MỤC TIÊU
1. Trình bày định nghĩa về saponin 2. Nêu cấu trúc hóa học của saponin
3. Trình bày các phương pháp để kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin 4. Nêu được các phương pháp chung để chiết xuất saponin
5. Liệt kê các tác dụng và công dụng của saponin
6. Nhận biết và sử dụng các dược liệu có chứa saponin: Cam thảo, Viễn chí, Cát cánh, Bồ kết, Ngưu tất, Rau má, Nhân sâm, Tam thất, Thiên môn, Mạch môn, Ngũ gia bì chân chim.
NỘI DUNG
1. KHÁI NIỆM CHUNG VỀ SAPONIN
Saponin hay saponosid là một nhóm các glycosid có phần genin có cấu trúc triterpen hay steroid 27 carbon gặp rộng rãi trong thực vật (sapo có nghĩa là xà phòng).
Người ta cũng phân lập được một số saponin trong động vật thân mềm như Hải sâm, Sao biển
Theo truyền thống, saponin thường được định nghĩa dựa trên một số tính chất chung đặc trưng của nhóm hợp chất này là:
- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch.
- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
- Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra còn có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên.
- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng.
- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3--hydroxysteroid khác.
Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin. Ví dụ:
sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol.
Ngày nay, saponin thường được định nghĩa dựa trên cơ sở cấu trúc hóa học đó là các triterpen glycosid hay các steroid glycosid.
Tính chất của saponin:
Saponin thường là những chất vô định hình, không màu tới màu trắng ngà. Một số saponin có mạch đường ngắn có thể kết tinh. Saponin thường là những chất kết tinh không màu.
59 Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare L., có vị ngọt.
Saponin là những chất phân cực nên có thể tan trong các dung môi phân cực như các alcol, hỗn hợp cồn – nước, nước và các dung môi phân cực khác dimethyl sulfoxid, dioxan, acid acetic, pyridin. Butanol là một dung môi hòa tan tương đối chọn lọc các saponin có mạch đường ngắn tới trung bình nên thường dùng để tinh chế saponin bằng cách lắc phân bố với nước. Các saponin có mạch đường dài có thể tan tốt trong nước. Saponin rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng các dung môi thêm vào dung dịch cồn để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì acetat, bari hydroxyd và amoni sulfat.
Tính tan của sapogenin (phần genin) thì ngược lại, chúng tan tốt trong dung môi kém phân cực tới phân cực trung bình như benzen, chloroform và tan một phần trong methanol, ethanol. Sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin.
Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm.
Saponin có tính chất hoạt động bề mặt. Đặc tính này được giải thích bởi tính chất vừa thân dầu vừa thân nước của phân tử saponin. Nhờ đặc tính này mà saponin tạo bọt nhiều khi nhắc với nước, có tác dụng nhũ hóa và tẩy sạch. Không phải tất cả saponin đều tạo bọt khi lắc với nước.
Do khối lượng phân tử lớn, saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất.
Saponin độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết. Saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên cũng do làm ảnh hưởng đến lớp mềm.
Về mặt phân loại, dực vào cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid.
2. CẤU TRÚC HÓA HỌC 2.1. Saponin triterpenoid
Phần genin của loại này có 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen. Người ta chia làm hai loại: Saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic.
2.1.1. Saponin triterpenoid pentacyclic 2.1.1.1. Nhóm olean
Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean. Phần aglycon nhóm này thường có 5 vòng và thường là dẫn chất của 3-β-hydroxy olean 12- ene, tức là β-amyrin.
60
O H
R1 R2
R3 R5 R4
-amyrin
R1= R2= R3= R4= R5= CH3
Hình 6.1. Cấu trúc nhóm olean Một vài aglycon: acid olemolic, hederagenin, gypsogenin.
Mạch đường có thể nói vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào C-28 theo dây nối ester. Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 10 - 11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường.
2.1.1.2. Nhóm Ursan
Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác là nhóm metyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19. Các sapobenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3 β hydroxy ursan 12-ene, tức là α- amyrin.
Những sapogenin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean. Cinchona glycosid A, cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na, asiaticosid có trong Rau má là những saponin của nhóm này.
