5. Điểm mới của đề tài
1.2.3.3. Cơ chế polyme hóa
Sự poymer hóa pyrrole bằng phƣơng pháp điện hóa xảy ra khi có sự áp
thế hoặc dòng vào một điện cực dẫn đƣợc nhúng trong dung dịch đệm chứa monomer pyrrole. Phƣơng pháp điện hóa thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ
potentiostactic và galvanostatic [26,27]. Ngoài pyrrole và dung môi, dung dịch
đệm còn chứa muối ion thích hợp nhằm tạo môi trƣờng điện ly cho quá trình điện ly và cung cấp anion cho sự pha tạp PPy.
Vẫn còn tồn tại tính không thống nhất trong các cơ chế đƣợc đƣa ra nhằm giải thích quá trình polyme hóa điện hóa pyrrole. Tuy nhiên, cơ chế đƣợc đƣa ra
bởi Diaz và Castillo [28] vào năm 1980 và đƣợc phát triển bởi Henry [29] năm 2001 là cơ chế polyme hóa điện hóa đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong các công
bố vềPPy. Cơ chếnày đƣợc trình bày nhƣ sơ đồtrong hình 1.8.
17
Khi áp thế điện hóa E1 vào điện cực dẫn, quá trình oxi hóa pyrrole (1a)
xảy ra tại bề mặt điện cực để tạo thành cation gốc. Tốc độ phản ứng oxi hóa nhanh hơn tốc độ của quá trình khuếch tán pyrrole từ khối dung dịch vào lớp tiếp giáp, vì vậy, cation gốc là thành phần chủ yếu trong lớp tiếp giáp. Cation
gốc monomer pyrrole ở nồng độ cao sẽ phản ứng ghép mạch với nhau để tạo dạng dimer. Sự ghép mạch tạo dimer trung hòa điện bao gồm quá trình tạo dication gốc (1b) và quá trình tách hai proton (1c). Dimer pyrrole hình thành
tiếp tục bị oxi hóa bởi thếđiện hóa E2(2a) để tạo thành cation gốc dimer, sau đó ghép mạch với cation gốc monomer khác sinh ra dạng trimer của pyrrole (quá trình 2b và 2c). Phản ứng polyme hóa tiếp tục lan truyền theo chuỗi (ia, ib và ic) cho đến khi sản phẩm PPy cuối cùng đƣợc hình thành. Giai đoạn dập tắt mạch của phản ứng polyme hóa có thể xảy ra theo hai hƣớng. Một là phản ứng của cation gốc với nƣớc hoặc anion OH-. Hai là sự giải tỏa điện tích trên toàn chuỗi
PPy làm mất hoạt tính của cation gốc.
Liên kết đƣợc tạo thành giữa các vòng thơm pyrrole chủ yếu xảy ra ở vị trí α (vị trí carbon cạnh nitơ) hay còn gọi là ghép mạch α, tuy nhiên sự ghép
mạch β (vị trí carbon cách nitrơ) cũng đƣợc phát hiện trong một số nghiên cứu [30,31]. Khi xảy ra sự ghép mạch β sẽhình thành cấu trúc mạch nhánh làm mất
tính phẳng và xáo trộn cấu trúc nối đôi liên hợp của chuỗi PPy, dẫn đến tăng độ
rộng vùng cấm và giảm độ dẫn của Ppy (hình 1.9). N H H N N H HN n NH Hình 1.9. Sự ghép mạch β hình thành cấu trúc PPy mạch nhánh
18
Nhƣ đã đề cập trong mục trƣớc, bản chất sự dẫn điện trong polyme là do
sự hình thành các phần tử tải điện do sựoxi hóa hệ nối đôi liên hợp. Thực tế, sau
quá trình polyme hóa, chuỗi PPy hình thành ở trạng thái oxi hóa và dạng pha tạp. Sự có mặt của các ion tạp giúp duy trì sự cân bằng điện tích với trạng thái oxi hóa của Ppy [33]. Phƣơng trình mô tả sự polyme hóa điện hóa pyrrole đƣợc thể hiện nhƣ hình 1.10.
