2.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phƣơng pháp huyết thanh miễn dịch.
Bộ huyết thanh miễn dịch chuẩn đƣợc thu nhận từ các chủng Bt chuẩn theo
phƣơng pháp của Barjac và Bonnefoi, 1962 [15].
Các chủng Bt đƣợc cấy vào ống craige (ống thủy tinh nhỏ, đƣợc cắm thẳng đứng vào môi trƣờng Craige chứa trong ống nghiệm), nuôi ở tủ 280
C trong 24 - 48 giờ. Những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trƣờng giữa ống Craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ đƣợc cấy vào ống nghiệm có chứa 2 ml môi trƣờng LB, lắc ở 70 - 75 vòng/phút trong 12 giờ.
Phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh tƣơng ứng đƣợc quan sát trên kính hiển vi: lấy 2 µl dịch nuôi cấy nhỏ trên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng) và quan sát dƣới kính hiển vi [6]. Thử lần lƣợt với các typ huyết thanh khác, cho đến khi vi khuẩn mất khả năng chuyển động tức là phản ứng ngƣng kết xảy ra.
2.2.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học.
2.2.2.1. (Musca domestica)
Đặt các khay bã bia ở nơi có xuất hiện nhiều ruồi nhà khoảng 1- 2 ngày. Lớp bã bia trong khay dày 5 – 8cm, độ ẩm bã bia đƣợc duy trì ở 65- 70%
Chuyể
24- 30o -
.
Sau 8– , trứng ruồi nở, đ
. Dòi tránh ánh sáng và tìm kiếm nhiệt độ tối ƣu
. .
Khi thành thục, ấu trùng rời khỏi nơi đẻ để tìm nhữ ển thành những con nhộng.
Musca domestica
chuyể . Tuỳ theo điều kiện môi
trƣờng, con trƣởng thành sẽ nở sau 3 ngày cho đến 4 tuần.
ớ . Ruồi nhà thông thƣờng
sau 48 giờ thành con trƣởng thành,
. T
.
2.2.2.2. Định lƣợng mật độ bào tử, tinh thể.
Chủng Bt phân lập đƣợc đƣợc đem cấy thảm trên đĩa peptri chứa môi trƣờng
MPA và nuôi trong tủ ấm 28o
C trong 3-4 ngày sau đó thu lại toàn bộ sinh khối. Sinh khối đƣợc xử lý nhiệt ở 700C trong 10 phút. Dịch đã xử lý nhiệt đƣợc pha loãng ở các nồng độ 10-6
đến 10-9, lấy 100µl mỗi nồng độ pha loãng đƣợc cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trƣờng MPA. Nuôi ở 28 0C sau 24h đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng nhỏ nhất. Số lƣợng bào tử đƣợc tính theo công thức [49]:
CFU= n.a.10
(CFU - Colony forming unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc là số lƣợng bào tử trong 1ml dịch nuôi cấy).
n : Số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng. a : nồng độ pha loãng.
2.2.2.3. Thử hoạt tính trên ấu trùng ruồi nhà.
Ấu trùng ruồi nhà thử nghiệm: Sử dụng ấu trùng Musca domestica tuổi 1, 2, 3. Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tƣợng ấu trùng ruồi nhà Musca domestica
theo phƣơng pháp của Thiery và Frachon ở hai nồng độ là 107
và 109 bào tử/ml [55]. Mỗi nồng độ đƣợc thử nghiệm với 3 cốc nhựa (mỗi cốc 10 ấu trùng).
Chuẩn bị:
Các chủng Bacillus thuringiensis đƣợc cấy trang trên môi trƣờng MPA, nuôi lắc ở 28 0C trong 72 giờ. Sau đó, thu sinh khối tế bào vào ống eppendoft có chứa 1ml nƣớc cất vô trùng. Tiếp theo, tiến hành pha loãng đến mật độ 107 và 109 bào tử/ml để thử hoạt tính. Cơ chất để thử hoạt tính đƣợc sử dụng giống với cơ chất trong quá trình nhân nuôi ấu trùng ruồi nhà (bã bia). Nuôi ở nhiệt độ phòng, ở nơi thoáng mát, độ ẩm của thức ăn cần đƣợc duy trì ổn định. Theo dõi tỉ lệ
chết trong 3 - 5 ngày.