Hình 6.2. Cấu trúc nhóm Ursan
2.1.1.3. Nhóm lupan
Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí 20-29.
Một số saponin có trong cây Ngũ gia bì chân chim thuộc nhóm này.
61 2.1.1.4. Nhóm hopan
Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17. Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A có trong cây Cỏ thảm (Mollugo hirta L.)
Hopan
Mollugocin A trong cây Cỏ thảm (Mollugo hirta L.)
Hình 6.4. Cấu trúc nhóm Hopan và Mollugocin A
2.1.2. Saponin trierpenoid tetracyclic 2.1.2.1. Nhóm dammaran
Đại diện là các sapomin của Nhân sâm. Phần aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh. Do có nhóm OH đính vào C-20 nên khi tác dung với acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran. Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin chính của các saponin Nhân sâm là protopanaxadiol và protoppanaxatriol.
Phần đường nối vào OH ở carbon C-3 hoặc C-20 để tạo thành glycosid.
Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm dammaran còn gặp trong hạt Táo (Zyzyphus jujuba Mill), rau Đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst.) hay Cổ yếm (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino,.
Hình 6.3. Cấu trúc nhóm Lupan
1 2
3 4 5
6 7 8 9 10
11 12
13 14
15 16 17 18
19 20
A B
C
E 21
D
22
62
Dammaran
Aglycon thật Aglycon giả Hình 6.5. Cấu trúc nhóm Dammaran
2.1.2.2. Nhóm lanostan:
Cấu trúc của nhóm lanostan gần giống với dammaran, chỉ khác ở chỗ nhóm methyl góc đính vào vị trí C-13 thay vì C-8. Nhóm được chia thành 2 nhóm phụ:
Nhóm phụ holostan: do có sự đóng vòng lacton giữa C-18 và OH ở C-20 đại diện là Holothurin A, B có trong các loài Hải sâm – Holothuria spp.
Nhóm phụ cycloartan: có cấu trúc 9,19-cyclo-(9-lanostan. Đại diện là các saponin abrusosid A, B, C, D có trong Cam thảo dây.
Hình 6.6. Cấu trúc nhóm Lanostan 2.1.2.3. Nhóm cucurbitan
Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí C-10 lại đính ở C-9.
1 2
3 4
5 6
7 8 9 10
11 12
13 14
15 16 18 17
19
20
21 22
23 24
25
26 27
28 29
30
63 Hình 6.7. Cấu trúc nhóm Cucurbitan
2.2. Saponin steroid: Có 5 nhóm chính gồm spirostan, furostan, aminofurostan, spirosolan, solanidan.
2.2.1. Nhóm spirostan
Ta xét 3 chất sapogenin làm ví dụ: sarsasapogenin, smilagenin, tigogenin.
Những chất này có 27 carbon như cholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 20-27 tạo thành hai vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy), một vòng là hydrofuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F). Hai vòng này nối với nhau bởi một carbon chung ở C- 22. Mạch nhánh này được gọi là mạch nhánh spiroacetal.
Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid. Hai saponin quan trọng nhất là diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave).
Ở dạng glycosid phần đường được nối vào OH ở C-3, một số ít thường gặp ở C- 1. Mạch đường thường phân nhánh và phức tạp.
2.2.2. Nhóm furostan Cholesterol
Spirostan
O
H H
O O
A B
C D
E F
1 2 3
4 5
6 7 9 8 10
11 12
13
14 15
16 17 18
19
20
21 22
23 24
25 26
27
Sarsasapogenin
O
H H
O O
H
Smilagenin Hình 6.8. Cấu trúc nhóm Spirostan
64
Nhóm này có câu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi. Trường hợp thứ nhất: Vòng F mở và nhóm alcol bậc một ở C-26 được nối với đường glucose. Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzym hoặc bởi acid) thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. Ví dụ sarsaparillosid dưới tác dụng của enzym thủy phân cách mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin.
Trường hợp thứ hai: Vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy. Ví dụ avenacosid có trong yến mạch (Avena L, Họ lúa – Poaceae). Avenacosid A cũng có 2 mạch đường. Khi thủy phân cắt đường glucose ở C-26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan.
