Possible alternatives CRISPR-Cas9 included a transposase that predatedCRISPR-Cas9, as well as a newer dimeric that incorporated a pair of deactivated Cas9 (dCas) nucleases along with several other elements. The system, piggyBac, and the second system, Cas- CLOVER, underwent early development at Transposagen Biopharmaceuticals, which launched a trio of sister companies—
Hera BioLabs, Poseida, and Demeetra AgBio—to further the development of piggyBac and Cas-CLOVER for different applications. (Incidentally, Transposagen is now known as ―a Hera BioLabs company.‖)
Hera BioLabs was launched in 2014 and focuses on services in drug discovery and preclinical research. Poseida Therapeutics was also launched in 2014, and it focuses on cellular immunotherapies and gene therapies. Finally, Demeetra AgBio, which was launched in 2019, focuses on applications in industrial biotechnology and agriculture. This article focuses on Demeetra AgBio, which declares that its mission
is to ―optimize food production, enhance synthetic biotechnology, and open up a new world of therapeutics.‖
Các hệ thống chỉnh s a gen CRISPR-Cas9 đời đầu không thiếu sự táo bạo. Họ nhanh chóng thiết lập các tiêu chuẩn mới và dễ s dụng.
Họ thậm chí dường như cung cấp mức độ cao của và. Nhưng chẳng mấy chốc, sự thô lỗ bắt đầu cho thấy giới hạn của nó. Điều cần thiết ở v trí của nó là sự tinh tế. Các giải pháp thay thế khả thi CRISPR- Cas9 bao gồm một chuyển v có trước CRISPR-Cas9, cũng như một dime mới hơn kết hợp một cặp hạt nhân Cas9 (dCas) đã ngừng hoạt động cùng với một số yếu tố khác. Hệ thống, piggyBac và hệ thống thứ hai, Cas-CLOVER, đã trải qua quá trình phát triển ban đầu tại Transposagen Biopharmaceuticals, công ty này đã cho ra đời bộ ba công ty ch em—Hera BioLabs, Poseida và Demeetra AgBio—để tiếp tục phát triển piggyBac và Cas-CLOVER cho các mục đích khác nhau. các ứng dụng. (Nhân tiện, Transposeagen hiện được gọi là
―một công ty của Hera BioLabs.‖)
Hera BioLabs được thành lập vào năm 2014 và tập trung vào các d ch vụ khám phá thuốc và nghiên cứu tiền lâm sàng. Poseida Therapeutics cũng được ra mắt vào năm 2014 và nó tập trung vào liệu pháp miễn d ch tế bào và liệu pháp gen. Cuối cùng, Demeetra AgBio, được ra mắt vào năm 2019, tập trung vào các ứng dụng trong công nghệ sinh học công nghiệp và nông nghiệp. Bài viết này tập trung vào Demeetra AgBio, tuyên bố rằng nhiệm vụ của nó
là ―tối ưu hóa sản xuất lương thực, tăng cường công nghệ sinh học tổng hợp và mở ra một thế giới tr liệu mới.‖
Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn
Doubling up ... then bearing down
In CRISPR-Cas9 systems, the brashest bit is Cas9, an endonuclease that can target DNA sequences using little more than a single guide RNA (gRNA). Cas-CLOVER is not so easily loosed upon the genome. Cas-CLOVER utilizes two gRNAs and two fusion proteins, where each fusion protein consists of a deactivated Cas9 (dCas9) nuclease and a subunit of an obligate dimer nuclease called Clo051.
Because the activity of Clo051 is contingent upon its dimerization, DNA cleavage by Cas-CLOVER is strictly dependent on the simultaneous on-target binding of the two distinct gRNA-guided endonucleases. Moreover, the when the endonucleases bind, they must be within a specific distance of each other.
Tăng gấp đôi ... rồi giảm
Trong các hệ thống CRISPR-Cas9, bit mạnh nhất là Cas9, một endonuclease có thể nhắm mục tiêu các chuỗi DNA bằng cách s dụng ít hơn một RNA hướng dẫn đơn lẻ (gRNA). Cas-CLOVER không dễ dàng rời khỏi bộ gen. Cas-CLOVER s dụng hai gRNA và hai protein dung hợp, trong đó mỗi protein dung hợp bao gồm một nuclease Cas9 (dCas9) đã ngừng hoạt động và một tiểu đơn v của một nuclease dimer bắt buộc có tên là Clo051.
Do hoạt động của Clo051 phụ thuộc vào quá trình thu nhỏ của nó, nên quá trình phân tách DNA bằng Cas-CLOVER hoàn toàn phụ thuộc vào sự liên kết đồng thời trên đích của hai endonuclease được hướng dẫn bằng gRNA riêng biệt. Hơn nữa, khi các endonuclease liên kết, chúng phải ở trong một khoảng cách cụ thể với nhau.
