CHƯƠNG 3: CÁC KỸ THUẬT CHUẨN BỊ MẪU TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
3.5 KỸ THUẬT TRÍCH LY THƯỜNG SỬ DỤNG KHI XỬ LÝ MẪU 50
3.5.2 Một số kỹ thuật trích ly thường dùng trong xử lý mẫu phân tích
▪ Chiết lỏng – lỏng: chất phân bố từ pha lỏng ban đầu được chiết bởi pha dung môi lỏng
▪ Chiết rắn – lỏng: chất phân bố ban đầu ở pha rắn được chiết bởi pha dung môi lỏng
▪ Chiết lỏng – rắn (chiết pha rắn): chất phân bố ban đầu ở pha lỏng được chiết bởi pha rắn
Dựa theo kỹ thuật chiết:
▪ Chiết gián đoạn: lượng dung môi được chia thành làm nhiều phần, để tiến hành chiết nhiều lần nhằm tăng hiệu suất chiết. Trong kỹ thuật này dụng cụ được sử dụng là phễu chiết
▪ Chiết liên tục: pha dung môi và pha chứa chất tách tiếp xúc liên tục với nhau bằng cách là cho 2 pha di chuyển liên tục ngược chiều nhau hoặc cho một pha chuyển động còn một pha đứng yên. Dụng cụ được sử dụng trong chiết lỏng – lỏng: perforator, còn trong chiết rắn – lỏng: soxhlet.
3.5.2.1 Kỹ thuật trích ly tĩnh
Kỹ thuật trích ly này khá đơn giản, không cần thiết bị phức tạp, mà chỉ cần một số phễu trích ly (dung tích 100, 250, 500 mL) là có thể tiến hành được ở mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc trích ly có thể thực hiện bằng tay, hay bằng máy lắc nhỏ. Hiện nay, người ta đã cung cấp các hệ trích ly đơn giản có 6, 9 hay 12 phễu với máy lắc nhỏ, nên việc thực hiện trích ly cũng dễ dàng và dễ đồng nhất điều kiện.
Kỹ thuật trích ly tĩnh đơn giản, dễ thực hiện nên nó được ứng dụng phổ biến và rất có hiệu quả trong lĩnh vực tách trích ly phân tích hay làm giàu các chất phân tích phục vụ cho việc xác định hàm lượng vết. Nhất là tách và làm giàu các kim loại, các chất hữu cơ, HCBVTV độc hại trong các mẫu nước, nước thải, nước biển, v.v.
3.5.2.2 Kỹ thuật trích ly dòng chảy liên tục
Trong kỹ thuật này, khi thực hiện trích ly, hai pha lỏng không trộn được vào nhau (hai dung môi, có một dung môi có chứa chất phân tích) được bơm liên tục và đi ngược chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ trích ly, như phễu trích ly, hay bình trích ly liên hoàn đóng kín để chúng tiếp xúc với nhau.
Hoặc cũng có thể chỉ một dung môi chuyển động, còn một pha đứng yên trong bình. Khi đó, chất phân tích sẽ được phân bố vào hai dung môi theo tính chất
BM Quản lý Chất lượng Thực phẩm Trang 54 của chúng, để đạt đến trạng thái cân bằng. Trích ly theo kỹ thuật này hiệu suất cao hơn so với kỹ thuật trích ly tĩnh. Đây là phương pháp trích ly được ứng dụng trong trích ly sản xuất công nghệ.
Để thực hiện kỹ thuật trích ly này, phải có hệ thống máy trích ly, cột trích ly hay bình trích ly, bơm để bơm các chất theo dòng chảy ngược chiều nhau với tốc độ nhất định thích hợp, hoặc chỉ một chất, hay cả 2 chất chuyển động ngược chiều nhau, và phải có bộ tách pha, để tách các chất ngay trong quá trình trích ly, để thu chất được trích ly ra liên tục, hay theo từng thời điểm (chu kỳ) nhất định, mà cân bằng trích ly đạt được.
3.5.2.3 Kỹ thuật trích ly lỏng - lỏng
Nguyên tắc của kỹ thuật trích ly này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ trích ly, như phễu trích ly, bình trích ly. Vì thế hệ số phân bố nhiệt động Kcủa cân bằng trích ly là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự trích ly. Kếđến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH của môi trường trích ly.
