CƠ SỞ CỦA QUANG HÌNH HỌC. DỤNG CỤ QUANG HỌC
9.2. DỤNG CỤ QUANG HỌC
9.2.2. Kính hiển vi quang học
9.2.2.1. Nghiên cứu và cấu tạo
Nguyên lý chung của các dụng cụ hiển vi là sử dụng các loại thấu kính có khả năng làm thay đổi phương truyền của tia sáng hoặc của chùm điện tử (với kính hiển vi điện tử). Các thấu kính sử dụng với ánh sáng nhìn thấy thường làm bằng thuỷ tinh Flin hoặc Crao, với ánh sáng tử ngoại làm bằng thạch anh, với chùm tia điện tử bằng thấu kính tĩnh điện hay thấu kính từ.
Hiện nay có nhiều loại kính hiển vi quang học dùng trong nghiên cứu y sinh học. Tuỳ theo yêu cầu nghiên cứu, tính chất và đặc điểm của từng đối tượng nghiên cứu, người ta đã chế tạo các loại
kính hiển vi trường sáng, kính hiển vi trường tối, kính hiển vi tử ngoại, kính hiển vi phân cực, kính hiển vi huỳnh quang…
Tất cả các loại kính hiển vi quang học này về nguyên lý, cấu
tạo cơ bản giống nhau là dùng các hệ thấu kính hiển vi quang học đã khử hết quang sai và các hệ được đặt trên cùng một trục chính.
Hệ quang học gồm: kính tụ quang L1, vật kính L2 (đặt gần vật quang sát), thị kính L3 (đặt gần mắt) như hình (9.11). Ngoài ra còn có các bộ phận khác như gương
Hình 9.11. Sơ đồ cấu tạo kính hiển vi
phản chiếu ánh sáng (thường một mặt phẳng và một mặt lõm), các lăng kính phản xạ toàn phần để thay đổi phương truyền của tia sáng…
9.2.2.2. Kính hiển vi quang học trường sáng - Cấu tạo
S là nguồn phát ra ánh sáng trắng (ánh sáng tự nhiên, bóng đền điện…) các thấu kính làm bằng thuỷ tinh trong suốt.
- Nguyên tắc tạo ảnh
Hình 9.12. Dựng ảnh qua kính hiển vi
Nguyên tắc chung về dựng ảnh là sử dụng các định lụât quang hình như định luật truyền thẳng của ánh sáng, định luật khúc xạ ánh sáng khi đi vào thấu kính.
A1B1 là ảnh thật của vật AB qua vật kính, A2B2 là ảnh ảo của A1B1 qua thị kính. Để cho A2B2 làm ảnh ảo thì A1B1phải nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính. A3B3 là ảnh hiện lên võng mạc của mắt khi quan sát ảnh A2B2 của vật AB qua quang hệ. Để cho đỡ mỏi mắt khi quan sát, người ta thường phải di chuyển ống kính (chứa vật kính và thị kính) sao cho vật AB cách vật kính một khoảng cách thích hợp để A1B1
nằm đúng tiêu điểm F2 của thị kính, lúc đó mắt như quan sát ở vô cực - Độ phóng đại.
Gọi khoảng cách giữa tiêu điểm chính thứ hai của vật kính và tiêu điểm chính thứ nhất của thị kính là Δ,Δ là độ dài quang học của kính hiển vi.
f1 là tiêu cự của vật kính.
f2 là tiêu cự của thị kính.
Người ta đã chứng minh được độ phóng đại dài của kính hiển vi xác định theo công thức sau:
K = KV.KT =
2 1
0
. . f f
Δl
(9.11) Thường l0 = 25cm là khoảng nhìn rõ của mắt bình thường.