Sarsaparillosid và avenacosid A đều có 2 mạch đường. Người ta gọi đây là các bidesmosid (desmos = mạch).
Vòng F mở Vòng F 5 cạnh Hình 6.9. Cấu trúc nhóm Furostan
2.2.3. Nhóm aminofurostan
Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid nói ở trên nhưng vị trí C-3 đính nhóm NH2. Ví dụ jurubin, là saponin có trong Solanum paniculatum.
Hình 6.10. Cấu trúc nhóm Aminofurostan
2.2.4. Nhóm spirosolan
Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay bằng NH. Một điểm cần chú ý là ở đây có isomer ở C-22 (khác với nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây Cà Úc (Cà lá xẻ - Solanum laciniatum) có cấu trúc (25R) 22α còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22β
65 Hình 6.11. Cấu trúc nhóm Spirosolan
2.2.5. Nhóm solanidan
Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này. Ở đây hai vòng E và F cùng chung 1C và 1N.
Hình 6.12. Cấu trúc nhóm Solanindan
Những chất thuộc ba nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất glycoalcaloid.
Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin steroid có cấu trúc mạch nhánh khác ví dụ polypodosaponin và oslandin được jizba phân lập 1971 từ thân rễ cây Polypodium vulgare L.; Oslandin là một bidesmosid có vị ngọt, α-spinasterol glycosid có trong cây Chè Camelia sinensis (L.) O.k.tze (Thea sinensis).
3. KIỂM NGHIỆM SAPONIN 3.1. Dựa trên tính chất tạo bọt
Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tử saponin lớn và có cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa trên hiện tượng gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin steroid và triterpenooid: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút.
Lấy hai ông nghiệm cở bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N (pH=1) cho vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả hai ống trong 15 giấy. Để yên, nếu cột bọt trong cả hai ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có chứa triterpenoid. Nếu ống kiềm có bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid. Có thể dựa vào chỉ số bọt để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin;
chỉ số bọt là số ml nước để hào tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bọt cao 1cm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện quy định).
66
Cách tiến hành: Cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình nón có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml, lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm và đường kính 16mm, cho vào các ống nghiệp lần lượt 1,2,3…, 10ml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi nống cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây hai lần lắc. Để yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt.
Nếu ống có cột bọt cao 1cm nằm giữa gam, ví dụ ống số 4 chẳng hạn thì tính như sau : ống này có 4 ml nước sắc 1% tương ứng với 0,04g bột thì chỉ số là : 10x1/0,04=250.
Nếu chỉ số bọt nằm trong ống số 1,2 thì cần pha loãng để có chỉ số nằm giữa gam.
3.2. Dựa trên tính chất phá huyết
Đây cũng là tính chất đặc trưng của saponin. Tuy nhiên cũng có một vài saponin không thể hiện rõ tính chất này. Khả năng phá huyết cũng khác nhau nhiều tùy loại saponin. Người ta cho rằng tính phá huyết có liên quan đến tính tạo phức với cholesterol và các ester của nó trong màng hồng cầu nhưng lại thấy rằng giữa chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức với cholesterol có nhiều trường hợp không tỷ lệ thuận với nhau nên người ta cho rằng phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết của saponin người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycon có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết nhưng phần đường cũng có ảnh hưởng. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị tác động khác nhau đối với một saponin. Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nên dùng tốt, có thể dùng máu của súc vật có sừng khác hoặc dùng máu thỏ thường dễ kiếm đối với các phòng thì nghiệm.
Để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa trên chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hòa tan saponin có trong 1g nguyên liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một thứ máu đã chọn (tiến hành trong điều kiện quy định). Cách tiến hành:
- Pha dung dịch đệm:
Dung dịch mono kali phosphat 0,07% 28ml Dung dịch dinatri phosphat 11,87% 162ml
NaCl tinh khiết 1,8g
- Pha dung treo máu: Để làm cho máu không đông phải loại fibrin bằng cách lấy 300ml máu súc vật có sừng mới cắt tiết cho vào bình 1 lít có miệng rộng, dùng đũa khuấy tròn đều hoặc cho vào bình một ít bi thủy tinh, lắc tròn khoảng 10 phút, lọc qua gạc loại fibrin, để tủ lạnh có thể dùng được vài ngày. Từ máu đã loại fibrin này đem pha thành dung treo máu 2% vời dung dịch đệm. Có thể tiến hành chống đông máu và pha thành dung treo máu để làm thí nghiệm bằng cách khác như sau: Lấy 4,5ml máu thỏ trộn với 0,5ml dung dịch 3,65% natri citrat rồi thêm 220ml dung dịch đệm.