Trích ly theo kỹ thuật này có hai loại là trích ly tĩnh và trích ly theo dòng chảy liên tục. Trong phân tích, kỹ thuật trích ly tĩnh được ứng dụng nhiều hơn, vì sự đơn giản của nó.
❖ Cân bằng khi trích ly chất phân bố S từ pha thứ nhất sang pha thứ hai Trong quá trình trích ly, chất tan S phân bố giữa 2 pha. Khi đạt trạng thái cân bằng: S1 ↔ S2
Theo định luật phân bố ta có
Gọi: + pha ban đầu và pha trích ly tương ứng là 1 và 2 + n là số mol chất S có trong pha 1
+ V1, V2 là thể tích pha 1 và pha 2
+ q1 là % số mol chất tan S còn lại ở pha 1 sau lần trích ly thứ nhất
Khi đó, ; ;
Do đó, ta được:
Nếu tiếp tục trích ly lần thứ 2, q2 là % số mol chất tan S còn lại ở pha 1 sau lần trích ly thứ hai thì
Tiếp tục như vậy, % số mol chất tan S còn lại ở pha 1 sau lần trích ly thứ n là
Do qn < qn-1 <. ..< q1 < 1, nếu n đủ lớn thì qn ≈ 0. Quá trình trích ly được xem như hoàn toàn.
❖ Ảnh hưởng của pH đối với chất phân bố là acid hữu cơ
Trong môi trường nước, acid hữu cơ (HA) phân ly theo phương trình:
HA ↔ H+ + A- Hay
Khi đó nồng độ axit HA trong pha 1 là Khi đó,
Và
❖ Ảnh hưởng của pH đối với chất phân bố là bazo hữu cơ
Trong môi trường nước, bazo hữu cơ (HA) phân ly theo phương trình:
B + H+↔ BH+ Hay
BM Quản lý Chất lượng Thực phẩm Trang 56 Khi đó,
Và
3.5.2.4 Kỹ thuật trích ly rắn - lỏng
Vào năm 1879, Franz Soxhlet đã giới thiệu thiết bị trích ly mà sau này được đặt tên của ông dùng để tách chất béo từ thực phẩm. Kỹ thuật này nhận được nhiều sự quan tâm vì sự trích ly kéo dài được thực hiện mà không cần giám sát.
Từ đó, việc trích ly các hợp chất hóa học được chú trọng vào dung môi hữu cơ thích hợp là một trong các phương pháp phổ biến nhất trong phân tích thực phẩm vì không cần quá trình lọc, nhiệt độ trích ly cao hơn nhiệt độ phòng, mẫu sẽ liên tục đi vào dung môi mới và có thể sử dụng cả dung môi phân cực lẫn không phân cực. Bất lợi của kỹ thuật này là đòi hỏi một lượng lớn dung môi (300 – 500 ml), dung môi cần phải bay hơi để giúp quá trình loại bỏ dung môi được dễ và quá trình thực hiện kéo dài nhiều giờ hay nhiều ngày mới có thể hoàn tất.
Trích ly Soxhlet là một kỹ thuật trích ly bán liên tục với pha mẫu là ở trạng thái rắn: bột, hạt dạng mảnh, dạng lá. Còn dung môi trích ly (chất hữu cơ) là ở dạng lỏng. Ví dụ như trích ly lấy dầu melton từ lá cây bạc hà bằng dung môi hữu cơ n-hexan, hay benzen. Trích ly các thuốc trừ sâu hay hợp chất bảo vệ thực vật trong mẫu rau quả, mẫu đất bằng n-hexan.
Vì thế đây là kỹ thuật trích ly của hệ dị thểmà chất phân tích ở trong mẫu rắn, bột, lá, sợi, v.v mà các kỹ thuật trích ly đã nêu ở trên không làm được tốt, đặc biệt là trích ly các chất hữu cơ trong các mẫu không ở dạng lỏng (hệ trích ly dị thể) nên kỹ thuật này có tên gọi là kỹ thuật trích ly rắn – lỏng.
❖ Thiết bị :
▪ Thiết bị của kỹ thuật trích ly này có hai loại là:
✓ Các hệ trích ly Soxhlet thường và đơn giản.
✓ Các hệ trích ly Soxhlet tự động (Auto-Soxhlet).
▪ Kỹ thuật trích ly theo hệ loại 1 là đơn giản, vận hành bằng tay, còn kỹ thuậttrích ly theo hệ máy loại 2 là vận hành một cách tự động theo chương trình.