Công thức (9.11) cho thấy với Δ, l0 cố định thì kính hiển vi có tiêu cự càng ngắn, độ phóng đại càng lớn. Tuy nhiên việc giảm tiêu cự của vật kính và thị kính cũng bị giới hạn hiện tượng nhiễm xạ ánh sáng trong kính hiển vi, bởi vì với f1, f2
quá bé sẽ không còn khả năng phân biệt được hai điểm sáng nằm gần nhau. Nhưng dựa vào công thức (9.11), chúng ta có thể làm tăng năng suất phân ly của kính hiển vi bằng cách tăng chiết suất (n) của môi trường chứa vật quan sát hoặc tăng góc trông (u). Việc tăng góc u cũng chỉ có một giới hạn nhất định vì góc u quá lớn sẽ làm suất hiện hiện tượng quang sai. Biện pháp tốt nhất là tăng n.
Thường vật đem soi (tiêu bản) được đặt trên một tấm kính, phía trên đậy bằng một phiến kính mỏng (lamen) để bảo vệ tiêu bản. Do vậy ánh sáng từ vật phải qua lamen vào không khí rồi tới vật kính, cho nên nó bị khúc xạ ở mặt ranh giới giữa lamen và không khí (Hình 9.13)
Ta biết rằng chiết suất thuỷ tinh lớn hơn chiết suất không khí (ntt>nkk), nên khi ánh sáng đi từ thuỷ tinh ra không khí thì góc tới luôn nhỏ hơn góc khúc xạ,
khi góc tới lớn hơn góc tới giới hạn(i>ig) sẽ xảy ra hiện tượng phản xạ toàn phần.
Vậy nếu góc trông (cũng chính bằng góc tới) mà lớn hơn góc tới giới hạn (u≥ig).
Thì sẽ không có ánh sáng tới vật kính, nghĩa là không nhìn thấy vật. Mặt khác, khi u nhỏ thì năng suất phân ly của kính hiển vi nhỏ và độ dọi của ảnh nhỏ, ảnh sẽ mờ khi quan sát.
Muốn tăng góc trông u (tức là tăng góc tới i), người ta thường để vật kính chìm trong môi trường có chiết suất gần bằng chiết suất của thuỷ tinh, thí dụ như dầu xét có n ≈1,50=ntt hay dầu bá hương có n=1,4. Phương pháp này gọi là dùng vật kính chìm (hay vật kính dầu). Như vậy, việc dùng vật kính chìm sẽ tránh được hiện tượng phản xạ toàn phần, đồng thời độ dọi của ảnh cũng tăng và tăng năng suất phân ly của kính
Hình 9.13
hiển vi. Kết quả là sẽ quan sát được những chi tiết nhỏ của vật và thấy rõ vật hơn. Biện pháp này có thể tăng năng suất phân ly của kính hiển vi lên 4,5 lần.
Mặt khác, từ công thức dmin = 0,61λ/(n.sinu), chúng ta thấy khi chiếu sáng kính hiển vi bằng ánh sáng có bước sóng λ thì chỉ có thể phân giải được các điểm cách nhau một khoảng cỡ λ. Do đó, nếu vật có kích thước nhỏ hơn λ thì dù kính hiển vi có tinh xảo đến đâu cũng không phân giải được.
- Độ tương phản
Độ tương phản là sự khác nhau giữa cường độ sáng trên ảnh của vật và môi trường xung quanh hoặc giữa các phần khác nhau trên ảnh. Độ tương phản càng lớn thì ảnh càng rõ nét. Khi chiếu ánh sáng vào vật thì độ tương phản thể hiệ ở sự hấp thụ khác nhau giữa phần cần quan sát với môi trường xung quanh. Thí dụ, muốn quan sát nhân và bào tương của tế bào thì cường độ sáng đi qua nhân và bào tương phải khác nhau. Do đặc điểm riêng của cấu trúc, khả năng hấp thụ năng lượng của chúng sẽ khác nhau. Tuy nhiên trong thực tế có những đối tượng sống có mức độ hấp thụ năng lượng ánh sáng giống nhau với môi trường xung quanh, do vậy độ tương phản của ảnh kém. Để khắc phục nhược điểm này, người ta nhuộm vật nghiên cứu bằng thuốc thử thích hợp. Kết quả là độ tương phản của ảnh tăng rõ rệt.
Nhưng chú ý rằng, việc nhuộm tiêu bản sẽ làm chết tế bào nên không thể quan sát trực tiếp các hoạt động sống của tế bào.