Tỉ lệ ấu trùng chết đƣợc tính theo công thức Abbott [13]: A=(C-T).100/C Trong đó: A: % ấu trùng ruồi nhà chết.
C: Số ấu trùng ruồi nhà sống ở mẫu đối chứng. T: Số ấu trùng ruồi nhà sống ở mẫu thí nghiệm.
2.2.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn.
- Cấy khuẩn lạc vi khuẩn vào 2 ml môi trƣờng LB, lắc qua đêm 200vòng/phút ở 37oC.
- Hút 1,5 ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 6000 vòng/phút (4oC, 10phút). - Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa. - Bổ sung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Ly tâ , ủ -20o
C ).
- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu cặn, làm khô tự nhiên - Bổ sung 30- 40 µl Rnase, ủ ở 37oC trong 1 giờ, bảo quản ở -200
C.
2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạchplasmid của E. coli.
- Đẩy nƣớc trong ống eppendorf có chứa DNA plasmid tách từ vi khuẩn lên 500 µl. - Bổ sung chloroform : Isoamyl alcohol (24:1). Tỷ lệ bổ sung là 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 1/10 NaOAC hoặc KOAC (1NaOAC/10 dịch nổi).
- Đẩy lên 1,5 ml bằng cồn tuyệt đối, ủ ở -20oC trong 4giờ hoặc qua đêm. - Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu tủa.
- Rửa bằng 300 µl cồn 70oC, ly tâm 12000 vòng/phút. Thu cặn, làm khô tự nhiên. - Bổ sung 45 µl dH2O làm tan tủa, bảo quản ở -20o
C
2.2.5. Phƣơng pháp PCR khuếch đại gen cry2A.
*/ Thành phần phản ứng PCR cho một chủng một cặp mồi với tổng thể tích 20µl là:
dNTPs : 2 µl Buffer : 2 µl Primer F : 1 µl Primer R : 1 µl Glyxerol : 1 µl DMSO : 1 µl Taq : 0,3 µl DNA : 2 µl Nƣớc khử ion : 9,7 µl
*/ Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuyếch đại gen cry2A:
94oC 94oC 56oC 72oC 72oC 4oC
3 phút 1 phút 1 phút 20 giây 2 phút 10 phút ∞
30 chu kỳ
2.2.6.Phƣơng pháp điện di trên gel agarose.
Nguyên tắc: Đây là phƣơng pháp sử dụng để phân tích định tính cũng nhƣ
định lƣợng của acid nucleic. Phƣơng pháp điện di dựa vào cấu trúc của acid nucleic. Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó
ở trong điện trƣờng nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trƣờng và di chuyển về phía cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của phân tử này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là trọng lƣợng phân tử của acid và nồng độ các chất cấu thành gel.
2.2.7. Phƣơng pháp tách dòng gencry2.
2.2.7.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1.
Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4 - DNA ligase. Tùy vào nồng độ và chiều dài của đoạn gen cần nối mà có tỉ lệ trộn
mẫu plasmid và đoạn gen nối (Sản phẩm PCR) khác nhau. Quá trình nối ghép đƣợc thực hiện trong điều kiện 4 - 6oC để tạo vector tái tổ hợp.
Thành phần phản ứng:
2X ligation buffer: 5 µl Vector: 1 µl
T4 - DNA ligase : 1 µl Sản phẩm PCR: 3 µl
2.2.7.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α.
*/ Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α vào môi trƣờng LB, nuôi lắc qua đêm 37o
C. - Cấy chuyển 10% vào bình tam giác chứa 30 ml môi trƣờng LB, nuôi lắc ở 37oC trong 1,5 - 2 giờ.
- Ủ đá (4oC trong 1 giờ hoặc 45 phút), thỉnh thoảng đảo nhẹ.
- Hút vào ống eppendorf 1,5 trong điều kiện vô trùng (hút trong box) - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Rửa bằng 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Bổ sung 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều rồi ủ đá 2 giờ (15 phút đảo 1 lần). - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút (thu tế bào).
- Bổ sung 1 - 1,5 ml CaCl2 0,1M, voltex nhẹ, ủ đá 1 giờ (15 phút đảo 1 lần). - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào.
- Hút 5 µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gen vào dịch tế bào khả biến.
- Ủ đá 30 phút (tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).
