Giải mã vùng gen barcoding(cytochrome c oxidase 1 CO1) cho một số mẫu bướm ngày thu tại hà giang, việt nam

Vùng gen CO1 Cytochrome c oxidase subunit 1 trong gen ti thể có độ dài 658 bp base pair được các nhà khoa học công nhận là vùng gen chuẩn để nhận dạng loài trên Hệ thống dữ liệu mã vạch

Trang 1

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Tô Văn Quang

BƯỚM NGÀY THU TẠI HÀ GIANG, VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Trang 2

VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Tô Văn Quang

GIẢI MÃ VÙNG GEN BARCODING (CYTOCHROME C OXIDASE 1 – CO1) CHO MỘT SỐ MẪU

BƯỚM NGÀY THU TẠI HÀ GIANG, VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trần Thị Việt Thanh

Thành phố Hồ Chí Minh - 2021

Trang 3

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm

Tác giả luận văn

Tô Văn Quang

Trang 4

Tôi xin gởi lời cám ơn chân thành đến quý thầy cô Học viện Khoa học

và Công nghệ và Khoa Công nghệ Sinh học vì những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho tôi trong suốt thời gian học tập

Tôi xin cảm ơn dự án VIETBIO, đặc biệt cảm ơn Tiến sĩ Christoph Häuser, Thomas von Rintelen, Théo Léger và tất cả mọi người ở Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Berlin đã nhiệt tình hỗ trợ tập huấn và tài trợ nghiên cứu để tôi thực hiện luận văn tốt nhất có thể

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn Tiến sĩ Trần Thị Việt Thanh, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam vì đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi trân trọng gởi lời cảm ơn tới Tiến sĩ Lưu Hồng Trường, Viện trưởng Viện Sinh thái học Miền Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè lớp 2019A và 2019B, anh chị em đồng nghiệp, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Trang 5

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

Công cụ tìm kiếm gióng cột cục bộ cơ bản

Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống

cặp ba-zơ

Ngân hàng dữ liệu trình tự di truyền

Phản ứng khuếch đại gen

Trang 6

Bảng 1.1 Một số cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu mã vạch DNA ở bướm 8 Bảng 1.2 Dữ liệu mã vạch DNA của nhóm bướm trên BOLD 9 Bảng 1.3 Dữ liệu mã vạch DNA của nhóm bướm ở Việt Nam trên BOLD 12 Bảng 2.1 Danh sách các mẫu bướm được dùng trong nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Danh sách các mẫu được lựa chọn trên BOLD có trình tự vùng gen CO1 tương ứng với mẫu nghiên cứu 20 Bảng 3.1 Danh sách các mẫu nghiên cứu được cấp mã số trên GenBank 23 Bảng 3.2 Tổng hợp mức độ tương đồng (%) và vị trí sai khác của các mẫu nghiên cứu với các mẫu tương đồng nhất trên BOLD 39 Bảng 3.3 Các loài bướm có trình tự vùng gen CO1 lần đầu tiên ghi nhận cho Việt Nam 44

Trang 7

Hình 1.1 Số lượng mã vạch DNA và số lượng loài đại diện thuộc các họ bướm khác nhau được ghi nhận ở Việt Nam đã có trên BOLD 12 Hình 1.2 Vị trí cao nguyên đá Đồng Văn trên bản đồ Việt Nam 13 Hình 2.1 Vị trí thu mẫu (chấm tròn ) thuộc xã Lũng Cú, huyện Đồng Văn 16 Hình 2.2 Bốn nucleotide được thể hiện bằng bốn màu khác nhau trên phần mềm ChromasPro 2.1.10 19 Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu vật 22 Hình 3.2 Kết quả giải trình tự hai chiều của mẫu Hes9 thể hiện trên phần mềm ChromasPro 2.1.10 22

Hình 3.3 Thông tin, dữ liệu mẫu OK342239 của loài Carterocephalus alcina thể hiện trên trang web của GenBank 24 Hình 3.4 Thông tin, dữ liệu mẫu OK340917 của loài Dodona ouida thể hiện trên trang web của GenBank 25

Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342239 và OK342240 với các loài

thuộc giống Carterocephalus 26

thuộc giống Sebastonyma 27

thuộc giống Catochrysops 28

thuộc giống Cigaritis (Spindasis) 29

thuộc giống Curetis 30

Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại mẫu Nym-A09 và Nym-B09 với các loài

thuộc giống Dilipa 31

Trang 8

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342127 và OK342128 với các

loài thuộc giống Vanessa 33

loài thuộc giống Colias 34

loài thuộc giống Gonepteryx 35

loài thuộc giống Pieris 36

Hình 3.16 Cây phát sinh chủng loại mẫu OK340914, OK340915, OK340916,

OK340917, OK340918 và OK340919 với các loài thuộc giống Dodona 38

Hình 3.17 Cây phát sinh chủng lọai của các mẫu nghiên cứu với các mẫu có

độ tương đồng cao nhất tham khảo trên BOLD 40 Hình 3.18 Tình trạng phân loại của loài Curetis bulis 41 Hình 3.19 Tình trạng phân loại của loài Dodona eugenes 42

Hình 3.20 Mẫu OK342127 (bên trái) và OK342128 (bên phải) của loài

Vanessa indica thu được tại tỉnh Hà Giang 43

Dodona dipoea thu được tại tỉnh Hà Giang 44

Dodona eugenes thu được tại tỉnh Hà Giang 45

Dodona ouida thu được tại tỉnh Hà Giang 45

Sebastonyma dolopia thu được tại tỉnh Hà Giang 45

Catochrysops strabo thu được tại tỉnh Hà Giang 46

Trang 9

Dilipa morgiana thu được tại tỉnh Hà Giang 47

Gonepteryx amintha thu được tại tỉnh Hà Giang 47

Trang 10

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 MÃ VẠCH DNA 5

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DNA CỦA BƯỚM NGÀY 7

1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới 7

1.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 11

1.2.3 Nghiên cứu ở Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh Hà Giang 13

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 VẬT LIỆU 16

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Định loại mẫu vật 18

2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 18

2.2.3 Phản ứng khuếch đại gen và giải trình tự 18

2.2.4 Phân tích dữ liệu 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 KẾT QUẢ 22

3.1.1 Giải trình tự vùng gen CO1 của các mẫu bướm 22

3.1.2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho từng loài bướm 26

3.1.2.1 Giống Carterocephalus 26

3.1.2.2 Giống Sebastonyma 27

3.1.2.3 Giống Catochrysops 28

3.1.2.4 Giống Cigaritis (Spindasis) 29

3.1.2.5 Giống Curetis 30

3.1.2.6 Giống Dilipa 31

3.1.2.7 Giống Symbrenthia 32

3.1.2.8 Giống Vanessa 33

3.1.2.9 Giống Colias 34

3.1.2.10 Giống Gonepteryx 35

Trang 11

3.1.2.11 Giống Pieris 36

3.1.2.12 Giống Dodona 37

3.1.3 Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho tất cả mẫu nghiên cứu 38

3.2 THẢO LUẬN 41

3.2.1 Phân tích tình trạng phân loại một số loài bướm 41

3.2.2 Một số ghi nhận mới cho Việt Nam 43

3.2.3 Một số ghi nhận mới cho GenBank 46

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 KẾT LUẬN 48

4.2 KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Hình ảnh 28 mẫu vật đại diện cho 14 loài bướm ngày sử dụng trong luận văn

Phụ lục 2 Trình tự vùng gen CO1 của các mẫu nghiên cứu và các mẫu so sánh tương đồng nhất

Phụ lục 3 Dẫn chứng 28 trình tự của 14 loài bướm ngày trong luận văn được công bố trên GenBank

Công trình của tác giả "Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu bướm"

