Những hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác nhau vì thế việc lựa chọn dung môi phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây tùy thuộc vào đặc tính của chất biến dưỡng thứ cấp có trong cây mà người khảo sát muốn cô lập.
Trong hướng hợp chất thiên nhiên , việc cô lập chất phức tạp hơn nhiều do không biết cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học ra sao . Biết rằng cây cỏ cần khả o sát chứa nhiều hợp chất ữu cơ , từ loại không phân cực đến loại rất
cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn . Vì thế ngư ời ta thường chuẩn bị một loạt cao chiết có tính phân cực tăng dần , như thế mỗi laoị cao chiết chứa tương đối ít hợp chất , giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng hơn. Nhìn chung việc cô lập được một hợp chất tinh chất để xác định cấu trúc hóa học hoặc để thử nghiệm hoạt tính sinh học mất rất nhiều thời gian.
Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau , sử dụng dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “ các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau”: dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cự c, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan các hợp chất phân cực.
1.6. CÁC KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT RA KHỎI CÂY[11]
1.6.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ( liquid – liquid extracton )
Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực ( thí dụ eter dầu hỏa… ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực ( thí dụ các alcol béo, ester béo…), dung môi phân cực trung bình ( thí dụ dietyl eter, chloroform…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp chất có chứa nhóm eter ─O─ , aldehyt
─CH=O, ─CO─, ester ─COO─…) và dung môi phân cực mạnh ( thí dụ methanol) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm ─OH ,
─COOH─…)
Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng , trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước . Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước , để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau ( tùy vào độ phân cực của mỗi dung môi ).
Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa d ung môi và nước mà pha hữu cơ ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước.
Hình 1.6.1: Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ( Partition)
Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần ,nên ở những lần chiết sau, dung môi trong bình lắng tạo nhũ tương , gây cản trở cho việc tách pha thành hai lớp. Để khắc phục nhược điểm này , có thể sử dụng các cách như trình bày sau hoặc sử dụng phương pháp trích pha rắn ( solid phase extraction).
1.6.2. Kỹ thuật chiết rắn – lỏng
1.6.2.1 Phương pháp chiết ngấm kiệt ( Percolation)
Phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém phức tạp Hiệu quả của phương pháp : so sánh với phương pháp ngâm dầm , phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít mất công hơn, vì đây là quá trình chiết lien tục , dung môi trong bình ngấm kiệt đã bảo hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết.
Hình 1.6.2 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt ( Percolation)
(Vận tốc dung môi chảy vào bình chứa bột cây bằng vận tốc dung môi chảy ra ) 1.6.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm ( Maceration )
Kỹ thuật ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp , vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây . Ngâm bột cây trong một b ình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ , bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là chất đó chứa trong cây.
Dung môi sau khi được thu hồi , được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau.
1. 6.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet
Máy có bán sẵn với nhiều kích cỡ lớn nhỏ khác nhau , từ bình cầu 250 mL đến 15 lít.
Hình 1.6.3. Chiết bằng máy Soxhlet Ưu điểm của kỹ thuật:
Tiết kiệm dung môi , chỉ một lượng ít dugn môi mà chiết kiệt được mẫu cây. Không phải tốn công lọc và châm dung môi mới.
Không tốn các thao tác lọc và châm dung môi mới như các kỹ thuật khác . Chỉ cần cắm điện, mở nước hoàn lưu là máy sẽ thực hiện sự chiết.
Chiết kiệt hợp chất trong bột cây vì bột cây luôn được chiết bằng dung môi tinh khiết.
Nhược điểm của kỹ thuật:
Kích thước của máy Soxhlet làm giới hạn lượng bột cây cần chiết . Máy loại lớn nhất với bình cầu dung tích 15 lít có thể chứa một lần đến 10 lít dung môi; ống D có thể chứa 800 gam bột cây xay nhỏ . Với máy nhỏ hơn chỉ có thể cho và o mỗi lần vài trăm gam bột cây , muốn chiết một lượng
1.6.2.4.Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Kumagawa
Sử dụng máy chiết Kumagawa với thiết bị , nguyên tắc giống như máy chiết Soxhlet, chỉ khác túi đặt bột cây được đặt gần nguồn nhiệt hơn.
Ưu, nhược điểm:
Do chiết nóng nên khả năng hòa tan của dung môi được gia tăng , có thể hòa tan tốt những hợp chất rất phân cực . Tuy vậy, bột cây luôn được ngâm trong dung môi nóng nên các hợp chất kém bền nhiệt có thể bị hư hại.
1.6.2.5. Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước
Hình 1.6.4 Chiết bằng lôi cuốn hơi nước.