- Pha dung dịch saponin: Bột nguyên liệu đã rây qua rây 0,5mm, cân chính xác 0,5 - 1g, cho vào bình, thêm dung dịch đệm (50 - 100ml) rồi đặt lên nồi cách thủy (95 - 980C) trong 30 phút. Lọc rồi pha đến thể tích chính xác.
- Thử sơ bộ: Pha các hổn hợp theo bảng dưới đây:
67
Ống (ml) I II III IV
Dung dịch chiết dược liệu 0,10 0,20 0,50 1,00
Dung dịch đệm 0,90 0,80 0,50 -
Dung dịch treo máu 2% 1,00 1,00 1,00 1,00
Bảng 6.1. Nồng độ các dung dịch thử tính phá huyết của saponin
Lắc nhẹ ngay hỗn hợp (tránh tạo bọt). Sau 30 phút, lắc rồi để yên trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Quan sát các ống và xác định ống (hoặc các ống) có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, nghĩa là ống đỏ đều và trong, không có hồng cầu lắc đọng.
Nếu chỉ có ống IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì cứ dùng dung dịch dược liệu ban đầu, nếu ống III và IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì dùng dung dịch đệm để pha loãng gấp đôi (1:1), nếu cả ba ống II, III, IV thì pha loãng gấp 5 (1 + 4), nếu cả 4 ống đều trong suốt và đỏ thì pha loãng dịch chiết dược liệu gấp 10 lần (1 + 9) và làm lại thí nghiệm sơ bộ từ đầu. Nếu trường hợp ngược lại nghĩa là cả 4 ống đều không có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì tiến hành thử sơ bộ lại với dung dịch nguyên liệu đậm đặc hơn.
Thử nghiệm quyết định: Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (còn gọi là ống pha huyết), đánh số thứ tự rồi cho vào mỗi ống lần lượt như sau: Dung dịch chiết nguyên liệu theo thứ tự tăng dần: ống thứ nhất 0,95ml, ống thứ hai 0,90ml …, dung treo máu 2% mỗi ống 1ml. Sau đó lắc khẽ ngay để trộn đều. Sau 30 phút lắc lại một lần nữa. Sau 24 giờ thì đọc kết quả: Tìm ống đầu tiên có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, tính độ pha loãng của nguyên liệu trong ống đó. Chính độ pha loãng của ống này là chỉ số phá huyết của nguyên liệu. Có thể độc kết quả sớm hơn bằng cách ly tâm 10 phút (1500 vòng/phút) sau khi đã để yên 2 giờ.
3.3. Dựa trên độ độc với cá
Cá là động vật rất nhảy cảm với saponin nên người ta dùng các cây có saponin để thuốc cá (đừng nhầm với rotenon). Để đánh giá nguyên liệu chứa saponin, người ta có thể dựa vào chỉ số cá. Chỉ số cá cũng phải được tiến hành trong điều kiện quy định, như mồi trường, loại cá,…
3.4. Khả năng tạo phức với cholesterol
Những saponin triterpenoid tạo phức kém hơn loại steroid. Trong loại steroid thì digitonin kết hợp với cholesterol gần như hoàn toàn, do đó digitonin được dùng làm thuốc thừ để định lượng cholesterol trong hóa sinh.
3.5. Các phản ứng màu
- Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho màu thay đổi từ vàng, đỏ, lơ xanh lá hay lơ tím (phản ứng Salkowski).
- Saponin triterpenoid cho tác dụng mạnh với vanilin 1% trong HCl và hơ nóng (phản ứng Rosenthaler) sẽ có màu hoa cà.
- Saponin tác dụng với antimoin triclorid trong dung dịch cloroform rồ soi dưới đèn phân tích tử ngoại thì saponin triterpenoid có huỳnh quang xanh còn saponin steroid thì vàng.