―Even if one of the paired halves binds off-target, the nuclease will not cut or nick the genome,‖ says Jack Crawford, Demeetra AgBio‘s CEO. ―The paired halves have to come together at the intended site for cutting to occur.‖
Another advantage of Cas-CLOVER‘s dual-gRNA targeting system is that it can be used to obtain large deletions. Indeed, deletions of around 8–50 base pairs may be obtained, whereas CRISPR-Cas9 typically results in deletions of just 1–3 base pairs.
When deletions are larger, knockout edits are more likely to be full and clean. Also, large deletions can facilitate the identification of edited cells. Simple gel-based screening methods may suffice.
Jack Crawford, Giám đốc điều hành của Demeetra AgBio cho biết:
―Ngay cả khi một trong các n a được ghép nối liên kết ngoài mục tiêu, thì nuclease sẽ không cắt hoặc cắt bỏ bộ gen‖. ―Các n a được ghép nối phải đến với nhau tại v trí dự đ nh để cắt xảy ra.‖
Một ưu điểm khác của hệ thống nhắm mục tiêu gRNA kép của Cas- CLOVER là nó có thể được s dụng để thu được các lần xóa lớn.
Thật vậy, có thể xóa khoảng 8–50 cặp cơ sở, trong khi CRISPR-Cas9 thường dẫn đến việc xóa chỉ 1–3 cặp cơ sở.
Khi số lần xóa lớn hơn, các chỉnh s a loại bỏ có nhiều khả năng đầy đủ và rõ ràng hơn. Ngoài ra, việc xóa lớn có thể tạo thuận lợi cho việc xác đ nh các ô đã chỉnh s a. Các phương pháp sàng lọc dựa trên gel đơn giản có thể đủ.
Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn
Cultivating diversity
Cas-CLOVER works in multiple cell types. ―We validated it plant cells, CHO cells, yeast cells, and HEK293 cells, which are important for viral vector biomanufacturing,‖ Crawford elaborates. ―Cas- CLOVER can be used to engineer cell lines, yeast, algae, animals, or plants so that they express desired proteins and traits.‖
Crawford remarks that the biopharma industry can access Cas- CLOVER through a ―simple, single-source commercial license from Demeetra AgBio.‖ Licensing Cas-CLOVER in the bioprocessing field usually begins with contacting Demeetra AgBio to order reagents.
―Customers [then] have a period of time—we start with six months—
to test the technology internally,‖ Crawford notes. ―If they like it, they can convert to a commercial license.‖ Other options, such as a one-time fee, royalties, or milestone-based agreements, also are available to fit the size and needs of partners.
For example, one of Demeetra AgBio‘s partners wanted to increase its ability to select for high-yielding clones in CHO cells. ―It had at least 30 different cell lines, each of which might have different characteristics,‖ Crawford details. ―Using Cas-CLOVER, its team made glutamine synthetase knockouts in a matter of weeks.
Consequently, it now has a reliable selection system for high-yielding clones.‖
Other examples include partners that are using Cas-CLOVER to enhance glycosylation or antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanisms.
Nuôi dưỡng sự đa dạng
Cas-CLOVER hoạt động với nhiều loại ô. Crawford giải thích thêm:
―Chúng tôi đã xác nhận nó là tế bào thực vật, tế bào CHO, tế bào nấm men và tế bào HEK293, những tế bào này rất quan trọng đối với quá trình sản xuất sinh học vectơ virus. ―Cas-CLOVER có thể được s dụng để thiết kế các dòng tế bào, nấm men, tảo, động vật hoặc thực vật để chúng biểu hiện các protein và đặc điểm mong muốn.‖
Crawford nhận xét rằng ngành công nghiệp dược phẩm sinh học có thể truy cập Cas-CLOVER thông qua ―giấy phép thương mại đơn giản, một nguồn từ Demeetra AgBio.‖ Việc cấp phép Cas-CLOVER trong lĩnh vực x lý sinh học thường bắt đầu bằng việc liên hệ với Demeetra AgBio để đặt thuốc th .
―Khách hàng [sau đó] có một khoảng thời gian—chúng tôi bắt đầu với sáu tháng—để th nghiệm nội bộ công nghệ,‖ Crawford lưu ý.
―Nếu họ thích, họ có thể chuyển đổi sang giấy phép thương mại.‖
Các tùy chọn khác, chẳng hạn như phí một lần, tiền bản quyền hoặc thỏa thuận dựa trên cột mốc, cũng có sẵn để phù hợp với quy mô và nhu cầu của đối tác.
Ví dụ: một trong những đối tác của Demeetra AgBio muốn tăng khả năng chọn lọc các dòng vô tính năng suất cao trong các tế bào CHO.
