a) Nhiệt độ
Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển ở các loài là không như nhau. Thực tế nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì nhiệt độ được duy trì, ít biến đổi, thường là 25 + 1°C.
“Theo tác giả Shigenobu và Sakamoto (1981) thì nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đổi trong suốt thời gian nuôi cấy.
Nhiệt độ thấp cũng có ảnh hưởng rõ rệt : nếu xử lí bao phấn lúa ở 4°C thì hiệu suất
‘tao mô sẹo tăng lên. Ngoài ra, nhiệt độ thấp hoặc rất thấp còn được sử dụng làm chậm hay làm ngừng hẳn sinh trưởng của mẫu nuôi cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kién in vitro.
b) Ánh sáng
Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng (Read, 1990 ; Dooley, 1991).
Cường độ ánh sáng từ 1000 — 2500 lux được ding phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô.
Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đầy quá trình, tạo rễ (Murashege, 1977).
Theo Ammirato (1986) ánh sáng tham gia vào sự phát sinh phát triển phôi xoma.
Cường độ ánh sáng cao gây nên sự sinh trưởng của mô sẹo, ánh sáng ở cường độ trung bình kích thích sự tạo chổi, ngoài ra với cường độ ánh sáng thấp chổi sẽ gia tăng chiều:
cao và có màu xanh đậm.
45
Vấn đề quang phổ của ánh sáng đã được nhiều tác giả nghiên cứu như : Pierik (1987), Reutes (1988) nuôi cấy cây quỳ thiên trúc ở ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi, trong khi ánh sáng xanh lại có biểu hiện ức chế. Đối với cây thuốc lá thì ngược lại, ánh sáng xanh kích thích sự biệt hoá chổi, ánh sáng trắng kìm hãm tạo rễ phụ nhưng hoạt hoá tạo chồi phụ. Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất lượng bình nuôi cấy.
8. Nguyên liệu và phương pháp a4) Chọn nguyên liệu
Nguyên liệu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nào của cây : Các đoạn của rễ và thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn, thậm chí các mẩu thân ngầm hoặc cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành) cũng được dùng cho nuôi cấy.
Mục đích của nuôi cấy và đặc tính của loài cây sẽ quyết định việc chọn lựa loại mẫu nào là phù hợp. Chẳng hạn để thu cây đơn bội làm nguồn gen lai tạo giống thì phải dùng bao phấn, hạt phấn cho nuôi cấy. Để tiến hành vi nhân giống thực vật, cây cho mẫu (cây mẹ) phải mang một hoặc nhiều đặc điểm ưu việt mà chúng ta quan tâm : sinh trưởng tốt, cho sản lượng, chất lượng cao của quả, hạt hay cơ quan sinh dưỡng, ít bị nhiễm bệnh, có khả năng chống chịu các điều kiện sống không thuận lợi của môi trường (hạn, lạnh). Các mẫu thường được thu nhận vào đầu mùa sinh trưởng, lúc sáng sớm khi toàn cây vẫn còn ở:
trạng thái trương nước, (Seabrook và cộng sự, 1976 ; Yang, 1977 ; Anderson, 1980 ; Narayanaswamy S., 1994).
Sự tái sinh của mẫu phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy, đặc điểm di truyền của loài cây, trạng thái sinh lí của cây cho mẫu và đôi khi chịu ảnh hưởng của các mùa trong năm.
b) Phương pháp vô trùng mẫu cấy
Mẫu được thu hái về có chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm tuỳ theo sự tiếp xúc của chúng với môi trường. Phôi ở trong hạt, mô trong quả, đòng lúa non ít bị nhiễm vi sinh - vật. Ngược lại, lá, thân và đặc biệt các bộ phận nằm dưới đất như rễ, củ, thân ngầm có số lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Để loại bô hệ vi sinh vật khỏi mô nuôi cấy thì phương pháp thông dụng hiện nay là dùng các hoá chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm.
