon. Tốc độ khí rất quan trọng, nếu quá cao thì sự tách các chất không hoàn hảo, quá chậm thì thời gian lưu giữ quá lâu và có hiện tượng khuếch tán pic. Đối vđi cột loại ngắn thì tốc độ dòng khí là 10-50ml/phút. Mau phân tích được đưa vào đầu cột bằng một loại bơm tiêm đặc biệt thường là 0,05- 0,lml. Đôì với một vài loại detector thì lượng còn ít hơn. Hỗn hợp phân tích phải bốc hơi ngay khi bắt đầu tiếp xúc vđi iưđng tĩnh. Đối vđi các thành phần có điểm sôi thấp thì có thể triển khai ở nhiệt độ thường. Một sô' khác đòi hỏi nhiệt độ cao hơn ví dụ tinh dầu thường ở 150-300°, các thuốc trừ sâu có thể đến 400°. Hiện nay các máy sắc ký đều hoạt động theo chương trình nhiệt nghĩa là nhiệt độ cột tăng dần trong quá trình khai triển. Có một số chất tuy bản thân nó không bốc hơi được
This is trial version www.adultpdf.com
nhưng có thể chuyển thành dẫn chất bồc hơi được thì cũng có th ể phân tích bằng sắc ký khí, ví dụ các chất có nhóm OH như các đường, flavonoid, morphin, codein, cardenolid... thì chuyển thành các dẫn chất trimethylsiloxy:
2ROH + (CH3)3SiNHSi(CH3) - > 2 RO Si(CH3) 3 + NH3
Trong sắc ký người ta hay dùng detector dựa vào phương pháp độ dẫn điện hoặc phương pháp ion hoá ngọn lửa.
This is trial version WWW. adultpdf. com
CHƯƠNG
2
Dưực liệu chứa carbohydrat
M ực TIÊU HỌC TẬP:
Sau khi học chương “Dược liệu chứa carbơhydrat” sinh viên phải biết được:
1. Cấu trúc hóa học của tinh bột, cellulose và cá c dẫn chất, gom chất nhầy và pectin.
2. Các phương pháp đ ể nhận biết và đánh giá dược liệu chứa cá c thành phần nói trên.
3\ Các dược liệu chứa tinh bột đ ã được đưa vào giáo trình, chứ trọng các dược liệu: cát cấn, sen, ỷ dĩ.
4. Dược liệu chứa cellulose: cây bông.
5. C ác dược liệu chứa gôm và chất nhầy đ ã đuục đưa vào giáo trình, chú trọng: gôm. arabic, gôm adragant, sâm b ố chính, m ã đề, thạch.
ĐỊNH NGHĨA:
Carbohydrat là những thành phần rất quan trọng của thực vật. Carbohydrat là nơi tích trữ năng lượng từ ánh sáng mặt trời qua quá ừình quang hđp, là nguồn nuổi sổng loài người và loài vật. Đầu tiên, sau khi nghiên cứu những đường đơn giản người ta thấy cấu tạo của đường tương ứng với công thức Cn(H2 0)n nên gọi là carbohydrat, ví dụ glucose CoHnOó có thể viết Ce(H2 0)6. v ề sau, khi nghiên cứu kỹ, người ta thấy một số đường không thể viết được công thức chung CD(H2 0)n, ví du; methyl pentose CH3-(CHOH)4-CHO, hoặc có một số chất tuy không phải thuộc carbohydrat, ví du: acid lactic CH3-CHOH-COOH thì lại viết được theo công thức trên: C3(H2 0)3. Do đó hội nghị danh pháp quốc tế có đề nghị gọi là glucid, tuy nhiên từ carbohydrat vẫn còn thông dụng.
Có thể định nghĩa carbohydrat hoặc gluciđ là những nhóm hợp chất hữu cơ gồm những monosaccharid, những dẫn châ't và những sản phẩm ngưng tụ của chúng. Monosaccharid là những chất polyhydroxyaldehyđ (aldose) và poly- hydroxyceton (cetose) có thể tổn tại dưới dạng mạch hở và dạng mạch vòng bán aeetal. Những sản phẩm ngưng tụ tức là những oligosaccharid.
Carbohydrat có thể chia thành 3 nhóm: monosaccharid, oligosaccharid và polysaccharid (oligo theo tiếng Hy Lạp là một ít).
This is trial version WWW. adultpdf.com
1. Monosaccharid là những đường đơn không thể cho carbohyđrat đơn giản hơn khi bị thừy phân, monosaccharid tồn tại trong tự nhiên từ tetrose đến nonose.
2. OUgpsaccharid giản hơn ví dụ:
. .ỉía ..f
Amylose 0-3-D-
glucopyranosyl-D-glucose), celIobiose( = 4 -0 -P “D-glucopyranosyl-D-glucose), lactose (= 4-0-ị3-D-glucopyranosyl-D-glucose)...
3. Polysaccharid có phân tử rất lđn gồm nhiều monosaccharid nối với nhau ví dụ:
tinh bột, cellulose, gốm, pectin, chấl nhầy.
Dưđi đây chỉ đề cập đến phần polysaccharid. Phần oligosaccharid và monosaccharid sinh viên đã được học ở môn Hóa hữu cơ và Hóa sinh.
Tinh bột
Tinh bột là sản phẩm quang hợp của cây xanh. Ở trong tế bào thực vật hạt lạp không màu là nơi tạo ra tinh bột, các gluciđ hòa tan kéo đến hạt lạp không màu và được để dành dưổi dạng tinh bột. Tinh bột được giữ lại trong các bộ phận của cây như củ, rễ, quả, hạt, thân với hàm lượng từ 2-70% , trong lá thường không quá
1 -2%. Tinh bột ở dưđi đạng hạt kích thước và hình dáng khác nhau, không tan trong nưổc lạnh, đun với nước thì tinh bột dần dần bị hồ hóa và độ nhđt của dung dịch cũng tăng lên. Trong quá trình hoạt động của cây, tinh bột dưới tác động của enzym có sẵn trong cây bị cắt nhổ thành những đường đơn giản ở dạng hòa tan và được chuyển đến những bộ phận khác nhau của cây.