Hình 1.10. Phản ứng tổng hợp PPy bằng phƣơng pháp điện hóa
Theo phƣơng trình này, số điện tử bị mất ở mỗi monomer là 2+p, 2 điện tử cho sự polyme hóa và p điện tử cho sự oxi hóa chuỗi polyme. Với PPy giá trị p thƣờng trong khoảng 0.22 hoặc 0.33 tƣơng ứng với một điện tích dƣơng trên
3-4 đơn vị monomer. Do đó, một anion tạp tƣơng ứng với 3-4 đơn vị monomer [34].
Nhận thấy lợi thế của phƣơng pháp hóa học là dễ dàng tổng hợp một
lƣợng lớn PPy trong dung dịch, trong đó monomer pyrrole tác dụng với một tác nhân oxi hóa mạnh và PPy thu đƣợc dƣới dạng kết tủa màu đen.
Bên cạnh đó, một ƣu điểm đáng chú ý trong phƣơng pháp điện hóa là dễ dàng tạo ra các sợi polyme có cấu trúc nano (vật liệu tiềm năng trong khoa học hiện đại). Và hơn nữa so với phƣơng pháp hóa học, điện hóa là phƣơng pháp có
rất nhiều ƣu điểm khác: sản phẩm tạo ra rất sạch (do không phải chiết tách từ
hốn hợp monomer – dung môi – chất oxy hóa), quá trình pha tạp và độ dày màng có thể điều khiển đƣợc bằng điện áp, các phản ứng xay ra đồng thời và
polyme dẫn kết tủa thành dạng lớp mỏng. Vì vậy nhờ khả năng điều khiển đƣợc
19
đƣợc ở dạng bột và màng, thƣờng có độ dẫn điện cao hơn sản phẩm từ phƣơng pháp hóa học.
Chính vì các lý do trên đây mà tôi chọn phƣơng pháp điện hóa để tổng hợp màng nano Polypyrrole.
1.2.3.3. Các yếu tốảnh hưởng tới sựpolyme hóa điện hóa
Quá trình polyme hóa điện hóa pyrrole chịu ảnh hƣởng của nhiều điều kiện đƣợc sử dụng trong quá trình tổng hợp. Một số điều kiện đã đƣợc nghiên
cứu thực nghiệm bao gồm bản chất của điện cực, nồng độ và bản chất của chất
điện ly, dung môi, thế điện hóa hoặc mật độ dòng điện áp dụng, nhiệt độ phản
ứng [27,33,35-38], giá trị pH và kỹ thuật điện hóa sử dụng. Tất cả các điều kiện
này sẽảnh hƣởng mạnh đến tốc độvà tính chất của polyme tạo thành.
1.3. Cảm biến ADN
1.3.1. Một sốkhái niệm
a. ADN
Deoxiribonucleic acid (ADN) là nhân tố cơ bản để xây dựng lên bản đồ gen, có ở tất cả các vi sinh vật sống, có ảnh hƣởng đến tất cả các loài vi sinh vật.
Vì vậy, việc xác định trình tự chuỗi ADN có ý nghĩa rất quan trọng. Nó có thể giúp chúng ta chuẩn đoán và điều trị bệnh một các dễ dàng hơn, nghiên cứu và bào chế thuốc, kiểm tra chất lƣợng thức ăn hoặc xác định sự biến đổi gen trong
động, thực vật.
b. Cảm biến
Cảm biến là một linh kiện vật lý hay một tổ chức sinh học có khả năng phát hiện và phân tích định lƣợng một tín hiệu, một điều kiện vật lý hay một
thành phần hóa học, sau đó chuyển tín hiệu đó thành một tín hiệu mà con ngƣời
có thểđọc đƣợc [2].
c. Cảm biến sinh học
Theo hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC năm 1999 đã định
20
cung cấp những thông tin phân tích định lƣợng hoặc bán định lƣợng, sử dụng một yếu tố nhận biết sinh học (thụ thể sinh hóa) duy trì sự tiếp xúc không gian
trực tiếp với một phần tử chuyển đổi [40]. Cảm biến sinh học đƣợc dùng đểphát
hiện sự biến đổi hóa sinh của các chất dựa trên các phản ứng sinh hóa.
