KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA GLYCOSID
BÀI 9 DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN
Mục tiêu
Sau khi thực hành, sinh viên phải:
- Thực hiện được các phản ứng định tính chung của tanin trong dược liệu.
- Phân biệt được 2 loại tanin bằng các phản ứng hóa học.
- Định lượng được tanin trong dược liệu bằng phương pháp oxy hóa với KmnO4. I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Tanin (tannin, taninoid) là những hợp chất polyphenol phức tạp, có nguồn gôc thực vật, có vị chát và có tính thuộc da.
Dựa vào cấu trúc hóa học, người ta xếp tanin vào 2 nhóm chính:
- Tanin thủy phân được (tanin pyrogallic)
- Tanin không thủy phân được (tanin ngưng tụ, tanin pyrocatechic) Tanin dễ tan trong kiềm loãng, trong hỗn hợp cồn nước.
Tanin tan được trong cồn, glycerin, propylen glycol, aceton và ethyl acetat.
Tanin không tan trong dung môi kém phân cực.
Tanin tạo tủa với dung dịch nước của protein. Đây là tính chất quan trọng để định tính tanin.
Để phân biệt 2 loại tanin pyrogallic và pyrocatechic có thể dựa vào phản ứng thế và phản ứng ngưng tụ trên nhân thơm của tanin pyrocatechic cũng như sự tạpưo màu sắc khác nhau của cả hai loại tanin với các thuốc thử FeCl3, thuốc thử Stiassny, nước Brom…
Có nhiều phương pháp định lượng tanin, như phương pháp chuẩn độ thể tích, phương pháp đo màu… DĐVN IV quy định dùng phương pháp bột da để định lượng tanin trong dược liệu.
II. THỰC HÀNH
A.Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.Hóa chất, thuốc thử
- Dung dịch gelatin muối 1%
- Thuốc thử stiasny - Dung dịch FeCl3 1%
- Dung dịch chì acetat - Dung dịch KMnO4 0.1 N - Chỉ thị màu sulfo indigo.
- Nước brom 2.Cách pha một số thuốc thử
2.1. Dung dịch gelatin – muối Dung dịch gelatin 1% trong nước muối 10%.
2.2. Thuốc thử Stiasny: Dung dịch formol – HCl đậm đặc (2:1), pha khi dùng.
2.3. Chỉ thị sulfo indigo: Hòa tan 1 g carmin indigo trong 25 ml acid sulfuric đậm đặc. (TT). Thêm 25 ml acid sulfuric đậm đặc nữa. Sau đó pha vào nước đến vừa đủ 1000 ml.
3.Dược liệu - Ngũ bỗi tử
- Lá ổi (Psidium guajava L., Myrtaceae) B. Phương pháp tiến hành
1. Chiết xuất
Lấy 1g bột dược liệu cho vào erlen 50ml, thêm 30ml nước sôi, đun trên bế cách thủy sôi 10 phút, lắc đều khi đun. Lọc nóng lấy dịch lọc trong. Chiết tiếp bã dược liệu lần 2 với 10ml nước, nếu cần.
Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng định tính tanin.
3. Định tính chung tanin trong dược liệu 3.1. Phản ứng với dung dịch protein
Lấy vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, cho vào đó 1 giọt thuốc thử gelatin muối, lắc nhẹ.
Phản ứng dương tính nếu có tủa trắng đục.
3.2. Phản ứng với muối kim loại nặng
Cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống 2ml dịch chiết. Thêm vào lần lượt các thuốc thử:
- Ống 1: 1 giọt TT FeCl3 1%
- Ống 2: 1ml TT chì acetat 1%
- Ống 3: 1 giọt TT đồng acetat 1%
Quan sát màu, mức độ tạo màu, tạo tủa của các dược liệu. Nếu cần có thể pha loãng (nhỏ vài giọt sản phẩm vào ống nghiệm chứa 5ml nước) để quan sát cho rõ hơn.
4. Định tính phân biệt 2 loại tanin
Cho vào 3 ống nghiệm lớn mỗi ống 2ml dịch chiết. Thêm vào lần lượt các thuốc thử:
- Ống 1: 1 giọt TT FeCl3 1%
- Ống 2: 1ml TT Stiassny - Ống 3: 1 giọt nước Brom
Quan sát sự tạo màu, tạo tủa của dung dịch để kết luận loại tanin.
Chú ý: có thể pha loãng vào nước để dễ quan sát hơn
Thuốc thử Tanin pyrogallic Tanin pyrocatechin
FeCl3 1% → xanh đen → xanh rêu
Stiassny + đun cách thủy 10
phút → không tủa → tủa vón, đỏ gạch
Nước brom → không tủa → tủa ngà
5. Xác đinh 2 loại tanin trong một dược liệu
Lấy 5ml dịch chiết của dược liệu có chứa 2 loại tanin vào ống nghiệm lớn, thêm thuốc thử Stiasny, đun cách thủy 10 phút, lọc trong. Dịch lọc tiếp tục với 1ml thuốc thử Stiassy mới: nếu không còn tủa thì ngưng; nếu còn tủa thì tiếp tục lọc lấy dịch
lọc trong, tiến hành lặp lại như trên cho đến khi không còn tủa nữa. Lọc lấy dịch trong.
Trung hòa dịch lọc bằng dung dịch NaOH 10% đến pH 5-6 rồi tiếp tục thêm natri acetat (dung dịch đậm đặc hay tinh thể) cho tới pH trung tính hoặc kiềm nhẹ rồi chia vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml.
Thêm vào ống thứ nhất vào giọt thuốc thử gelatin muối Thêm vào ống thứ hai một giọt thuốc thử FeCl3
Quan sát: nếu ống thứ nhất có tủa trắng đục, ống thứ hai có màu xanh đen thì dược liệu có tanin pyrogallic
6. Tìm catechin tự do trong dược liệu
Lấy 5ml dịch chiết dược liệu có chứa tanin catechic, thêm dung dịch gelatin muối, lọc lấy dịch trong. Dịch lọc tiếp tục thêm gelatin muối, nếu còn tủa thì lọc tiếp đến khi dịch lọc không xuất hiện thêm tủa với gelatin muối nữa, lọc lấy dịch trong.
Dịch lọc được chia làm 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml. Ống thứ nhất cho thêm 1 giọt thuốc thử Stiassny, ống thứ hai thêm 1 giọt thuốc thử FeCl3.
Nếu ống thứ nhất sau khi đun cách thủy 10 phút có tủa vón màu đỏ gạch và ống thứ hai có màu xanh rêu thì dược liệu có catechin tự do.
7. Định lượng tanin tự do trong dược liệu 7.1. Nguyên tắc
Tanin bị KMnO4 oxy hóa ở môi trường acid. Điểm kết thúc định lượng được xác định bằng chỉ thị màu sulfo indigo. Từ lượng KmnO4 tiêu thụ, tính ra lượng chất bị oxy hóa trong dược liệu quy theo một tanin chuẩn.
7.2. Tiến hành
Cân chính xác 1g bột lá Ổi (qua rây 0,5mm) cho vào 1 erlen 250ml. Thêm 50ml nước sôi và đun cách thủy trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc. Gạn và lọc dịch lọc qua bông vào 1 becher 250ml (tránh để các mảnh dược liệu rơi lên bông).