- Sốc nhiệt 42oC trong 60 - 90 giây. Chuyển vào đá 2 phút.
- Bổ sung 200 - 300 µl môi trƣờng LB, lắc ở 37oC trong 1 - 1,5 giờ.
- Trang 100 µl vào đĩa peptri chứa môi trƣờng LBA có bổ sung kháng sinh Ampicillin và X-gal. Nuôi ở 37oC từ 14 - 16 giờ.
2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng.
Tiến hành xác định trình tự theo phƣơng pháp của Sanger và cộng sự, dựa vào sự tổng hợp các mạch bổ sung cho mạch đơn DNA cần xác định. Dƣới sự xúc tác của enzyme DNA - polymerase.
Đặc trƣng của phƣơng pháp là ngoài việc sử dụng 4 nucleotide thông thƣờng, nó còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã đƣợc đánh dấu bằng huỳnh quang. Đây là những dideoxynucleotide có nhóm -OH ở đầu 3’ đƣợc thay bằng -H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các đầu nối phosphodieste và do đó làm ngừng quá trình tổng hợp.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide có bổ sung ure để làm tăng độ phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế.
2.2.9. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %
Điện di trên gel polyacrylamide thƣờng đƣợc sử dụng để tách riêng các băng protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau, đôi khi phƣơng pháp này còn đƣợc dùng để tách các đoạn DNA có kích thƣớc nhỏ (dƣới 200 bp). Trong phƣơng pháp này, gel đƣợc đổ giữa hai bản thủy tinh mỏng theo phƣơng thẳng đứng. Công thức đổ gel polyacrylamide 12,6 %.
Gel tách: dH2O 1,968 ml Tris HCl (3M; pH 8,8) 1 ml Acrylamide – bis 30% 3,36 ml Glycerol 50 % 1,6 ml SDS 10 % 40 l APS 10 % 40 l Temed 6,4 l Gel cô: dH2O 0,85 ml Tris HCl (3M; pH 8,8) 165,25 l Acrylamide – bis 30% 212,5 l SDS 10 % 6,25 l APS 10 % 12,5 l Temed 1 l
Mẫu sau khi đƣợc xử lý với SDS buffer và biến tính (95 oC trong 10 phút) đƣợc tra vào các giếng nhỏ trong gel.
Quá trình chạy điện di đƣợc tiến hành dƣới hiệu điện thế 300 V hoặc cƣờng độ dòng điện là 40 mA.
Sau khi điện di xong, bản gel đƣợc gỡ ra và nhuộm trong dung dịch Coomassie Brilliant Blue 0,25 %, lắc khoảng 1 giờ trên máy lắc. Sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng dung dịch tẩy màu, lắc trên máy lắc khoảng 30 phút thì đổ dịch nhuộm đi cho nƣớc vào và có thể quan sát trực tiếp.
2.2.10. Phƣơng pháp biểu hiện gen
- Cấy hoạt hoá 1 khuẩn lạc trong môi trƣờng LB có bổ sung ampicilin (100 mg/ ml) với nồng độ cuối là 50 g/ ml, nuôi lắc ở 370C qua đêm.
- Cấy chuyển 1% vào 20 ml môi trƣờng MPB có bổ sung kháng sinh ampicilin nồng độ là 50 g/ ml và nuôi lắc ở 370C để OD đạt 0,5-0,8 (Khoảng 2-3h).
- Hút 10 ml làm đối chứng trƣớc cảm ứng và tiếp tục nuôi lắc ở 370
C trong 4h để thu mẫu không cảm ứng.
- Phần còn lại, cảm ứng IPTG (100 mM) đạt 1mM, nuôi ở 370
C trong 4h.
- Thu mẫu sau cảm ứng, ly tâm thu tế bào 6000 v/p trong 10 phút.
- Rửa tế bào bằng nƣớc khử ion 200 l, ly tâm 6000 v/p trong 5 phút, thu tế bào.
- Bổ sung 200 l nƣớc khử ion, làm tan tế bào.
- Lấy 30 l dịch trên bổ sung thêm 5 l treatment buffer 6X.
- Xử lý mẫu ở 950
C trong 10 phút.
- Điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.
- Nhuộm bản gel bằng Comassie Brilliant trong 30 phút trên máy lắc.
- Tẩy màu và quan sát trực tiếp.