Kỹ thuật đặc trưng để chiết ra khỏi cây cỏ các loại hợp chất có tính chất bay hơi được, thí dụ như tinh dầu.
1.6.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn
Tuy đã được biết đến cách đây rất lâu ( 1879) nhưng mãi đến thập niên 1980, phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật để chiết các hợp chất thiên nhiên ra khỏi thực vật như tinh dầu cà phê , trà, gia vị và nhất là hoa bia (hop).
So với các kỹ thuật chiết cổ điển như chiết rắn – lỏng với dung môi hoặc chiết bằng lôi cuốn hơi nước dù phương pháp này có nhiều ưu đểm hơn , như sử dụng ít dung môi , có tính chọn lọc cao các loại hợp chất cần chiết tách , chất chiết được tương đối sạch, ít làm hư hại chất cần chiết và nhất là thân thiện với môi trường.
1.7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐÔC CẤP TÍNH LC50
TRÊN ẤU TRÙNG MUỖI VÀ SÂU TƠ[12].
Giá trị độc độc cấp tính LC50 phụ thuộc vào hoạt chất của chế phẩm, thời gian phơi nhiễm, chủng loại sinh vật thử nghiệm, tuổi và khối lượng của sinh vật thử nghiệm, điều kiện môi trường.
Phương pháp đánh giá độ độc cấp tính LC50
Mỗi lần thí nghiệm pha 5 mức nồng độ thấp dần theo tỉ lệ tính toán trước. Nếu trong thí nghiệm này không có mức nào xảy ra tử vong ở 50% thì làm tiếp dãy thí nghiệm khác có nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn tùy vào kết quả thực nghiệm. Thí nghiệm sẽ dừng lại khi quan sát thấy có một khoảng nồng độ nào đó làm đối tượng nghiên cứu chết 50±10%.
Có thể xác định giá trị LC50 trong các khoảng thời gian sau: 24; 48; 96 giờ và dựa theo thang độc cấp tính cuả tác giả M.A. Kamrin, Presticide Toxicity, Environment Impavt, and Fare, Lev Publisher ( Boca Roton FL, 1997)
Bảng 1.7. Thang độc cấp tính[13]
Loại độc tinh LC50 (ppm)
Độc rất cao ( very highly toxic) <100
Độc cao ( highly toxic) 100-1000
Độc trung bình (moderately toxic) 1000-10000
Đôc nhẹ ( slighly toxic) 10000-100000
Không độc ( Not acutely toxic) >100000
Xây dựng đồ thị giữa nồng độ và số con chết, đưa các số liệu thực nghiệm ở 5 nồng độ về dạng đường thẳng có phương trình hồi quy là Y=aX+b với độ tin cậy dựa vào giá trị R2, bằng phương pháp phân tích và tính toán trên excel ở giá trị ứng với số con chết là 50% suy ra được giá trị LC50.
So sánh giá trị LC50 tính toán được với thang độc tính cấp có thể xếp chế phẩm vào loại độc tính nào.
CHƯƠNG 2:
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 2.1.1.Nguyên liệu
Trái bình bát chínđược thu hái từ những cây bình bát 3 năm tuổi trồng ở huyện Củ Chi vào ngày 22/07/2012 được TS. Nguyễn Phước Thành định danh là “trái bình bát” vào ngày 23/07/2012, khối lượng bình bát hát đư ợc là 7,5kg được sử dụng làm nguyên liệu để chiết xuất, tinh sạch và xác định hoạt tính sinh học. Tất cả các trái bình bát được chọn mới chuyển sang màu vàng hay vàng xanh, lúc này hàm lượng độc tính trong hạt là lớn nhất. nếu trái còn xanh thì hàm lư ợng độc chất rất ít hoặc hầu như không có độc tính[14].
Hình 2.1.1. Trái bình bát chín được chọn làm nguyên liệu ban đầu 2.1.2. Dụng cụ
-Cột sắc ký
-Sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel -Hệ thống máy cô quay chân không -Hệ thống chiết Soxhlet
-Các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác
1.1.3. Hóa chất - Eter dầu hỏa -Chloroform -Etyl acetate - Methanol -Acetone
-Siicagel 230- 400 mesh -Acid sunfuric đậm đặc
Tất cả hóa chất dử dụng thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích.
2.2. THỬ HOẠT TÍNH TRÊN HẠT THÔ.
Để chắc chắn rằng đề tài nghiên cứu đi đúng hướng, tránh sự lãng phí tiền bạc, mất nhiều thời gian khảo sát nhưng không đem lại kết quả, công việc đầu tiên được thực hiện là kiểm chứng lại kinh nghiệm dân gian về khả năng diệt côn trùng theo cách dân gian.
2.2.1. Đối tượng được chọn thử hoạt tính trên hạt thô.