❖ Ưu nhược điểm và phạm vi ứng dụng
Kỹ thuật trích ly này có ưu điểm là trích ly triệt để, song các điều kiện trích ly phải nghiêm ngặt và thời gian trích ly cũng dài, thì mới có kết quả trích ly tốt. Vì thế hệ thống vận hành tự động (auto-Soxlet) cho kết quả tốt hơn. Nó thích hợp cho việc trích ly lượng vết các chất hữu cơ, nhất là các chất độc hại từ các đối tượng mẫu khác nhau, chất phân tích có trong mẫu ở trạng thái rắn, bột, vật mẫu xốp khô (lá cây), v.v. Kỹ thuật trích ly này được ứng dụng chủ yếu để trích ly các HCBVTB từ các mẫu cây, lá, rau quả, thực phẩm, mẫu đất.
Ngày nay, kỹ thuật được cải tiến bằng cách sử dụng kỹ thuật siêu âm để hỗ trợ. Đó là kỹ thuật trích ly siêu âm. Nguyên tắc chung chung của kỹ thuật này cũng vẫn dựa trên cơ sở chung của kỹ thuậttrích ly là sự phân bố của chất vào hai pha không trộn lẫn vào nhau, chỉ có khác là ở đây được thực hiện trong môi trường có thêm tác dụng của năng lượng sóng siêu âm. Pha chứa mẫu phân tích cần trích ly là pha nước và pha lỏng để trích ly chất phân tích là dung môi hữu cơ (pha thứ hai) đều được cho vào bình trích ly, sau đó được đặt vào trong hộp trích ly của hệ trích lydưới tác dụng của sóng siêu âm thích hợp trong một thời gian nhất định (1,5 - 2 giờ). Kỹ thuật trích ly này có thể được thực hiện ở hai trạng thái mẫu đồng thể và dị thể.
3.5.2.5 Kỹthuật trích ly lỏng có áp lực (PFE)
Kỹ thuật này sử dụng dung môi được tăng tốc gần tới vùng chảy tới hạn, khi đó khả năng trích ly tốt hơn. Ở nhiệt độ cao, tốc độ trích ly tăng do độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi giảm trong khi tính hòa tan và tốc độ khuyếch tán của nó vào mẫu tăng lên. Áp suất giữ cho dung môi nằm ở dưới
BM Quản lý Chất lượng Thực phẩm Trang 58 điểm sôi và khiến nó xâm nhập qua các lỗ nhỏ trên bề mặt mẫu. Sự kết hợp giữa nhiệt độ cao và áp suất đem lại hiệu quả trích ly cao hơn, do đó sẽ tối thiểu hóa lượng dung môi sử dụng và giúp trích ly triệt để hơn. Thời gian cần trích ly trên thực tế có sự độc lập với khối lượng mẫu và hiệu quả trích ly chủ yếu phụ thuộc vào nhiệt độ. Hình 2 là một mô hình thiết bị PFE.
Mẫu được cho vào ngăn trích ly bằng thép không rỉ mà tại đó dung môi được bơm vào và đưa lên nhiệt độ và áp suất xác định. Thông thường nhiệt độ được giữ trong khoảng từ 80ºC đến 200ºC và áp suất trong khoảng từ 10 đến 20 MPa. Các điều kiện này được giữ nguyên trong vài phút để tạo sự dịch chuyển ổn định chất phân tích từ mẫu vào dung môi. Dịch trích ly được đẩy vào ống thu nhận bởi một lượng dung môi thứ 2 và lượng dung môi thứ 2 này cũng được đẩy vào ống đó bởi một dòng khí trơ. Toàn bộ quá trình diễn ra trong 15 – 20 phút.
Khi thao tác với mẫu ẩm, để tránh hiện tượng vón cục, có thể sử dụng điatomit (kizegua). Điatomit khi tro hóa có chứa khoảng 65 – 87% SiO2, 2,3 – 11,7% Al2O3, gần 3% Fe2O3 và vết CaO, MgO, Na2O và K2O.
Phương pháp thực hiện thường cho kết quả trung thực vì các điều kiện gần giống như trích ly bằng Soxhlet
Hình 3.1 Mô hình thiết bị PFE
(a) Bình chứa dung môi, (b) Bơm, (c) Van lọc, (d) Ngăn trích ly, (e) Lò nung, (f) Van cố định, (g) Ống thu nhận, (h) Lỗ thông khí, (i) Bình khí trơ Trích ly lỏng có áp lực được ứng dụng chủ yếu trong kiểm soát các thông số ô nhiễm và gần đây là tiền xử lý thực phẩm. Bảng 6 giới thiệu một vài ứng dụng của nó.