Trang 12

MỞ ĐẦU

Mã vạch DNA trong những năm gần đây được xem như một công cụ hữu hiệu hỗ trợ nghiên cứu phân loại học truyền thống với ưu điểm nhanh, chi phí thấp, độ chính xác cao Việc sử dụng mã vạch DNA xác định tên loài được thực hiện thành công trên nhiều đối tượng động vật khác nhau, từ động vật bậc thấp như động vật thân mềm, côn trùng cho tới các loài động vật bậc cao như lưỡng

cư, bò sát, chim và thú Vùng gen CO1 (Cytochrome c oxidase subunit 1) trong gen ti thể có độ dài 658 bp (base pair) được các nhà khoa học công nhận là vùng gen chuẩn để nhận dạng loài trên Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (BOLD) Bướm ngày là nhóm sinh vật nhận được nhiều sự quan tâm nhất kể

từ lúc mã vạch DNA bắt đầu được nghiên cứu, và ngày càng mở rộng ở khắp nơi trên thế giới, hỗ trợ các nhà khoa học trong quá trình định danh bằng hình thái thông thường, góp phần giải quyết những vấn đề phức tạp trong mối quan

hệ di truyền và tiến hóa giữa các loài với nhau

Việt Nam là quốc gia có sự đa dạng về bướm ngày cao, với gần 1.200 loài đã được ghi nhận, trong đó có rất nhiều loài đặc hữu và quý hiếm, có ý nghĩa bảo tồn Tuy nhiên, các dữ liệu công bố về mã vạch DNA ở Việt Nam còn rất hạn chế, cho thấy tiềm năng nghiên cứu mã vạch DNA trên bướm ở Việt Nam là rất lớn Đặc biệt, khu hệ bướm ở Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh

Hà Giang có thành phần loài đa dạng và có tính đặc hữu cao ở Việt Nam, nhưng

dữ liệu về mã vạch DNA thì rất ít Chính vì thế, đề tài luận văn “Giải mã vùng gen Barcoding (Cytochrome c oxidase 1 - CO1) cho một số mẫu bướm ngày thu tại Hà Giang, Việt Nam” được thực hiện với những mục tiêu cụ thể như sau:

(1) Giải trình tự vùng gen CO1 cho 20-30 mẫu vật của 10-15 loài và đăng

ký thành công các trình tự nghiên cứu với GenBank

(2) So sánh trình tự mẫu nghiên cứu với trình tự các mẫu tương tự đã công bố trên BOLD nhằm kiểm tra tính chính xác của quá trình định tên loài

(3) Phân tích sự sai khác về hình thái đối sánh với kết quả đọc trình tự của một số loài có hình thái tương đồng

Trang 13

Nghiên cứu di truyền các loài sinh vật là hướng đi giàu tiềm năng, phù hợp với xu thế chung trên thế giới Kết quả của luận văn không những góp phần

bổ sung cơ sở dữ liệu mã vạch DNA các loài sinh vật trong nước và quốc tế,

mà còn là thông tin cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn nhằm hoàn thiện bức tranh đa dạng sinh học, giúp giải quyết các vấn đề liên quan đến phân loại học, sinh thái học và tiến hóa trong tương lai

Trang 14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÃ VẠCH DNA

Phân loại học đã có nhiều sự thay đổi đáng kể trong gần ba thế kỉ qua Trước đây, các mẫu vật được thu thập và xử lý cẩn thận để bảo toàn những đặc điểm phân biệt, và đòi hỏi sự đánh giá của các chuyên gia phân loại nhằm so sánh những khác biệt về giải phẫu giữa các loài có quan hệ họ hàng gần nhau Phương pháp phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, đặc biệt với mẫu không nguyên vẹn, hoặc mẫu vật có hình thái tương đồng, hoặc biến đổi hình thái (do yếu tố khí hậu, địa lý) trong cùng một loài, dẫn đến việc có rất nhiều tên đồng danh hoặc định danh sai Sự phát triển vượt trội của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ máy tính và công nghệ gen đã tạo ra những biến đổi lớn trong phân loại học, trong đó yếu tố di truyền đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc xác định mối quan hệ và quá trình tiến hóa giữa các loài với nhau Mã vạch DNA (DNA barcodes hoặc DNA barcoding) được xem như là một công cụ hữu hiệu cho phép nhận dạng chính xác loài với lượng mẫu rất nhỏ thông qua mẫu vật còn nguyên hoặc không nguyên vẹn, có thể bị hư hỏng (tiêu bản sấy khô, mẫu lâu năm) hoặc đã bị xử

lý công nghiệp [1] Nguyên lý của phương pháp mã vạch DNA là dựa trên việc

so sánh các trình tự DNA ngắn giữa mẫu chưa biết với nguồn cơ sở dự liệu gen sẵn có, từ đó xác định tên loài cho mẫu nghiên cứu Về lý thuyết và thực nghiệm, phương pháp mã vạch DNA đã được chứng minh trên nhiều đối tượng khác nhau, bao gồm virus, vi khẩn, nấm, tảo, thực vật và động vật [1, 2]