Hai đối tượng côn trùng được chọn để thử hoạt tính thô là sâu xanh ăn rau cải, bọ cánh cam dưa leo. Cả 2 đối tượng đều được phát hiện trên rau cải 30 ngày tuổi và dưa leo 19 ngày tuổi.
Hình 2.21.. Sâu xanh rau cải và bọcánh cam dưa leo được chọn thử hoạt tính thô
2.2.2. Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành vào ngày 12/09/2012
Giã nát lần lượt 20, 50, 100 hạt bình bát đã phơi khô r ồi cho vào 250mL nước, khuấy trộn kỹ để dịch ép hòa tan hoàn toàn vào nước, ray qua một ray lọc để loại bỏ bã, dịch thu được cho vào bình xịt phun tia đem đi thừ hoạt tính.
2.2.3. Kết quả thử hoạt tính trên hạt thô
Bảng.2.2. Kết quả thử nghiệm hoạt tính thô trên sâu xanh và bọ cánh cam.
Số hạt Sâu xanh Bọ cánh cam
20 Có hiện tượng co thắt thân mình, bò đi chỗ khác rồi ẩn dưới lá.
Bay đi chỗ khác và không có dấu hiệu bị tác động.
50 Co thắt thân mình liên tục, sau 5 phút thì rớt xuống đất.
Lờ đờ, có dấu hiệu phản ứng với thuốc và sau đó bay đi chỗ khác.
100 Co thắt thân mình mạnh, liên tục, rớt xuống đất, nằm im và có dấu hiệu phản ứng với thuốc
Lờ đờ, nằm im sau đó bò ch ậm đến chỗ khác
Kết quả thử nghiệm cho thấy hạt bình bát có tác dụng đầu độc tương đối trên 2 đối tượng khảo sát, tuy không làm chết nhưng cả 2 đối tượng có dấu hiệu bị tác động bởi dịch ép. Có thể kết luận rằng hoạt tính diệt côn trùng có trong hạt bình bát.
2.3. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC[15]
2.3.1. Xử lí nguyên liệu
Trái bình bát chín không bị sâu bệnh, nấm mốc, vàng héo, úa dập. Để bảo quản hạt được lâu, tiện cho quá trình khảo sát thì hạt được tách lấy, rửa sạch rồi đem phơi khô dưới ánh nắng trực tiếp.
Hình 2.3.1: Hạt bình bát sau khi đã phơi khô
Hạt sau khi phơi khô được xay nghiền thành bột, quá trình này làm phá vỡ màng tế bào thực vật giúp cho dung môi dễ thấm vào cây, để dễ dàng chiết hết các hợp chất ra khỏi cây.
Hình 2.3.2: Hạt bình bát sau khi xay thành bột
2.3.2. Khảo sát sự hiện diện của các chất có hoạt tính sinh học bằng các thuốc thử hóa học.
2.3.2.1. Alkaloid Pha thuốc thử:
Thuốc thử Mayer: HgCl2 3.4g
KI 1.25g
Nước cất 250mL
Thuốc thử Bouchardat
I2 2.5g
KI 5g
Nước cất 10mL
Thuốc thử Dragendorff:
Dung dịch A:
Bi(NO3)2 85mg
CH3COOH 10mL
Nước cất 40mL
Dung dịch B:
KI 8g
Nước cất 20mL
Trộn hai dung dịch A và B khi dử dụng lấy 20mL dung dịch hỗn hợp A và B , thêm vào CH3COOH (20mL) và nước cất (100mL).
Tẩm 10g bột bình bát bằng NH4OH 25%, lắc với CHCl3, dung dịch lắc CHCl3lắc với H2SO4 2% ( 5mL x 3 lần ). Dịch acid dùng để định tính alkaloid bằ ng phản ứng tạo tủa với 3 thuốc thử Mayer, Bouchardart, Dragendorff.
Hình 2.3.2.1. Kết quả khảo sát alkaloid với 3 loại thuốc thử Mayer, Bouchardart, Dragendorff.
Nhận xét: cả 3 mẫu đều tạo thành dung dịch cho màu của thuốc thử mà không tạo thành tủa không có alkaloid
2.3.2.2. Khảo sát sự hiện diện của polyphenol
Cho vào ống nghiệm 0.5g bột nguyên liệu , thêm vào 50mL cồn etylic 700, dịch cồn được chia thành 2 phần để phân tích.
Xác định flavonnoid với thuốc thử Shibata :Dịch cồn cho thêm vào vài giọt HCl đậm đặc, sau đó cho thêm một ít bột Mg kim loại.
Kết quả có xuất hiện màu hồng có thể có flavonnoid.