Bảng 3.3 Trích ly lỏng có áp lực trong phân tích thực phẩm
Thực phẩm Chất phân tích Dung môi t (0C) / p (MPa)
Rau quả, bột Thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ
Hexane+10%
acetone, acetonitrile 125/10 Rau quả, nước ép
trái cây, bột
Thuốc trừ sâu chứa
Photpho hữu cơ Ethyl acetate 100/10,4 Rau quả, trái cây n -Methylcarbamate Acetonitrile 100/13,8
Trái cây Polyphenol Methanol 40/6,9
Dược phẩm Vitamin K1
BM Quản lý Chất lượng Thực phẩm Trang 60 Thức ăn trẻ em
Chlorpyrifos, malathion, 4.4’-DDE,
4,4’–DDT
Acetonitrile 80/13,8
Thịt xông khói Hydrocarbon chứa vòng thơm
Methylene chloride
+ 10% acetonitrile 80/10 Cá
Chất béo, polychlorinated
biphenyls
Hexane 125/10
Cá
Arsenobetaine, arsenocholine, dimethylarsenic acid
Methanol + 50%
H2O
Cá Hợp chất có mùi Hexane-ethyl
acetate 80/10
Thịt Chất béo Hexane 125/10
Bột ngũ cốc, thịt
gà, trứng Axit béo
Isopropyl alcohol + hexane-methanol +
chloroform
120/0,8
Bột sữa Chất béo
Hexane + methylene + chloride +
methanol
80/10,4 Dầu gan cá tuyết,
bột sữa, thức ăn gia súc
Polychlorinated
biphenyls Hexane 100/10,3
Sản phẩm từ sữa, thịt, bột ngũ cốc, chất béo và dầu
Chất béo Ether dầu hỏa 100/13,8
thực vật.
Malt Proanthocyanidins Acetone + 20% H2O 60/100 So sánh giữa trích ly lỏng có áp lực với phương pháp Soxhlet, ưu điểm của nó là giảm lượng dung môi sử dụng và thời gian trích ly nhưng nhược điểm là sử dụng thiết bị dụng cụ chuyên dụng rất đắt tiền nhằm đảm bảo sự an toàn tránh mối nguy do dung môi bị quá nhiệt và dụng cụ chịu áp suất cao.
3.5.2.6 Kỹ thuật trích dòng siêu chảy (SFE)
Trích ly bằng dòng siêu chảy với thực phẩm được giới thiệu nhiều năm trước đây trên quy mô công nghiệp nhưng nó chỉ được ứng dụng vào công đoạn chuẩn bị mẫu phân tích vào thời gian gần đây.
Dung môi sử dụng là một dòng siêu chảy, là một chất nằm ở trạng thái có nhiệt độ và áp suất tới hạn, tạo nên những tính chất kết hợp đặc biệt. Dòng siêu chảy khuếch tán qua chất rắn cũng như chất khí nhưng có thể hòa tan chất phân tích ở pha lỏng, để tốc độ trích ly tăng và ít bị tổn thất nhiệt. Ngoài ra, nhiều quá trình tiền xử lý mẫu có thể thực hiện với dòng siêu chảy không bị nhiễm bẩn, không gây ngộ độc, chẳng hạn như CO2, là sự lựa chọn hoàn hảo so với việc phải chấp nhận những nguy cơ tiềm tàng và sử dụng dung môi đắt tiền trong trích ly bằng Soxhlet.
Tốc độ thấm nhanh của dòng siêu chảy vào thực phẩm, ngay cả khi độ xốp thấp, cho phép sự thẩm thấu ngược các chất cần phân tích một cách nhanh chóng, làm giảm thời gian trích ly. Công đoạn hoàn tất diễn ra dưới 20 phút thay vì nhiều giờ đồng hồ như trong trích ly lỏng – rắn truyền thống. Kỹ thuật này cũng được sử dụng đối với các chất phân tích không ổn định nhiệt khi chọn dòng siêu chảy với nhiệt độ tới hạn thấp.