Khả năng tiêu diệt nấm, vi khuẩn của hoá chất vô trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lí và mức độ xâm nhập của chúng trên bể mặt mô cấy. Để tăng hiệu quả thì người ta có thể ngâm mẫu vào etanol 70 — 80% trong 30 giây, sau đó mới xử lí với dung dich diệt khuẩn. Đối với các mẫu mà bề mặt của chúng được bao phủ bởi một lớp sáp thì muốn đạt - kết quả tốt cần cho thêm vào dung dịch khử trùng một vài giọt các chất làm giảm sức căng bề mặt như là tween 20, tween 80, tepol vì những chất này giúp làm tăng tính linh động của 46
hoá chất vô trùng. Với các mẫu quá bẩn thì phải rửa kĩ bằng nước xà phòng và phải để dưới vòi nước chảy từ 20 — 30 phút, sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy.
Tác nhân vô trùng ngoài diệt nấm, vi khuẩn còn ảnh hưởng tới mô cấy. Vì vậy chọn loại hoá chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và sự mẫn cảm của mẫu. Trong SỐ CÁC hoá chất vô trùng thì Canxihypochlorit và Natrihypochlorit là hay được dùng hơn cả do đặc tính của chúng có độc tính thấp với mô được xử lí, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Khi vô trùng mẫu cấy cần ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn, kích thước của mẫu phải lớn hơn kích thước khi cấy vào môi trường vì sau đó sẽ cắt bớt phần mẫu bị huỷ hoại do hoá chất vô trùng gây ra. Nồng độ sử dụng, thời gian xử lí và hiệu quả của một số hoá chất vô trùng như bảng sau :
Hoá chất Công thức | Nông độ sử | Thời gian Hiệu quả vô trùng hoá học dụng (%) | xử lí (phút)
Canxihypochlorit Ca(ClO); 5-15 10-30 Rất tốt
Natrihypochlorit - NaCIO 0,5— 2 10 — 30 Rất tốt
Hiđropeoroxit H;ạO; 10 — 12 5-15 Tốt
Thuy ngân clorua HgCl, 0,1-1 — 10 Trung bình
Nước Brom HBr + HBrO 1-2 10 — 30 Rất tốt
c) Phương pháp nuôi cấy
— Nuôi cấy trên môi trường đặc
Thành phần của môi trường đặc có agar với hàm lượng biến đổi từ 0,6 — 1%. Agar làm cho môi trường đông lại và các mẫu thí nghiệm được cấy lên bề mặt của môi trường.
Dùng môi trường đặc để nuôi cấy cơ quan tách rời, vi nhân giống, nuôi cấy mô sẹo, nuôi
cấy bao phấn.
Phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu đi xa. Nhưng đồng thời có nhược điểm là mẫu chỉ tiếp xúc được một mặt với môi trường dinh đưỡng, đồng thời những sản phẩm do mẫu tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sinh trưởng của mẫu..
— Nuôi cấy trên môi trường dịch thể ˆ
Có hai phương pháp chính sử dụng môi trường dịch thể trong nuôi cấy : + Nuôi cấy dịch thể động
Trong phương pháp này mẫu được ngâm một phần hay ngập hoàn toàn trong dung dịch của môi trường. Các bình chứa mẫu được đặt trên máy lắc với tốc độ 100 — 120 vòng/phút tạo thuận lợi cho sự trao đổi khí. Nuôi cấy dịch thể động dùng trong nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy để sản xuất các chất trao đồi thứ cấp.
47
+ Nuôi cấy dịch thể tĩnh
- Bình nuôi cấy được để yên như trong trường hợp nuôi cấy trên môi trường đặc, mẫu có một phần ngâm trong dung dịch của môi trường và phần kia tiếp xúc với không khí.
Ngoài các phương pháp trên, mẫu có thể được nuôi cấy trên môi trường bán lỏng hay bắn rắn hoặc phối hợp cả hai loại môi trường. Lựa chọn phương pháp nào là tuỳ theo đối tượng, giai đoạn phát triển của mẫu, mục đích và kĩ thuật nuôi cấy.
9. Các hướng nghiên cứu và ứng dụng a) Vi nhân giống in viro
Vi nhân giống in vitro 1a lĩnh vực sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây trồng trong ống nghiệm. Vi nhân giống có thể thực hiện qua :
— Nuôi cấy mô phân sinh hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
— Nuôi cấy mô sẹo hoặc nuôi cấy phôi. :
Vi nhân giống có những ưu điểm như :
+ Tạo ra hệ số nhân chồi cao, rút ngắn thời gian đưa ra một giống mới vào sản xuất.
