6.1. LÝ THUYẾT
Tính chất háo nước của Protein thô trong thực phẩm?
Tiêu chuẩn của FAO/WHO về hệ số protein đối với thực phẩm?
Các phương pháp xác định protein thô trong thực phẩm?
Nguyên lý của phương pháp Kjeldahl?
Tất cả các dạng Nito trong cơ thể, hay các mô, các tế bào được gọi là Nito tổng số. Nito có trong thành phần amino acid của protein được gọi là Nito Protein. Nito không có trong thành phần của protein như các muối vô cơ, acid nitric, ure, amino acid tự do,... được gọi là Nito phi Protein.
Nói một cách khác, nito tổng số bao gồm nito protein và nito phi protein.
Do đó, quá trình xác định hàm lượng nito tổng số được thực hiện theo nguyên tắc vô cơ hóa mẫu để chuyển nito trong mẫu về dạng NH3. Xác định hàm lượng NH3 tạo thành sẽ tính toán được hàm lượng nito tổng có trong mẫu.
Mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác. Phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
2H2SO4 → 2H2O + 2SO2↑ + O2
Các chất chứa Nito ⎯⎯ →H2SO⎯4 NH3
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Dùng dung dịch NaOH đuổi NH3 ra khỏi dung dịch:
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + H2O + 2NH3↑
Khi NH3↑ bay sang bình hứng có chứa dung dịch H2SO4 (đã biết trước nồng độ, thể tích) thì sẽ được ngưng tụ:
2NH3 + 2H2O → 2NH4OH
2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O
Định phân lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH, từ đó ta xác định được lượng H2SO4 đã phản ứng và tính được hàm lượng nitơ tổng có trong mẫu.
6.2. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ 1 bộ Microkjeldahl
1 bình Kjeldahl, giá đỡ bình 1 bếp điện, 1 lưới amiang 1 bếp đun bình cầu
1 burette 25mL, 1 giá đỡ burette 1 pipet 10mL
3 erlen 250mL 1 erlen 100mL
1 bình định mức 100mL.
1 becher 250mL.
1 bóp cao su
1 phễu thủy tinh nhỏ 6.3. HÓA CHẤT
Mẫu thực phẩm Dung dịch H2SO4 đđ K2SO4: 150g
CuSO4: 13.5g Phenolphtalein 0.1%
200 mg metyl đỏ 100 mg xanh metylen 200mL etanol 96%
Dung dịch H2SO4 0.1N.
Dung dịch NaOH 50%.
6.4. TIẾN HÀNH
Hình 6.1. cấu tạo hệ thống Microkjedahl 6.4.1. Chuẩn bị hóa chất
Chất xúc tác: Có thể dùng 1 trong các hỗn hợp xúc tác sau đây: 50g K2SO4 +
6.4.2. Vô cơ hóa mẫu
Cân khoảng 1 gam mẫu sau khi trộn đều với độ chính xác 0.001g (ví dụ: đồ hộp cá thịt) cho vào bình Kjeldahl với 20mL H2SO4 đậm đặc và khoảng 2g hỗn hợp chất xúc tác. Đậy bình bằng phễu nhỏ.
Để nghiêng bình Kjeldahl 450 trên bếp điện đun từ từ cho đến khi nhiệt độ của quá trình phân giải đạt nhiệt độ 4000C (quá trình có thể thực hiện trên bếp điện hay có thể bằng bộ phân giải chuyên dùng). Đun sôi cho đến khi dung dịch trong suốt có màu xanh lơ của CuSO4, để nguội.
6.4.3. Chưng cất
Chuẩn bị bình hứng: hút 50.0 mL H2SO4 0.1N cho vào erlen 100mL. Cho thêm 3 – 4 giọt MR vào erlen. Lắp erlen vào dưới ống sinh hàn sao cho đầu ống sinh hàn ngập vào trong dung dịch.