Một trong tính chất thú vị nhất của các dòng chảy này là mối liên quan trực tiếp giữa nồng độ dung môi với tỷ trọng. Do tỷ trọng của dòng chảy là một
BM Quản lý Chất lượng Thực phẩm Trang 62 hàm của nhiệt độ và áp suất nên điều chỉnh chính xác các thông số này sẽ cho phép sử dụng được một dung môi có khoảng nồng độ hòa tan thấp. Từ đó cho phép thay thế nhiều loại dung môi truyền thống với một dòng siêu chảy duy nhất. Ví dụ như CO2 siêu chảy ở 7,515 Mpa và 80ºC (d = 0,15 g/ml) được xem như một dung môi có độ hòa tan cao như những chất khí như pentan, trong khi ở 38,265 Mpa và 40ºC (d = 0,95 g/ml) độ hòa tan của nó gần giống như các chất lỏng chẳng hạn như metylen clorua, cacbon tetraclorua, toluen hay benzen. Khi chọn áp suất trích ly, cần lưu ý là khi tăng áp suất, hợp chất có khối lượng phân tử cao hơn sẽ trở thành chất tan, trong khi giảm áp suất dòng siêu chảy sẽ mất đi một vài phần khả năng hòa tan của nó. Nếu giảm áp suất đến áp suất khí quyển, dòng chảy sẽ mất gần như toàn bộ khả năng hòa tan và những hợp chất đã trích ly sẽ tách ra khỏi dung dịch.
Nước là một lựa chọn kém với kỹ thuật này vì nhiệt độ và áp suất tới hạn cao của nó. Dòng siêu chảy được sử dụng phổ biến là CO2 với giá trị tới hạn thấp và độ hoạt động hóa học thấp. CO2 dễ thu nhận được ở dạng siêu tinh khiết với giá thành hợp lý, nó là chất thân thiện với môi trường và có thể tách trích ly ra khỏi các chất phân tích thu nhận được dễ dàng không có trở ngại gì cũng như không gây tổn thất đáng kể.
Nitơ oxyt cũng là dòng siêu chảy tốt nhưng nó rất dễ cháy nổ. Amoniac là chất phân cực với độ hòa tan tốt nhưng nó dễ tương tác hóa học và gây ăn mòn.
Hydrocacbon cũng thường có khả năng cháy nổ và cũng không dùng được với kỹ thuật phân tích SFE.
Một phương pháp thực hiện thông thường trong trích ly bằng dòng siêu chảy được đề cập trong mối liên quan với tính chất hóa lý của dòng siêu chảy đó là việc sử dụng các chất hỗ trợ (đồng dung môi). Đó là những hợp chất được thêm vào dòng chảy nguyên thủy để tăng hiệu suất trích ly. Ví dụ như thêm vài phần trăm (1 – 10%) dung môi metylic vào cacbon dioxyt sẽ mở rộng
khoảng trích ly với những chất phân tích có độ phân cực cao hơn.
Kỹ thuật trích ly với dòng siêu chảy ứng dụng trong thiết bị đơn giản được giới thiệu trong Hình 3.
Hình 3.2 Sơ đồ thiết bị SFE
(a) Nguồn chất hỗ trợ, (b) Bơm, (c) Ngăn trích ly, (d) Lò nung, (e) Thu hồi, (f) Bộ phận hãm dòng, (g) Nguồn dòng chảy, (h) Bộ lọc (i) Bơm pittong cao áp tác dụng kép
Mẫu được đưa vào ngăn trích ly bên trong, mà dòng chảy được bơm vào đó ở một áp suất trên điểm tới hạn. Nhiệt độ của ngăn tăng trên giá trị tới hạn của dòng chảy. Lượng thực phẩm cần khoảng 1 – 3 g trong mỗi ngăn. Trong trường hợp thực phẩm rắn cần đồng nhất mẫu, còn thực phẩm lỏng thì cần hấp thụ lên một chất trơ và có lỗ xốp để tránh trở ngại trong việc điều chỉnh 2 pha khi có áp suất. Thành phần nước trong mẫu phải được điều chỉnh kỹ lưỡng vì nước, được coi là một đồng dung môi mạnh, có thể làm thay đổi khả năng trích ly của dòng siêu chảy và đồng thời nó bị đóng băng khi dòng chảy bay hơi gây tắc nghẽn các van và bộ phận hãm dòng.
Sự trích ly có thể thực hiện ở chế độ tĩnh hay động, hoặc chế độ tuần hoàn.