―Nó có ít nhất 30 dòng tế bào khác nhau, mỗi dòng có thể có những đặc điểm khác nhau,‖ Crawford giải thích chi tiết. ―Nhờ s dụng Cas-CLOVER, nhóm của họ đã loại bỏ glutamine synthetase chỉ trong vài tuần. Do đó, giờ đây nó có một hệ thống lựa chọn đáng tin cậy cho các dòng vô tính năng suất cao.‖
Các ví dụ khác bao gồm các đối tác đang s dụng Cas-CLOVER để tăng cường quá trình glycosyl hóa hoặc cơ chế gây độc tế bào phụ thuộc vào kháng thể.
Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn
Flexible deliveries, scarless removals
In addition to Cas-CLOVER, Demeetra AgBio works with a proprietary piggyBac gene editing technology. Like Cas-CLOVER, this piggyBac technology is shared with Hera BioLabs and Poseida Therapeutics. The piggyBac DNA Delivery System is a transposon- based system that can introduce potentially very large genetic cargoes, such as therapeutic transgenes, to the genome. More specifically, for synthetic biotechnology in cell lines, yeast, and other microorganisms, piggyBac preferentially integrates genes of interest into highly expressed sites in the genome. ―piggyBac is the workhorse that gets large DNA cargo into the genome,‖ says Eric Ostertag, MD, PhD, executive chairman of Poseida Therapeutics and chairman of the board of Demeetra AgBio. Originally, piggyBac was used to engineer induced pluripotent stem cells, and now it is used with many cell types and organisms. Newer iterations, called Super piggyBac, contain ―hyperactive‖ mutations that greatly increase the activity of the enzyme.
Giao hàng linh hoạt, loại bỏ sẹo
Ngoài Cas-CLOVER, Demeetra AgBio hoạt động với công nghệ chỉnh s a gen piggyBac độc quyền. Giống như Cas-CLOVER, công nghệ piggyBac này được chia sẻ với Hera BioLabs và Poseida Therapeutics. Hệ thống phân phối DNA piggyBac là một hệ thống dựa trên transposon có thể đưa các hàng hóa di truyền rất lớn có khả năng, chẳng hạn như gen chuyển tr liệu, vào bộ gen. Cụ thể hơn, đối với công nghệ sinh học tổng hợp trong các dòng tế bào, nấm men và các vi sinh vật khác, piggyBac ưu tiên tích hợp các gen quan tâm vào các v trí được biểu hiện cao trong bộ gen. Eric cho biết: ―piggyBac là con ngựa thồ đưa hàng hóa DNA lớn vào bộ gen.
Ostertag, MD, Tiến sĩ, chủ t ch điều hành của Poseida Therapeutics và chủ t ch hội đồng quản tr của Demeetra AgBio. Ban đầu, piggyBac được s dụng để tạo ra các tế bào gốc đa năng cảm ứng, và hiện nay nó được s dụng với nhiều loại tế bào và sinh vật. Các phiên bản mới hơn, được gọi là Super piggyBac, chứa các đột biến ―hiếu động‖ làm tăng đáng kể hoạt động của enzym.
Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn
Looking back, looking ahead
―I founded Transposagen Biopharmaceuticals about 20 years ago as a pioneering gene therapy company,‖ Ostertag states. He had worked with viruses and a retrotransposon as the first graduate of the University of Pennsylvania‘s gene therapy program. This experience convinced him that gene therapy would never be fully successful if it relied on adeno-associated viruses or other viral-based technologies for gene delivery.
―To solve some of the problems of viruses, we started stripping out some of the viral components,‖ Ostertag recalls. ―But I realized that approach wouldn‘t be able to solve all the problems, and that it could actually create new ones, such as losing the ability to stably integrate into the genome. ―Therefore, I started working on a completely nonviral solution using nanoparticles. However, we still needed a safe way to integrate potentially large pieces of DNA into the genome. The solution was piggyBac.‖ During that time, site-specific genome editing technologies were evolving. For example, systems based on zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and then CRISPR nucleases were introduced. ―We immediately recognized the value of CRISPR-Cas9, as well as its disadvantages,‖ Ostertag says. ―And we began working on alternatives that would eliminate the disadvantages.‖
Nhìn lại, nhìn về phía trước
Ostertag nói: ―Tôi đã thành lập Transposeagen Biopharmaceuticals khoảng 20 năm trước với tư cách là một công ty tiên phong về liệu pháp gen. Anh ấy đã làm việc với virus và retrotransposon khi là người đầu tiên tốt nghiệp chương trình liệu pháp gen của Đại học Pennsylvania. Kinh nghiệm này đã thuyết phục anh ấy rằng liệu pháp gen sẽ không bao giờ thành công hoàn toàn nếu nó dựa vào vi-rút liên quan đến adeno hoặc các công nghệ dựa trên vi-rút khác để chuyển gen.