Hình 2.3.2.2. Kết quả khảo sát flavonoid. 2.3.2.3 Xác định tannin
Dịch cồn được cô cách thủy bốc hơi cồn, sau đó chia làm 2 phần:
-Phần 1: dịch cồn được cô cách thủy, thêm dung dịch natri acetat và FeCl3 5%.
• Nếu có tannin pyrogalic cho tủa xanh đen.
• Nếu có tainin catechic cho tủa xanh lá.
-Phần 2: phản ứng với thuốc thử Stiasny ( formol và HCl).
• Tainin pyrogalic không cho tủa.
• Tainin catechic cho tủa bong.
Hình 2.3.2.3: Khảo sát sự hiện diện của tannin .
Phần 1: có xuất hiện kết tủa màu xanh lá trên bề mặt có thể có tannin catechic.
Phần 2: không cho tủa có thể có tannin pyrogalic.
2.3.2.4. Xác định Saponin
Cho 0.5g bột nguyên liệu thêm vào 5mL etylic 700, đun cách thủy 5ph rồi lọc . Dịch lọc cho vào 2 ống nghiệm có kích cỡ như nhau để khảo sát:
-Ống 1: 5mL HCl 0.1N và 3 giọt dung dịch ancol chứa mẫu thử.
-Ống 2: 5 mL NaOH 0.1N và 3 giọt dung dịch ancol chứa mẫu thử.
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống trong một phút và để yên quan sát các cột bong bóng trong 2 ống nghiệm. Nếu cột bọt trong 2 ống nghiệm cao bằng nhau và có độ bền như nhau thì có thể có saponin triterpenoid.
-Ống 1: sau khi lắc không có hiện tượng.
-Ống 2: sau khi lắc có bọt nhưng không bền.
Không có saponin
Bảng 2.3. Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất thiên nhiên có trong dịch chiết Loại dung dịch
chiết Thuốc thử Kết quả
Hợp chất thiên nhiên Etylic
700
H2SO4
25%
+ Mayer, Bouchardart,
Dragendorff Không tạo tủa Không Alkaloid
+ Sibata Có màu hồng Có flavonoid
+ Na2CO3 + FeCl3 3% kết tủa xanh lá Có tanin catechic
+ Stiasny Không cho tủa Có tanin pyrogalic
+ Lắc mạnh Không có bọt Không có saponin
2.4. ĐIỀU CHẾ CAO CHO TỪNG PHÂN ĐOẠN VÀ THỬ HOẠT TÍNH TRÊN CAO THÔ.
2.4.1. Chiết tách các hợp chất ra khỏi hạt và lấy cao cho từng phân đoạn.
Quá trình sử dụng dung môi để hòa tan hợp chất, chiết lấy chất là quá trình áp dụng phương pháp chiết rắn – lỏng[11]. Để điều chế một loạt các cao chiết có tính phân cực dần và mỗi cao chiết tương đối ít tạp chất giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh khiết được dễ dàng hơn cũng như c ần một lượng cao đủ để thử hoạt tính sinh hoc quá trình chiết hạt bình bát đư ợc thực hiện bằng phương pháp ngâm dầm với 5 loại dung môi lần lượt là : eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetate, methanol, nước.
Cân 1500g hạt bình bát đã xay thành b ột, cho bột cây vào một bình chứa bằng thủy tinh có nắp đậy.
Đầu tiên bột cây được chiết kiệt với eter dầu hỏa: rót eter dầu hỏa tinh khiết vào bình chứa bột bình bát cho đ ến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây ( thể tích eter dầu hỏa cần cho một lần chiết với 1500g bột là 4.5 lít) khuấy đều cho bột cây ngấm hoàn toàn dung môi. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau đó, dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc bằng máy lọc hút chân không, thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không ở 400C thu được cao chiết eter dầu hỏa. Dung môi sau khi được thu hồi được làm khan nước rồi tiếp tục sử dụng cho lần chiết tiếp theo. Làm tương tự cho lần chiết thứ hai, cao của hai lần chiết được gom lại đem cân được 244.15 g. Cao eter dầu hỏa chứa các loại hợp chất có tính không phân cực, là dung dịch dầu có màu vàng nhạt.
Bột cây còn lại được phơi khô cho bay hơi hết eter dầu hỏa rồi chiết tiếp với cloroform, quá trình chiết được thực hiện tương tự như chiết với eter dầu hỏa, dịch chiết cloroform được gộp chung lại, thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không ở 400C thu được 98.47 g cao cloroform có màu nâu nhạt. Cao cloroform chứa các loại hợp chất có tính phân cực trung bình.
Tiếp theo, bột cây được chiết với etyl acetate thu được 57.33 g cao etyl acetate có màu nâu đậm chứa các hợp chất có tính khá phân cực.