Trải qua gần ba thập kỉ, các nhà khoa học đã thu thập được một nguồn

cơ sở dữ liệu trình tự nucleotide khổng lồ ở khắp nơi trên thế giới, và được lưu trữ trên Ngân hàng dữ liệu trình tự di truyền (Genetic Sequence Data Bank – GenBank) tại địa chỉ http://www.ncbi.nlm.nih.gov GenBank được xây dựng

và chia sẻ bởi Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information – NCBI) trực thuộc Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ (National Institutes of Health – NIH) Đây là một kho dữ liệu toàn diện chứa 2,1 tỷ trình tự nucleotide có sẵn công khai cho khoảng 478.000 loài, và thường xuyên được cập nhật theo các quy tắc thống nhất với Cơ quan lưu trữ

Trang 15

Nucleotide Châu Âu (European Nucleotide Archive – ENA) và Ngân hàng Dữ liệu DNA Nhật Bản (DNA Data Bank of Japan – DDBJ), đảm bảo phạm vi phủ sóng trên toàn cầu [3] Đồng thời, một Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (Barcode of Life Data System – BOLD) có địa chỉ www.barcodinglife.org cũng

đã được xây dựng để quản lý, giới hạn các trình tự được chọn làm mã vạch DNA có chất lượng và độ tin cậy cao dựa vào các trình tự đã có trên GenBank [4] Đi kèm với đó là Công cụ tìm kiếm gióng cột cục bộ cơ bản (Basic local alignment search tool – BLAST), là một phương pháp sử dụng thuật toán heuristics để truy vấn các vùng tương đồng ở bên trong các chuỗi trình tự (nucleotide hoặc protein) với nhau, nhằm xác định trình tự đang thao tác giống hoặc gần giống với trình tự nào có trong GenBank BLAST và trang web https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi lần đầu tiên được giới thiệu vào khoảng năm 1990, có cập nhật sửa đổi vào năm 1997 [5, 6] Sau đó, với sự phát triển vượt bậc của khoa học công nghệ, đặc biệt là công nghệ thông tin và công nghệ sinh học, vào cuối năm 2009, NCBI đã thay thế các bộ công cụ cũ, cung cấp phiên bản BLAST mới hơn (được gọi là BLAST+) dựa trên bộ công cụ NCBI C++ làm nền tảng phát triển trở về sau [7] Đây là một công cụ quan trọng thiết yếu hỗ trợ các nhà khoa học có thể dễ dàng kiểm tra, đối chiếu dữ liệu nghiên cứu với các dữ liệu đã có sẵn một cách nhanh chóng và chính xác

Khái niệm mã vạch DNA được đề xuất dựa trên vùng gen Cytochrome c oxidase 1 (viết tắt là CO1) của gen ti thể (mitochondrial), có độ dài 658 bp [2] Sau này, các kết quả nghiên cứu trên nhiều nhóm sinh vật cho thấy có những vùng gen khác cũng có thể được lựa chọn làm mã vạch DNA, bên cạnh vùng gen CO1 được sử dụng rộng rãi trên động vật, thì các vùng gen rbcL, matK, ITS, … thường được sử dụng trên thực vật, nấm và các loài sinh vật khác [1]

Do đó, chưa có đoạn gen chuẩn nào được sử dụng làm mã vạch chung cho tất

cả các loài trên thế giới Việc lựa chọn những đoạn gen đặc trưng để làm mã vạch và kết hợp các đoạn mã vạch DNA với nhau là rất cần thiết, giúp phân biệt các loài tốt hơn, đặc biệt là các loài quan hệ họ hàng gần gũi với nhau [1]