+ Cây con hoàn toàn sạch bệnh, đồng đều về độ tuổi.
+ Loại bỏ được mầm bệnh, ứng dụng phục tráng những giống cây bị nhiễm virus.
+ Dễ dàng vận chuyển được số lượng lớn cây giống đi xa.
-b) Tạo cây đơn bội
Cây đơn bội có thể thu nhận được bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn trên môi trường rắn hoặc lỏng. Hạt phấn trong quá trình nuôi cấy sẽ phân chia thành mô sẹo hoặc phôi và cuối cùng là tái sinh cây.
Cây tái sinh thu được chủ yếu là đơn bội, một số là nhị bội và đa bội. Cây đơn bội phát triển từ hạt phấn được ứng dụng tạo ra các dòng thuần, phục vụ cho cóng tác lai tạo giống.
Từ cây đơn bội người (a sẽ lưỡng bội hoá bằng xử lÍ coxixin trong thời gian 24 — 28 giờ.
Hiện nay trên thế giới đã có hơn 65 loại cây được đưa vào trồng trọt nhờ phương pháp nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. Phương pháp này ra đời đã làm giảm hẳn thời gian và công sức, đồng thời tăng vọt số lượng thể đơn bội thu được cho các nghiên cứu cải tạo
giống cây trồng. cà
c) Nuôi cấy protoplast và lai tế bào xoma
Protoplast được dùng để tạo ra các thể dung hợp nhằm thực hiện những biến đổi di truyền ở thực vật. Cho đến nay có 2 phương pháp dung hợp chính được sử dụng rộng rãi đó là phương pháp dung hợp của Kao và đồng nghiệp (1974) dùng PEG (Polietilenglicol) có khối lượng phân tử cao để gắn các protoplast với nhau. Khi-làm loãng PEG thì chỗ tiếp xúc giữa 2 protoplast sẽ bị thủng và quá trình dung hợp sẽ xảy ra. Phương pháp thứ 2 là sử dụng dòng điện. Ngoài ra một số tác giả còn sử dụng phương pháp diệt nhân của một protoplast, sau đó cho dung hợp với một số protoplast khác để chuyển các bào quan (ti thé, lap thé) từ protoplast thứ nhất sang protoplast thứ 2 (Zeleer và cộng sự, 1978 ;
Nguyễn Đức Thành, 1977). - "
Dung hợp protoplast là phương pháp hiệu quả nhất để tao cay lai xorna, cho phép thu được tổ hợp lai mong muốn. Phương pháp dung hợp đã khắc phục được những hạn chế cố hữu mà phương pháp lai hữu tính không thực hiện được. .
48
d) Chọn dòng tế bào cho năng suất thứ cấp cao
Chon dong tế bào là phương pháp chọn lọc nhân tạo được thuc hién in vitro. Vat liéu nghiên cứu hay dùng trong chọn dòng tế bào cho năng suất thứ cấp cao là mô sẹo (Hiraoka, 1986 ; Nozue và cộng sự 1987). Có thể tiến hành chọn lọc hoặc chọn lọc từng bước đối với mẫu nuôi cấy. Trong cách thứ nhất, tác nhân chọn lọc được đưa vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ nhất định. Ở cách thứ hai, tác nhân được đưa vào môi trường thay đổi nồng độ từ thấp đến cao, khi mô hoặc tế bào sống sót ở nồng độ nào đó thì được chuyển sang môi trường có nồng độ cao hơn. Mục đích của chọn dòng là tạo ra dòng tế bào có khả năng sản xuất các chất trao đổi thứ cấp với tốc độ cao và đặc tính này phải én định qua nhiều thế hệ tế bào.