Chuẩn bị dịch chưng cất: Chuyển dung dịch đã vô cơ hóa trong bình Kjeldahl vào bình chưng cất của máy cất đạm, tráng nhiều lần dung dịch phân giãi bằng nước cất rồi chuyển vào bình chưng cất, thêm 5 giọt chỉ thị phenolphtalein 0.1%. Trung hòa dung dịch trong bình chưng cất bằng NaOH 30% (Phải trung hòa từ từ vì đây là phản ứng giữa axit mạnh và baz mạnh ở nồng độ đậm đặc nên xảy ra rất mạnh) cho đến khi dung dịch trong bình chuyển màu hồng (có thể nhận biết bằng sự xuất hiện của kết tủa đồng có màu xanh đen). Sau đó cho thêm 2mL dung dịch NaOH 30% và khóa phễu lại. Cho vào một ít nước cất lên phễu để kiểm tra độ kín của thiết bị
Chưng cất: Cho 800mL nước cất vào bình đun. Mở nước của ống sinh hàn.
Chưng cất liên tục 40 phút kể từ khi bình bắt đầu sôi. Hạ bình hứng. Rửa sạch đầu ống sinh hàn bằng nước cất. Đặt giấy pH sát miệng ống sinh hàn. Nếu giấy pH không đổi màu thì quá trình chưng cất đã hoàn tất. (Trong suốt quá trình chưng cất thì màu của bình hứng NH3 phải không đổi màu, nếu chuyển qua màu xanh dương có nghĩa là lượng axit dung hấp thụ bị thiếu, khi đó phải làm lại và tăng lượng axit lên)
Định lượng H2SO4 dư trong bình hứng bằng dung dịch NaOH 0.1N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ.
Tiến hành xác định mẫu trắng với các bước như trên nhưng không có mẫu thử.
6.4.4. Tính kết quả
Hàm lượng Nito toàn phần:
Nito toàn phần (%) =
d V
V N V N
.
100 ) (
014 .
0 1 1− 2 2
Trong đó:
V1 : Số mL H2SO4 0.1N cho vào bình hứng để kết hợp với NH3.
N1 : Nồng độ đương lượng của dung dịch H2SO4 cho vào bình hứng (=0.1N) V2 : Số mL NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ H2SO4 dư.
N2 : Nồng độ đương lượng dung dịch NaOH dùng để chuẩn độ (=0.1N) V : Thể tích mẫu thử tính bằng mL.
100: Quy đổi về %
0.014: Khối lượng của 1 mdlg N
d : Là khối lượng riêng của 1mL dung dịch cần xác định (nếu mẫu là chất rắn thì thay V.d = mbd khối lượng mẫu ban đầu)
Hàm lượng Protein thô (%) = (Nito toàn phần) x K Trong đó, K là hệ số quy đổi từ %Nito sang %Protein:
K = 6.25 ứng với mẫu là nước mắm, thịt,cá...
K = 5.85 nếu mẫu là ngủ cốc, rau, quả
K = 6.38 nếu mẫu là sữa, fomat những sản phẩm tương tự
Chú ý: Trường hợp thực phẩm có chứa nitrat, phải phân tích nitrat riêng và kết quả nitơ hữu cơ chính là hiệu số giữa nitơ toàn phần và nitơ trong nitrat. Hàm lượng protein bằng kết quả nitơ hữu cơ nhân với 6.25
6.4.5. Câu hỏi chuẩn bị
Vô cơ hóa mẫu nghĩa là gì? Viết phương trình phản ứng xảy ra trong quá trình vô cơ hóa mẫu.
Viết phương trình phản ứng xảy ra trong quá trình chưng cất và chuẩn độ mẫu.
Có những dạng cải biên nào của hệ thống Kjeldahl. Nêu đặc điểm của các hệ thống đó.
Protein thô có đặc tính chung là gì? Việc kiểm tra hàm lượng protein thô có ý nghĩa như thế nào đối với sản phẩm thực phẩm.