Do có tính bảo thủ cao, vùng gen CO1 đã đạt được nhiều thành công lớn

và được lựa chọn là gen mã vạch chuẩn cho nhiều nhóm trong giới động vật,

Trang 16

điển hình như là côn trùng, cá, chim [1] Đặc biệt, bướm ngày là một trong những nhóm sinh vật nhận được nhiều sự quan tâm nhất kể từ lúc mã vạch DNA bắt đầu được nghiên cứu đến nay Cách tiếp cận này đã giúp giải quyết mối quan hệ phức tạp giữa các loài bướm với nhau, hỗ trợ rất nhiều trong nghiên cứu sinh thái học, tiến hóa và phân loại học với những thông tin chi tiết được trình bày trong phần nội dung tiếp theo

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DNA CỦA BƯỚM NGÀY

1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới

Bướm ngày (sau đây gọi tắt là bướm) là một trong những nhóm côn trùng đẹp, có màu sắc sặc sỡ và nhận được nhiều sự quan tâm tìm hiểu của các nhà khoa học từ những thế kỉ trước Chúng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc nghiên cứu sự hình thành loài, sinh thái học quần xã, địa lí sinh học, biến đổi khí hậu, tương tác giữa côn trùng và thực vật, bao gồm cả loài chỉ thị và loài dịch hại [8]

Bướm thuộc bộ Lepidoptera, siêu họ Papilionoidea và có sự sắp xếp về mặt phân loại học khá phức tạp Các nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền gần đây đã khẳng định rằng, siêu họ này với khoảng 18.800 loài được chia làm

07 họ chính là Papilionidae, Hesperiidae, Hedylidae, Pieridae, Lycaenidae, Riodinidae và Nymphalidae [8, 9, 10] Các họ này phân bố ở khắp nơi trên thế giới, ngoại trừ họ Hedylidae phân bố chủ yếu ở khu vực Trung và Nam Mỹ, có

số lượng ít nhất với 36 loài; Nymphalidae, Lycaenidae, Hesperiidae là những

họ có số lượng nhiều nhất với khoảng 6.000, 5.200 và 4.000 loài tương ứng; trong khi đó, Riodinidae, Pieridae và Papilionidae có số lượng loài không nhiều với khoảng 1.500, 1.100, 1.000 loài đã được mô tả [8, 9, 10]

Cùng với sự phát triển của xu hướng nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử, nghiên cứu mã vạch DNA, đặc biệt là trình tự vùng gen CO1 của nhóm bướm đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong thời gian qua Đồng thời, một số cặp mồi cũng đã được phát triển để có thể thu nhận tốt nhất trình

tự vùng gen CO1 trong nghiên cứu mã vạch ở bướm (xem Bảng 1.1)

Trang 18

định danh, đại diện cho 9.855 loài, chiếm hơn 50% tổng số loài bướm trên thế giới (xem Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Dữ liệu mã vạch DNA của nhóm bướm trên BOLD

loài đại diện

Trong khi đó, ở khu vực Bắc Mỹ gồm Mỹ và Canada, 814 trong tổng số

846 loài đã được cập nhật dữ liệu mã vạch DNA với tỉ lệ phân biệt các loài đơn

lẻ là hơn 80% [19]

Một nghiên cứu mã vạch DNA mới đây đã tổng hợp được dữ liệu trình

tự vùng gen CO1 của 459 loài bướm, chiếm 97% tổng số loài ở Châu Âu [20], trong đó Romania có 180 loài với tỉ lệ nhận biết các loài riêng biệt là 90% [21],

và vùng bán đảo Iberia có 228 loài với gần 94% là các loài tách biệt [22]

Trình tự vùng gen CO1 cũng mới được thực hiện nghiên cứu trên các loài bướm ở châu Phi trong thời gian gần đây Cụ thể, các nhà khoa học đã xác

Trang 19

định được mã vạch DNA của 116 loài, qua đó nâng tổng số lượng mã vạch DNA lên 147 loài và 16 loài định danh đến giống trên tổng số hơn 1.300 loài ở Nigeria, với khả năng phân tách các loài riêng biệt đạt 90,2% [23]