1.3.2. Cảm biến sinh học trên cơ sở ADN
Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các axít nucleotit có vai trò nhƣ là một công cụ tin cậy để nhận biết và kiểm tra thông tin di truyền liên quan đến con ngƣời cũng nhƣ các loài động, thực vật. Phát hiện nhanh các chuỗi ADN sẽ cung cấp những số liệu cơ bản cho việc khám chữa và điều trị bệnh. Việc tìm kiếm một phƣơng pháp đơn giản, chính xác, không tốn kém, dễ dàng
sử dụng là rất quan trọng. Nó giúp cho quá trình nhận biết các tác nhân gây bệnh
nhanh hơn thông qua chuỗi ADN. Từ đó, có thể đƣa ra các biện pháp kịp thời, hiệu quả, để ngăn ngừa các loại bệnh có thể trở thành đại dịch, gây tổn thất về ngƣời và thiệt hại về kinh tế. Một trong những thiết bị có thể đáp ứng đƣợc những yêu cầu này là cảm biến sinh học ADN.
Cảm biến ADN là một loại thuộc họ cảm biến sinh học đặc biệt, thay vì
sử dụng phần cảm nhận sinh học thông thƣờng là enzym, kháng thể v.v… thì
cảm biến sinh học ADN sử dụng phần cảm nhận sinh học là đoạn ADN. Quá trình nhận biết trình tự ADN cần phân tích dựa trên sự lai hóa của đoạn ADN dò đƣợc gắn trên bề mặt bộ chuyển đổi và ADN đích (ADN cần phát hiện). Trong những năm qua, cùng với sựphát triển của các loại cảm biến sinh học nói chung,
cảm biến ADN đã có tốc độ phát triển rất mạnh mẽ, đã có nhiều công trình công
bố những nghiên cứu mới về loại cảm biến này. Trong đó, đã có một số sản phẩm đƣợc ứng dụng và thƣơng mại hóa [41,42].
Với những ƣu điểm nhƣ cấu trúc đơn giản, các bộ chuyển đổi có độ nhạy cao, thời gian đáp ứng nhanh, có khả năng sản xuất hàng loạt, do đó có thể làm
hạ giá thành sản phẩm, sử dụng thân thiện, không đòi hỏi kỹnăng của ngƣời sử
dụng, nên cảm biến ADN đã đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ phát hiện vi rút, vi khuẩn gây bệnh, phân tích và bào chế dƣợc phẩm trong
21
ngành y dƣợc, phát hiện đột biến gen và sự chuyển gen trong công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, xác định các ion kim loại nặng trong lĩnh vực bảo vệ môi trƣờng.
1.3.3. Ứng dụng dây nano PPy trong cảm biến DNA
Polyme dẫn đặc biệt hấp dẫn các nhà nghiên cứu vật liệu nhờ kết hợp
đƣợc tính dẫn điện của kim loại với các tính chất của polyme hữu cơ, chúng đang ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghệ cao ví dụ
trong vật liệu chống tĩnh điện, vật liệu phủ hấp thụsóng điện từ, tụđiện, các linh
kiện điện tử, linh kiện phát quang, các dây thần kinh nhân tạo, bảo vệ chống ăn mòn, bộ cảm biến, ... [43]. Polyme dẫn có tiềm năng ứng dụng cao trong lĩnh
vực cảm biến hóa học và sinh học, một lĩnh vực đòi hỏi độ nhạy, độ chọn lọc cao. Polyme dẫn dễ dàng đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học hoặc điện
hóavà cấu trúc mạch đại phân tử của chúng có thể biến tính khá dễdàng bởi quá trình đồng trùng hợp hay sử dụng các dẫn xuất. Hơn nữa, các polyme dẫn có cơ tính tốt cho phép gia công cảm biến khá dễ dàng. Vì vậy mà việc chế tạo cảm biến từ polyme dẫn ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu và các bài báo liên quan đƣợc công bốngày càng nhiều.
