Virus tồn tại ở mọi tế bào sống. Tuy nhiên, những nghiên cứu của Morel và Martin (1952) [39] cho thấy nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh và lá
bao thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh đỉnh ở phía dưới. Từ đây các tác giả đã đề xuất kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô
phân sinh đỉnh) để tạo cây sạch virus hoàn toàn từ cây đã nhiễm bệnh.
Limasset và Cornuet đã dùng phương pháp huyết thanh định lượng chứng minh đ−ợc có sự tồn tại một gradien nồng độ virus từ các mô non đến mô già ở cây thuốc lá bị bệnh (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2003)[17]. Cụ thể là nồng độ virus bằng không ở mô đỉnh và bao lá mầm thứ
nhất, sau đó tăng dần lên cực đại ở lá mầm thứ năm rồi lại giảm ở lá phía dưới.
Trên cơ sở đó Morel và Martin (1952) [39] đề xuất phương pháp tẩy sạch virus bằng cách nuôi cấy meristem - mô phân sinh đỉnh (nơi hoàn toàn không chứa virus) trên môi trường vô trùng để tạo cây sạch virus.
Cơ sở lý luận của việc nuôi cấy meristem tạo cây sạch virus đã đ−ợc Mathews R.E.F., Wang P.J. và Hu C.Y., Lizarraga R và CS, Pierik R.L.H.
(Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2003)[17] tổng kết nh− sau:
- Virus vận chuyển nhờ hệ thống mô dẫn, hệ thống này không có ở mô
phân sinh đỉnh. Nh− thế virus bị bao vây không vào đ−ợc mô phân sinh đỉnh.
- ở meristem tốc độ phân bào là rất lớn, tốc độ nhân bản của DNA cao nó không tương hợp với tốc độ nhân bản vật chất di truyền của virus do đó virus không tự tồn tại.
- Dựa vào đặc điểm sinh lý ở meristem nồng độ auxin rất cao (vì đỉnh sinh tr−ởng là nơi sản xuất ra các hợp chất auxin). Chính vì vậy nên nó ức chế sự nhân bản virus do đó virus không tồn tại trong mô phân sinh đỉnh.
- Hệ thống vô hiệu hoá virus ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong c©y.
Bắt nguồn từ những nghiên cứu về sự phân bố virus trong cây bị bệnh
đã đ−a đến một kỹ thuật mới, kỹ thuật nuôi cấy meristem để tạo ra các cây sạch virus.
Nhiều tác giả đã phát hiện thấy có sự sai khác lớn về vùng sạch virus ở
đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào các loại virus. Vì thế, cần có các phương pháp tách Meristem khác nhau khi tẩy virus (Ten Houten et all, 1968)[47].
Kỹ thật nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng - meristem đã được các tác giả
Buvat (1952), Norris (1954), Quak (1957) phát triển. Năm 1962 Murashige và Skoog đã đưa ra thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp để nuôi cấy. Sau
đó năm 1964 Morel và Muller đã hoàn thiện môi trường nuôi cấy từng đoạn mầm khoai tây (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội)[1]
Từ cơ sở lý luận nêu trên nhiều tác giả đã ứng dụng thành công phương pháp nuôi cấy meristem và trong môi trường thích hợp đã tái sinh được cây khoai tây sạch virus. Tuy nhiên, việc nuôi cấy và tái sinh cây từ meristem với kích thước nhỏ nên đòi hỏi kỹ thuật cao trong, công việc phức tạp và tỷ lệ tái sinh thành công cây hoàn chỉnh thấp.
Việc làm sạch virus tức là phải giải phóng các thực vật bị nhiễm virus khỏi virus, đó là công việc cần thiết đối với cây trồng nói chung nhất là các loại cây trồng nhân giống vô tính vì ph−ơng thức nhân giống vô tính này là nguyên nhân truyền bệnh từ thế hệ này sang thế hệ khác. Biện pháp làm sạch virus phải luôn luôn đ−ợc kết hợp với các biện pháp duy trì tính sạch bệnh của cây trồng (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội)[1]
Phương pháp chung để tạo cây sạch virus là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp với việc xử lý nhiệt, sau đó thông qua phương pháp nhân nhanh in vitro để tạo ra số l−ợng cây lớn.
2.5.2. Quy trình làm sạch virus ở khoai tây
Để sản xuất giống khoai tây sạch bệnh, tr−ớc hết phải có nguồn giống sạch bệnh ban đầu hoặc từ nguồn giống đ−ợc làm sạch bệnh bằng nuôi cấy meristem, hoặc từ nguồn giống đ−ợc chuẩn đoán sạch bệnh bằng các ph−ơng pháp hiện đại. Nuôi cấy meristem là một trong những bước tiến hành đầu tiên trong hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh ở tất cả các n−ớc trồng khoai tây trên thế giới. Năm 1980 Walley đề xuất quy trình làm sạch virus khoai tây (Nguyễn Thị Kim Thanh, 1998)[19] cụ thể nh− sau:
Quy trình làm sạch virus khoai tây:
- Điều kiện nuôi cấy thích hợp - Xử lý hoá chất
- Xử lý nhiệt độ tiếp - Xử lý nhiệt độ cao - Xác định virus
Nuôi cấy mô phân sinh i h
Cấy trong môi tr−ờng thích hợp
Cây bị nhiễm bệnh
- Duy trì sự sạch bệnh (thanh lọc, cách ly) Trồng trong
v−ờn −ơm
- Nhân bằng nhiều ph−ơng
- HuyÕt thanh, Elisa
- Kính hiển vi điện tử
- GhÐp
- Cây chỉ thị
Xét nghiệm virus bằng:
Ng−ời sử dụng Cây sạch bệnh
Tái sinh cây