Mặc dù số lượng bướm không nhiều, chỉ khoảng 500 loài, nhưng Trung

Á là khu vực điểm nóng về độ phong phú với nhiều chi, loài phụ và nhóm loài đặc hữu đa dạng [13] Bằng cách nghiên cứu mã vạch DNA ở Kazakhstan, Kyrgyzstan, Tajikistan, Turkmenistan, Uzbekistan và một phần tây nam nước Nga (phần Châu Á), các nhà khoa học đã khuếch đại thành công đoạn gen CO1 của 353 loài bướm, trong đó tỉ lệ các loài phân biệt rõ ràng chiếm 90% [13]

Cách đó không xa, mã vạch DNA của 81 trên tổng số 320 loài bướm ở Pakistan cũng đã được thu thập với 100% là các loài khác nhau [24] Qua phân tích và so sánh dữ liệu với khu hệ bướm ở Trung Á, các nhà khoa học nhận định khu hệ bướm ở Pakistan phản ánh khả năng cách ly di truyền hiệu quả với các nước láng giềng qua dãy núi Pamir (cao tới hơn 5.000 mét), tạo nên sự hiện diện của nhiều vùng đặc hữu ở khu vực này [24]

Ở khu vực Đông Nam Á, đã có 233 loài bướm ở Malaysia được giải trình

tự vùng gen CO1 nhưng tỉ lệ phân biệt các loài không cao, chiếm khoảng 78% [25] Trong khi ở Thái Lan, một khảo sát mới đây nhất đã ghi nhận được trình

tự vùng gen CO1 cho 51 loài bướm từ 10 công viên đô thị ở thủ đô Bangkok, trong đó có 05 loài định danh đến giống [26]

Có thể thấy, các nghiên cứu mã vạch DNA, đặc biệt là tính đặc hiệu cao của vùng gen CO1, đã hỗ trợ rất nhiều cho việc phân loại và định danh các loài bướm ở khắp nơi trên thế giới Từ đó, nhiều nghiên cứu chuyên sâu trên từng nhóm cụ thể hơn đã được thực hiện liên quan đến hệ thống phân loại họ, giống hoặc chi tiết hơn tới các loài phụ Dựa trên dữ liệu di truyền của 304 loài đại diện cho 80% các giống khác nhau, các nhà khoa học đã đánh giá lại những nghiên cứu trước đó và đề xuất hệ thống phân loại họ Riodinidae với một số tộc (tribe) và tộc phụ (subtribe) mới được bổ sung thêm [27]

Qua phân tích trình tự vùng gen CO1 của 165 mẫu vật thuộc giống

Ypthima ở Malaysia, các nhà khoa học đề xuất loài Y newboldi, trước đây được

Trang 20

xem là loài phụ của Y baldus, nên là một loài riêng biệt; đồng thời ủng hộ một quan điểm khác cho rằng Y nebulosa nên là tên đồng danh của loài Y

horsfieldii humei [28]

Khi nghiên cứu trên vùng gen CO1 của 10 loài phụ Losaria coon, các

nhà khoa học đã chứng minh được rằng, chúng bao gồm hai loài riêng biệt với

04 loài phụ của L coon và 06 loài phụ của L doubledayi [29] Trong khi các loài phụ của L coon chỉ giới hạn ở nam Sumatra, đảo Java và Bawean không quá tách biệt về mặt di truyền, thì các loài phụ của L doubledayi xuất hiện rộng

rãi ở các vùng từ bắc Ấn Độ đến bắc Sumatra, có khoảng cách di truyền tương đối tách biệt nhau do tác động bởi các yếu tố địa hình và cây chủ [29]

Bằng cách nghiên cứu trên vùng gen CO1 kết hợp cùng CO2, các nhà

khoa học đã chứng minh, hai loài phụ Dodona eugenes formosana và D e

esakii đặc hữu ở Đài Loan là cùng một loài, và loài này được chứng minh là

một loài mới D formosana tách biệt hoàn toàn với loài D eugenes trước đó

[30]

1.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Nghiên cứu mã vạch DNA ở Việt Nam mới được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây Một số khảo sát trên vùng gen CO1 của cá, chim, bò sát đã được thực hiện thành công, giúp xác định tên loài cho các mẫu vật bảo tàng [31, 32, 33] và sản phẩm từ động vật [34, 35, 36], đặc biệt là hỗ trợ xác định mối quan hệ di truyền, qua đó phát hiện các loài mới và ghi nhận mới cho khu hệ động vật Việt Nam [37, 38, 39] Tuy nhiên, đến nay chỉ mới có duy nhất một nghiên cứu trên nhóm bướm ở nước ta được công bố, và nghiên cứu này