Ostertag nhớ lại: ―Để giải quyết một số vấn đề về vi-rút, chúng tôi bắt đầu loại bỏ một số thành phần của vi-rút. ―Nhưng tôi nhận ra rằng cách tiếp cận đó sẽ không thể giải quyết được tất cả các vấn đề và nó thực sự có thể tạo ra những vấn đề mới, chẳng hạn như làm mất khả năng tích hợp ổn đ nh vào bộ gen. ―Vì vậy, tôi bắt đầu nghiên cứu một giải pháp hoàn toàn phi vi-rút bằng cách s dụng các hạt nano.
Tuy nhiên, chúng tôi vẫn cần một cách an toàn để tích hợp các đoạn DNA lớn tiềm năng vào bộ gen. Giải pháp là piggyBac.‖ Trong thời gian đó, các công nghệ chỉnh s a bộ gen dành riêng cho từng đ a điểm đã phát triển. Ví dụ: các hệ thống dựa trên các hạt nhân ngón tay kẽm, các hạt nhân hiệu ứng giống như bộ kích hoạt phiên mã và sau đó là các hạt nhân CRISPR đã được giới thiệu. Ostertag nói:
―Chúng tôi ngay lập tức nhận ra giá tr của CRISPR-Cas9, cũng như những nhược điểm của nó. ―Và chúng tôi bắt đầu nghiên cứu các giải pháp thay thế có thể loại bỏ những nhược điểm.‖
Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn
The alternatives developed by Ostertag and his colleagues include the Cas-CLOVER and piggyBac systems. Today, these systems are being advanced in different contexts by Hera BioLabs, Poseida Therapeutics, and Demeetra AgBio. A key challenge, says Demeetra AgBio‘s Crawford, is ―getting the message out about Cas-CLOVER and validating this system for other applications, such as afucosylated antibodies and other antibodies used in bioprocessing.‖ ―We can license the Cas-CLOVER system in our fields of use,‖ Crawford says, ―but we also offer reagents and cell lines in those same fields of use.‖ Demeetra AgBio is also building an in-house program to develop analogs to cannabinoid therapeutics. He relates, ―We‘re in preclinical testing for our lead compounds.‖ Beyond cannabinoids, the company is interested in using afucosylated CHO cells to make biosimilars and what it calls bio-betters. For example, it can use Cas- CLOVER to knock out certain genes to change the glycosylation of antibodies, which can then be enhanced.
Crawford expects to introduce new, more efficient variants of Cas- CLOVER around the end of the year. ―In a head-to-head comparison, they‘re much better than CRISPR-Cas9,‖ he asserts.
Các giải pháp thay thế được phát triển bởi Ostertag và các đồng nghiệp của ông bao gồm các hệ thống Cas-CLOVER và piggyBac.
Ngày nay, các hệ thống này đang được cải tiến trong các bối cảnh khác nhau bởi Hera BioLabs, Poseida Therapeutics và Demeetra AgBio. Crawford của Demeetra AgBio cho biết, thách thức chính là
―truyền tải thông điệp về Cas-CLOVER và xác thực hệ thống này cho các ứng dụng khác, chẳng hạn như kháng thể afucosylated và các kháng thể khác được s dụng trong quá trình x lý sinh học.‖ ―Chúng tôi có thể cấp phép cho hệ thống Cas-CLOVER trong các lĩnh vực s dụng của chúng tôi,‖ Crawford nói, ―nhưng chúng tôi cũng cung cấp thuốc th và các dòng tế bào trong cùng các lĩnh vực s dụng đó.‖
Demeetra AgBio cũng đang xây dựng một chương trình nội bộ để phát triển các chất tương tự với liệu pháp cannabinoid. Anh ấy kể lại,
―Chúng tôi đang trong quá trình th nghiệm tiền lâm sàng đối với các hợp chất chì của chúng tôi.‖ Ngoài cannabinoids, công ty còn quan tâm đến việc s dụng các tế bào CHO afucosylated để tạo ra các chất tương tự sinh học và cái mà họ gọi là chất tốt hơn sinh học. Ví dụ, nó có thể s dụng Cas-CLOVER để loại bỏ một số gen nhất đ nh để thay đổi quá trình glycosyl hóa kháng thể, sau đó có thể được tăng cường.
Crawford hy vọng sẽ giới thiệu các biến thể mới, hiệu quả hơn của Cas-CLOVER vào khoảng cuối năm nay. Ông khẳng đ nh: ―Trong một so sánh đối đầu, chúng tốt hơn nhiều so với CRISPR-Cas9.