ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.3. Tinh chế kháng thể
Kháng thể đặc hiệu với nọc rắn của từng loài rắn được tách chiết và tinh sạch từ huyết thanh thỏ gây miễn dịch theo qui trình tinh chế 3 bước của Lê Văn Đông và CS (2003), phối hợp sắc ký ái lực với sắc ký miễn dịch [80].
* Bước 1: Tách chiết IgG từ huyết thanh thỏ bằng sắc ký ái lực với cột protein G (EconoPack Protein G Column) do hãng Bio Rad (Mỹ) sản xuất. Huyết thanh thỏ được pha loãng trong dung dịch PBS có pH 7,4 và cho chảy qua cột sắc ký. Rửa cột loại bỏ các thành phần không bám vào cột bằng dung dịch PBS pH 7,4. Tiếp theo, dung dịch glycine 0,1 M pH 2,8 được cho vào cột và cho chảy tự nhiên theo chiều thẳng đứng từ trên xuống dưới để rửa giải IgG ra khỏi cột. IgG thoát ra khỏi cột sắc ký trong dung dịch glycine có pH thấp được chuyển đổi qua dung dịch PBS có pH trung tính bằng phương pháp sắc ký lọc gel.
* Bước 2: Tách chiết IgG đặc hiệu nọc rắn từ chế phẩm IgG tổng số bằng sắc ký miễn dịch với cột chứa kháng nguyên nọc rắn. Bốn cột sắc ký chứa bốn loại kháng nguyên nọc rắn của bốn loài rắn được chế tạo bằng cách gắn nọc độc lên trên giá thể Sepharose 4B được hoạt hoá bằng CNBr. Dung
dịch kháng thể IgG thu được từ huyết thanh thỏ, được cho chạy qua cột sắc ký miễn dịch chứa kháng nguyên nọc rắn tương ứng với nọc rắn đã dùng để gây miễn dịch. Rửa cột bằng dung dịch PBS pH 7,4 để loại bỏ các thành phần IgG không đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn và không bám vào cột. Tiếp theo, dung dịch glycine 0,1 M pH 2,8 được cho vào cột và cho chảy tự nhiên theo chiều thẳng đứng từ trên xuống dưới để rửa giải kháng thể kháng nọc rắn ra khỏi cột. Kháng thể trong dung dịch glycine có pH thấp được chuyển đổi qua dung dịch PBS có pH trung tính bằng phương pháp sắc ký lọc gel.
* Bước 3: Loại bỏ các phân tử kháng thể phản ứng chéo giữa các loài rắn bằng phương pháp hấp phụ miễn dịch. Sản phẩm kháng thể kháng nọc rắn thu được ở bước 2 có thể chứa các phân tử kháng thể phản ứng chéo với kháng nguyên của các loài rắn khác. Các phân tử kháng thể này được loại bỏ bằng phương pháp hấp phụ miễn dịch, sử dụng các cột sắc ký miễn dịch chứa kháng nguyên nọc rắn dị loài. Kháng thể kháng nọc rắn của một loài được cho chạy lần lượt qua các cột chứa kháng nguyên nọc rắn của 3 loài còn lại. Các phân tử kháng thể phản ứng chéo (nếu có) sẽ bị giữ lại trong các cột kháng nguyên nọc độc dị loài. Sản phẩm thu được sau hấp phụ miễn dịch được coi là kháng thể đặc hiệu loài rắn. Hoạt tính của kháng thể thu được sau tinh chế và khả năng phản ứng chéo của chế phẩm kháng thể đặc hiệu loài được kiểm tra bằng phương pháp ELISA gián tiếp như mô tả ở mục 2.2.2.2.