đã giúp phát hiện một loài mới cho khoa học, đặc hữu tại khu vực cao nguyên Kon Tum [40] Việt Nam là quốc gia có sự đa dạng về bướm rất cao, với 1.181 loài thuộc 06 họ đã được ghi nhận, trong đó Nymphalidae (418 loài), Lycaenidae (318 loài) và Hesperiidae (288 loài) là những họ có số lượng phong phú nhất, còn Papilionidae (69 loài), Pieridae (57 loài) và Riodinidae (31 loài)

có số lượng tương đối ít [41] Thống kê trên BOLD hiện có 80 trình tự của 45 loài bướm ngày đã được ghi nhận, chiếm 3,81% tổng số loài đã được mô tả ở Việt Nam (xem Bảng 1.3) Họ Nymphalidae có nhiều loài nhất với 41 trình tự

Trang 21

của 24 loài, kế đến là họ Hesperiidae với 18 trình tự của 12 loài Họ Lycaenidae

và Papilionidae cùng có 04 loài với lần lượt 06 và 05 trình tự đã được công bố

Họ Pieridae có ít loài nhất với 10 trình tự của 01 loài Riêng họ Riodinidae chưa

có ghi nhận (xem Hình 1.1)

Bảng 1.3 Dữ liệu mã vạch DNA của nhóm bướm ở Việt Nam trên BOLD

loài đại diện

Trang 22

Sự thiếu hụt trầm trọng nguồn dữ liệu về trình tự gen CO1 cho thấy tiềm năng sử dụng mã vạch DNA trên côn trùng, đặc biệt là các mẫu bướm hiện có tại Việt Nam là rất lớn, hỗ trợ những thiếu sót trong phân loại học truyền thống

Do đó, trong khuôn khổ của luận văn, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một số loài bướm thu được thuộc Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh Hà Giang, nơi có thành phần loài bướm đa dạng và có tính đặc hữu cao, nhằm xác định trình tự gen vùng gen CO1 của loài, qua đó ghi nhận và bổ sung dữ liệu mã vạch DNA cho khu hệ bướm ở Việt Nam

1.2.3 Nghiên cứu ở Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh Hà Giang

diện tích 2.356,8 km² và độ cao trung bình khoảng 1.400-1.600 mét, trải rộng trên bốn huyện Quản Bạ, Yên Minh, Đồng Văn, Mèo Vạc của tỉnh Hà Giang (xem Hình 1.2), được Hội đồng tư vấn Mạng lưới Công viên Địa chất Toàn cầu (Global Geoparks Network – GGN) của Tổ chức Giáo dục, Khoa học và Văn hóa Liên Hợp Quốc (United Nations Educational Scientific and Cultural Organization – UNESCO) chính thức công nhận là Công viên địa chất toàn cầu đầu tiên ở Việt Nam và thứ hai ở Đông Nam Á [42]

Hình 1.2 Vị trí Cao nguyên đá Đồng Văn trên bản đồ Việt Nam

(Nguồn: Powell và cộng sự [42])

Trang 23

Cao nguyên có nhiều khu vực núi đá vôi nằm sát chí tuyến Bắc, có độ dốc khá lớn Các thung lũng, sông, suối bị chia cắt rất nhiều Do chịu ảnh hưởng của gió mùa Đông Bắc và sự xâm nhập của các yếu tố bên ngoài, hệ thực vật nơi đây mang sắc thái của khu hệ thực vật á nhiệt đới Hoa Nam – Bắc Việt Nam Một số khu rừng bản địa nhỏ trong khu vực vẫn còn tương đối nguyên vẹn với kiểu rừng đặc trưng là rừng kín thường xanh, trong đó đã pha tạp một

số loài thực vật á nhiệt đới, giỏi chịu hạn và chịu lạnh như thông, sa mộ, de, dổi, chò chỉ, vàng tâm, nghiến, … Ước tính có khoảng 400 loài thực vật và 50 loài động vật đã được ghi nhận ở nơi này, trong đó có nhiều loài đặc biệt quý hiếm như: Lách tách đầu xám, Niệc mỏ vằn, Trèo cây lưng đen, Hồng hoàng, Voọc mũi hếch, Thông Pà cò, Du sam núi đất, Dẻ tùng sọc nâu, Thông đỏ lá ngắn, Cây bảy lá một hoa, … [43]

