PCR là phương pháp khuếch đại đích được sử dụng phổ biến nhất, DNA HPV được khuếch đại và phát hiện nhờ enzym chịu nhiệt DNA polymerase với sự tham gia của các mồi đặc hiệu sau một chu trình nhiệt.
Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR thường để khuếch đại vùng gen L1 HPV. Cặp mồi được sử dụng nhiều nhất là GPMY09/GPMY11 khuếch đại 450 bp trên đoạn L1 ORF và cặp mồi GP5+/GP6+ khuếch đại 140 bp vùng L1. Đây là hai loại mồi có độ nhạy cao, có thể khuếch đại từ 10-200 bản copy DNA, tuy nhiên, độ nhạy của PCR với hai loại mồi trên không giống nhau. Mồi GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ gốc đều có nhiệt độ bắt cặp thấp nên mồi được biến đổi thành các cặp mồi gồm hỗn hợp các đoạn oligonucleotid khác nhau gọi là các mồi GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ thế hệ hai.
Những cặp mồi mới có thể khắc phục nhược điểm nhiệt độ bắt cặp thấp nhưng lại có thể tổng hợp nên những mẫu DNA đứt gãy hoặc DNA không đặc hiệu DNA đích [Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections]. Do đó, hiện nay, phản ứng PCR thường sử dụng mồi xuôi- mồi ngược không gồm những trình tự của những đoạn DNA đứt gãy và thay vào đó là các inosine có thể bắt cặp với bất kỳ trình tự nucleotid khác.
Khi so sánh giữa 2 loại cặp mồi trên, GPMY09/GPMY11 có thể xác định sai lệch 7% UTCTC do sự vắng mặt của HPV DNA trong tế bào ung thư và sản phẩm PCR sản phẩm HPV DNA đã bị đứt gãy và làm mất vùng L1 ORF trong tế bào ung thư [Lambert, 2008], [Qu, 1997]. Trong phản ứng PCR lồng
(nested PCR), nghiên cứu có thể sử dụng cả hai loại mồi GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ sẽ cho phản ứng có độ nhạy cao hơn.
Hiện nay, phương pháp PCR còn sử dụng loại cặp mồi mới ký hiệu là SPF10 nhằm khuếch đại 65-bp trên vùng L1 ORF. Loại mồi này có độ đặc hiệu rất cao và thực hiện được hầu hết các loại bệnh phẩm, kể cả những bệnh phẩm đã có định bằng formalin. Với các loại mồi khác, phản ứng PCR khó thành công với sản phẩm dài với DNA khuôn kém chất lượng, đặc biệt là DNA tách từ mẫu cố định trong formalin. Do đó, SPF10 có lợi thế hơn khi sàng lọc HPV trên các loại bệnh phẩm khác nhau [van Hamont, 2006].
Một số Kít HPV thương mại dựa trên nguyên lý phương pháp HPV:
+ Kỹ thuật Reverse line blot (Roche Molecular systems - Alameda, CA) là kỹ thuật đầu tiên ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện HPV DNA và HPV genotype. Kỹ thuật line blot dựa trên nguyên lý của PCR sử dụng mồi
mẫu dò gồm các mẩu olionucleotid đặc hiệu đa type HPV gắn trên màng. Phức hợp gắn được phát hiện bằng mắt thường. Reverse line blot có thể phát hiện được 27 HPV genotype khác nhau trong đó có 11 type HPV "nguy cơ thấp". Hiện nay, trên thương mại đã công bố Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) có thể phát hiện 37 HPV genotype bao gồm 14 type HPV "nguy cơ thấp". Đây là loại Kít được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm ở Châu Âu, tuy nhiên Kít được FDA chấp thuận nhưng chưa được phê chuẩn. Ngoài ra, trên thương mại còn Kít INNO- LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics, Ghent, Bengium) với nguyên lý lai Reverse line blot phát hiện 24 HPV genotype khác nhau, L1 DNA HPV được khuếch đại bằng mồi SPF 10 và được lai với các đầu dò đặc hiệu trên màng.
+ Amplicor HPV test (Roche Molecular Systems) là kỹ thuật có thể phát hiện 13 type HPV "nguy cơ cao". Nguyên lý kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR khuếch đại sản phẩm lai sau khi DNA đích đã lai kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang. Nhược điểm của Kít là chỉ phát hiện được nhóm genotype HPV mà không phát hiện từng HPV genotype đặc hiệu. So sánh Amplicor với Hybrid Capture II Assay (cùng phát hiện được 13 type HPV "nguy cơ cao") cho thấy độ tương đồng là 83,3% Molecular diagnosis of human
papillomavirus (HPV) infections].
+ Multiplex HPV Genotyping Kit (Multimetrix, Heidelberg, Gemany) là kỹ thuật gắn huỳnh quang sản phẩm PCR và mẫu dò đặc hiệu. Mồi Kít gồm 24 mẫu dò tương ứng 24 genotype HPV, 1 mẫu dò β-globin và 1 mẫu dò chứng. Sau khi sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò sẽ được gắn R-phycoerythrin đã đánh dấu streptavidin và được đọc trên máy phân tích Luminex. Đây là Kít
có độ nhạy cao và có thể ứng dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học, tuy nhiên hiện nay Kít thường chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu vì giá thành cao. + Phương pháp PCR đặc hiệu theo type (type-specific PCR) là phương pháp PCR phát hiện riêng cho từng type HPV khác nhau dựa vào sự khác nhau trên vùng gen E6 và E7. Phát hiện đa nhiễm các type HPV trong cùng một mẫu cũng phải được thực hiện riêng biệt cho từng type. Kít gồm cặp mồi đặc hiệu cho 14 genotype HPV nhóm “nguy cơ cao” dựa trên khả năng khuếch đại 100 bp trên vùng gen E7 HPV. Các genotype HPV có mồi đặc hiệu được phát hiện là HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68.
Phương pháp PCR đặc hiệu theo type có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện với 0,005 – 0,01ng DNA HPV/µl, tiến hành nhanh và xác định được đa nhiễm.