Việc tạo ra dòng tế bào tổng hợp các chất thứ cấp mong muốn rất có ý nghĩa vì những chất này có rất ít trong cây, gặp khó khăn khi tách chiết. Mặt khác nhiều chất ở
dạng hỗn hợp phức tạp. chưa thể tổng hợp bằng phương pháp nhân tạo. Trong khi đó dùng phương pháp nuôi cấy dịch lỏng có thể sản xuất các chất trao đổi thứ cấp hoàn toàn chủ
động với quy mô lớn. `
e) Chuyển gen ở thực vật bậc cao
Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự tiến bộ của kĩ thuật nuôi cấy mô ~ tế bào thực vật. Các thực vật chuyển gen được tạo nên bằng nhiều cách khác nhau như : phương pháp vi tiêm, phương pháp dùng súng bắn gen, phương pháp chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần, nhưng đa số được thực hiện bằng phương pháp hệ thống chuyển .gen nhd Agrobacterium (Zambryski, 1988 ; Gheysen và cộng sự, 1998).
Chuyển gen là một quá trình phức tạp, đòi hỏi sự phối hợp của nhiều kĩ thuật : Di truyền học phân tử, hoá sinh, nuôi cấy mô - tế bào thực vật. Mỗi kĩ thuật có vai trò riêng nhưng chúng đan xen chặt chẽ với nhau trong suốt cả quá trình chuyển gen. Nuôi cấy mô — tế bào thực vật được coi như một kĩ thuật không thể thiếu được vì nó sử dụng để xử lí mẫu bạn đầu (tách protoplast, mô, tế bào) nuôi cấy mẫu với vector mang gen, chọn lọc được thể biến nạp gen và cuối cùng là nhân cây mang gen biến nạp phục vụ nhân giống quy mô lớn.
0) Bảo quản nguồn gen thực vật bằng phương phắp nuôi cấy mô tế bào
Ngày nay do các hiện tượng về thiên tai và ô nhiễm môi trường gia tăng đã dẫn đến việc đe doạ sự lưu giữ tự nhiên nguồn gen thực vật. Nhiều loài thực vật và động vật đã bị tuyệt chủng do con người và các điều kiện tự nhiên, do đó ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong việc lưu giữ các nguồn gen thực vật là việc rất cần thiết.
Bảo quản nguồn gen bằng phương pháp nuôi cấy mô — tế bào có nhiều ưu điểm : Điều kiện bảo quản được ổn định về nhiệt độ, ánh sáng không bị các nguồn gây hại, mặt khác nguồn gen được bảo quản dưới dạng khác nhau như mô, tế bào, phôi protoplast, hạt
phấn, ADN. ,
Có hai phương pháp bảo quan in vitro :
— Phương pháp. sinh trưởng chậm : Kéo dài vòng đời của tế bào thực vật, dẫn đến làm giảm sinh trưởng của nhiều loài cây được nuôi trong ống nghiệm trong thời gian kéo đài từ 1 — 3 năm.
4. SLHTV-A , 49
~ Phương pháp lạnh sâu : Để bảo quản nguồn gen trong thời gian dài hơn bằng cách sử dụng những tác nhân gây lạnh như nitơ lỏng (—196°C). Ở những điều kiện này sự sinh trưởng và phân chia của tế bào hoàn toàn ngừng lại.
Phương pháp bảo quản nguồn gen ¡r virro có nhiều lợi thế :
+ An toàn vận chuyển đi xa cũng như việc trao đổi giống cây, nguồn gen giữa các nước.
+ Giống hoàn toàn được sạch bệnh do sinh trưởng trong điều kiện vô trùng.
+ Có thể tạo ra ngay số lượng cây trồng lớn khi cần thiết bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
Cây kiểm tra bệnh
Môi trường thạch
Khay trồng cây Chậu cây
Hình 18 ~ Sơ đồ nhân giống vô tính in viro --
4. SLHTV-B
Nguyên liệu lấy từ lá cây
“Các mô lá được nuôi cấy trén dia Petri
* Cay con hình thành trén dia Petri
Cây mới được tạo
thành từ mô lá
Hinh19 — KT thuật nuôi cấy mô
Phá bỏ thành tế báo -
. _— dA pe A~ Protoplast
- ~ == Nuôi o>, bao
go a N
Cây sạch bệnh
Cây mới đem trồng
ch ; : @
wy) ` wee _ - Tạo callus (Mô sẹo)
Hình thành thân, rễ
Hình 20 - Quy trình nhân giống vô tính từ nuôi cấy in vitro các tế bào đơn
5S