Với vai trò làm lớp vật liệu trung gian giữa cảm biến và bộ chuyển đổi, vật liệu polime dẫn góp phần làm tăng độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định của cảm biến sinh học [44]. Trong các vật liệu polime dẫn, PPy đƣợc nhận định là thích hợp ứng dụng trong cảm biến sinh học điện hóa nhờ khả năng tạo ra cấu
trúc nano với diện tích bề mặt lớn, khả năng tạo liên kết tốt với đối tƣợng sinh học, khả năng biến tính đểđiều khiển độ dẫn [45], do đó góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định của cảm biến sinh học. Đối với việc phát hiện các phần tử sinh học tại môi trƣờng pH tự nhiên của cơ thể động vật, PPy có ƣu điểm hơn so với một số polyme dẫn khác do đƣợc tổng hợp từ
monome tại môi trƣờng pH trung tính [46]. Bên cạnh đó, PPy cũng thể hiện những đặc tính nhƣ độ bền cao, dễ tổng hợp và độ dẫn tốt.
22
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Tổng hợp PPY bằng phƣơng pháp điện hóa
2.1.1. Hóa chất, thiết bị
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng:
- Pyrrole monomer, Gelatin, KCl, K2Cr2O7 99%, H2SO4 98%, N2 99.9%, LiClO4.3H2O, đệm PBS (Phosphate buffer saline), tất cả đƣợc cung cấp bởi Sigma-Aldrich. Mẫu ADN đƣợc cung cấp bởi công ty Invitrogen Life Technologies. Trình tự ADN dò, ADN đích đặc hiệu đƣợc thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự chuỗi ADN dò, ADN đích đặc hiệu
Chuỗi dò Thiol-C6-5’- AGACCTCCAGTCTCCATGGTACGTC-3’
Chuỗi bổ sung đặc hiệu 5’–GACGTACCATGGAGACTGGAGGTCT–3’
2.1.2. Qui trình chế tạo
2.1.2.1. Chuẩn bị
Chúng tôi sử dụng kỹ thuật chronoamperometry (potentiostatic) để tổng hợp PPy-NWs trên nền điện cực răng lƣợc vàng, kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật
dòng - thời gian. Điện thế 0.75 v đƣợc áp lên điện cực làm việc BG, sự biến đổi của dòng điện trên điện cực này đƣợc ghi theo thời gianTrƣớc khi tổng hợp dây nano PPy, điện cực làm việc đƣợc xử lý bề mặt trong dung dịch K2Cr2O7/H2SO4
(bão hòa), rồi đƣợc hoạt hóa trong dung dịch H2SO4 0,5 M bằng kỹ thuật điện
hóa quét thế tuần hoàn (CV- Cyclic Voltammetry) ở điện áp từ 0 V đến 1,4 V, tốc độ quét 50 mV/s cho đến khi đặc trƣng CV ổn định. Dây nano PPy đƣợc tổng hợp trong môi trƣờng trung tính, pH = 7,4 của PBS. Dung dịch điện li đƣợc pha chế gồm: monome pyrrole, 0,08% về khối lƣợng gelatin, LiClO4 0,1 M và đệm PBS. Trƣớc khi thêm monome pyrrole, dung dịch điện li đƣợc sục khí N2
trong 15 phút để đuổi oxi hòa tan, là tác nhân gây ra phản ứng phụ oxi hóa không mong muốn đối với pyrrole.
23
2.1.2.2. Quá trình chế tạo
Các điện cực răng lƣợc vàng nền silic đƣợc sử dụng để tổng hợp PPy- NWs. Sau khi cốđịnh ADN dò, các điện cực đƣợc sử dụng đểphát hiện nồng độ
ADN thông qua quá trình lai hóa giữa các ADN dò và ADN đích.
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình sửa đổi bề mặt của bộ cảm biến răng lƣợc. Từtrái
sang phải: Điện cực răng lƣợc vàng, BG/PPy- NWs, BG/PPy-PPy/ADN dò và
BG/PPy-PPy/lai hóa ADN.