2.2.11. Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện
a, Khảo sát điều kiện nhiệt độ thời gian và thích hợp cho quá trình biểu hiện
Quá trình biểu hiện đƣợc thực hiện ở các nhiêt độ khác nhau (250
C, 280C, 300C, 370C) với nồng độ cảm ứng IPTG (100mM) 1mM ở 370C trong 5h và lấy mẫu theo thời gian (0, 1, 2, 3, 4, 5h) để xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình biểu hiện gen cry2A.
Cố định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình biểu hiện gen cry2A,
tiến hành biểu hiện lại ở những nồng độ IPTG khác nhau, cụ thể là: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,5 mM; 0,7 mM; 1; 2 mM.
Thu mẫu và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid 12,6%.
2.2.12. Xác định khả năng hoà tan của protein
- Mẫu sau khi biểu hiện đƣợc ly tâm 6000 v/p trong 10 phút, thu tủa.
- Rủa tế bào và ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phút.
- Bổ sung 100 ml dung dịch C.
- Ủ ở 370
C trong 30 – 60 phút.
- Siêu âm.
- Ly tâm, thu dịch pha trên (phần tan).
- l nƣớc khử ion, vortex.
- l Treatment buffer 6X
- Điện di kiểm tra khả năng hòa tan của protein trên gel polyacrylamide 12,6%.
2.2.13. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin
Quá trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau:
Bƣớc 1: Chuẩn bị dịch tế bào trƣớc khi đƣa lên cột
- Làm tan hoàn toàn Guanidinium Lysis Buffer
- Ly tâm huyền dịch tế bào (100 ml) đã kiểm tra khả năng biểu hiện, thu cặn tế bào.
- Hoà lại tế bào trong 8 ml Guanidinium Lysis Buffer, pH= 7,8.
- Làm tan cặn tế bào bằng cách lắc nhẹ trên máy vortex ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 phút.
- Phá màng tế bào bằng máy siêu âm trong thời gian 15 phút – 20 phút, để huyền dịch tế bào trên đá, phá tế bào bằng máy Labsonic
- Ly tâm dịch phá tế bào ở tốc độ 1000 vòng trong thời gian 15 phút, thu dịch nổi, loại xác tế bào.
Bƣớc 2: Chuẩn bị cột
- Lắc đều để proBond TM Resin tạo thành huyền dịch đồng nhất
- Dùng pipet hút 2ml huyền dịch Nikel Resin đƣa lên cột tinh sạch dung tích 10ml
- Rửa cột bằng 6 ml nƣớc khủ ion
- Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer
- Hoà lại Resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phƣơng thẳng đứng để Resin lắng xuống. Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer
- Hoà lại Resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phƣơng thẳng đứng để Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột và cho dịch chảy qua cột
- Bƣớc 3 Đƣa protein lên cột và đẩy ra khỏi cột
- Đƣa 8 ml dung tích phá tế bào sau ly tâm lên cột
- Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phút - 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó để cột lại theo phuong thẳng đứng để huyền dịch Nikel Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột.
- Rửa cột bằng 4ml Denaturing Binding Buffer, pH= 7,8, lặp lại 3 lần.
- Rửa cột bằng 4ml Denaturing Wash Buffer, lặp lại 3 lần
- Rửa cột bằng 8 ml Native Wash Buffer
- Đẩy protein tái tổ hợp ra khổi cột bằng 8 ml Native Elusion Buffer, thu 12 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml
VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định h Bacillus thuringiensis nghiên
cứu.
Bacillus thuringiensis
cầ ỡng tháp, ập phƣơng
u. Vì vậy, từ 45 chủng Bacillus
thuringiensis đã đƣợc phân lậ ), Nha Trang và Lâm
Đồng trong bộ sƣu tập của phong Di truyền vi sinh vật chƣa đƣợc nghiên cứu tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng MPA. Sau 3 ngày qua
. Sau khi quan sát, kết quả thu đƣợc nhƣ sau (Hình 3.1 và Bảng 3.1):
Hình 3.1. Hình dạng bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt
A: Hình dạng tinh thể và bào tử ở độ phóng đại 1000 lần dƣới kính hiển vi quang học (1: tinh thể, 2:bào tử).
B: Hình dạng tinh thể của chủng MSS8.4 dƣới kính hiển vi điện tử.