Sơ đồ kết nối các các điện cực đƣợc trình bày trong hình 2.2. Quá trình
tổng hợp dây nano PPy đƣợc thực hiện trên hệ điện hóa AutoLab PGSTAT12, Eco Chemie, Hà Lan. Bình điện hóa sử dụng điện cực BG là điện cực làm việc,
điện cực đối Platin và điện cực so sánh Ag/AgCl trong dung dịch KCl bão hòa, hình 2.2.
Hai thí nghiệm trùng hợp đƣợc thực hiện theo các cấu hình kết nối nhƣ trong hình 2.2c: (i) điện cực 1 và 2 đƣợc nối với nhau nhƣ là điện cực làm việc; (ii) tất cả4 điện cực đƣợc nối với nhau làm điện cực làm việc. Sự trùng hợp PPy
trên bề mặt điện cực với thời gian là 200 s. Bề mặt điện cực vàng (ký hiệu là điện cực BG) đƣợc biến đổi với các dây nano Polypyrrole (ký hiệu là điện cực PPy-NWs). Sau khi ủtrong môi trƣờng thƣờng trong một ngày, bề mặt đƣợc rửa sạch bằng nƣớc khử ion (DI) năm lần. Cố định ADN đƣợc thực hiện bằng cách tiêm lên bề mặt điện cực3 μl dung dịch chứa ADN dò 2 μM trong PBS trên điện cực BG, PPy-NWs.
24
Các điện cực đƣợc để khô trong môi trƣờng thƣờng trong một ngày, sau đó rửa sạch bằng nƣớc DI năm lần để loại bỏ các phân tử ADN dò liên kết yếu hoặc không liên kết với PPy-NWs. Quá trình lai hóa DNA đƣợc nghiên cứu bằng cách tiến hành đo phổ tổng trở (EIS) của các cảm biến đƣợc kết nối với cấu
hình kết nối (iii) trong hình 2.2c. Các phân tích EIS đƣợc thực hiện bằng cách sử
dụng Autolab PGSTAT302N (Metrohm Autolab B.V., Utrecht, Hà Lan) với hệ ba điện cực thông thƣờng. Một điện thế với mô đun 250 mV DC và ± 10 mV
AC với tần số 0,1 Hz – 10 kHz đƣợc áp lên điện cực làm việc. Tất cả các phép đo BIS thực hiện trong 10 mM [Fe(CN)6]3−/4−; 0,1 M KCl làm chỉ thị hoạt động
oxy hóa. Các kết quả EIS sau đó đƣợc xem xét tƣơng ứng với một mạch tƣơng đƣơng (trong trƣờng hợp của chúng tôi, đó là mạch Randle) bằng cách sử dụng phần mềm ZsimpWin 3.10. Thiết lập EIS giống nhƣ thiết lập tổng hợp dây nano
PPy nhƣ trong hình 2.2b. Hình thái học của bề mặt vật liệu và điện cực đã đƣợc
nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét của Hitachi S4800 (SEM).
Hình 2.2. (a) Sơ đồ mặt trƣớc của cảm biến đƣợc gồm 4 điện cực (ký hiệu là 1– 4). (b) Sơ đồ của quá trình trùng hợp polypyrrole và thiết lập đo lƣờng EIS. (c)
Ba cấu hình kết nối của bốn nhánh điện cực: (i) và (ii) cho trùng hợp
25
Trong hình 2.2, các cảm biến đƣợc mô tả trong 2.2a đóng vai trò là điện cực làm việc (WE). WE với điện cực counter (CE) và điện cực so sánh (RE) hình thành một hệ thống ba điện cực thông thƣờng.
Ảnh hƣởng của nồng độ monome pyrrole, thời gian ttổng hợp đến sự hình thành vật liệu polyme dẫn PPy đƣợc nghiên cứu nhằm tìm ra những thông số tối
ƣu cho quá trình tổng hợp dây nano PPy định hƣớng ứng dụng trong cảm biến sinh học.
2.2. Các phƣơng pháp phân tích