Cảnh quan đặc sắc với kiểu địa hình và khí hậu độc đáo là điều kiện thuận lợi giúp côn trùng phát triển đa dạng và phong phú ở Cao nguyên đá Đồng Văn Theo kết quả điều tra năm 2014, các nhà khoa học đã ghi nhận được

132 loài bướm ở khu vực này, trong đó có 11 loài định danh đến giống [44] Tuy nhiên, có 01 loài đã ghi sai tên khoa học, và sau khi chỉnh sửa lại, loài

Rhohana parvata (tên sai) bị trùng với loài Rohana parvata (tên đúng) đã có

trong danh lục Như vậy, kết quả điều tra năm 2014 đã ghi nhận được chính xác

là 131 loài bướm Bên cạnh đó, một số dữ liệu đáng tin cậy của các nhà khoa học về thành phần loài bướm ở nơi này cũng đã được tổng hợp, qua đó xác định

có 74 loài, trong đó 19 loài trùng với kết quả điều tra năm 2014 [41, 45] Tóm lại, khu hệ bướm ở Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh Hà Giang hiện có tổng cộng

186 loài, trong đó có 11 loài định danh đến giống

Khu hệ bướm ở đây không những có thành phần loài đa dạng, mà còn được đánh giá có tính đặc hữu cao ở Việt Nam Chiếm hơn 16% tổng số loài

đã được ghi nhận là những loài chỉ phân bố ở Việt Nam trong vùng Cao nguyên

đá Đồng Văn, chẳng hạn như loài Ahlbergia chalcidis, Tajuria illurgis, Papilio

elwesi, Byasa nevilli, Papilio xuthus, … và một số loài đặc hữu mới được mô

tả gần đây, gồm có loài Rapala aenigma, Faunis caelestis [41, 44, 45] Ngoài

ra, khu vực này còn có hai loài bướm quý hiếm có tên trong Sách đỏ Việt Nam

Trang 24

(2007) và Công ước về buôn bán quốc tế các loài động vật, thực vật hoang dã nguy cấp (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild

Fauna and Flora – CITES) là Troides aeacus và Teinopalpus imperialis [44]

Thế nhưng các dữ liệu về mã vạch DNA còn rất ít, chỉ mới có 07 trình tự vùng gen CO1 có ý nghĩa nghiên cứu của 06 loài được ghi nhận trên BOLD, bao gồm

loài Carterocephalus alcina, Euthalia lubentina, Euthalia phemius,

Symbrenthia lilaea, Vanessa cardui, Vanessa indica (02 trình tự) Chính vì thế,

việc nghiên cứu trình tự vùng gen CO1 của các loài bướm ở khu vực này là cần thiết, góp phần hỗ trợ những thiếu sót trong phân loại học truyền thống, đồng thời xây dựng thư viện dữ liệu mã vạch DNA cho khu hệ bướm vùng Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh Hà Giang nói riêng, và cho Việt Nam nói chung Luận văn được thực hiện với những mục tiêu cụ thể như sau:

(1) Giải trình tự vùng gen CO1 cho 20-30 mẫu vật của 10-15 loài và đăng

ký thành công các trình tự nghiên cứu với GenBank

(2) So sánh trình tự mẫu nghiên cứu với trình tự các mẫu tương tự đã công bố trên BOLD nhằm kiểm tra tính chính xác của quá trình định tên loài

(3) Phân tích sự sai khác về hình thái đối sánh với kết quả đọc trình tự của một số loài có hình thái tương đồng

Trang 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Các mẫu bướm dùng để thực hiện trong nghiên cứu này nằm trong bộ sưu tập mẫu vật trao đổi khoa học giữa Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam và Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Berlin, thuộc dự án VIETBIO do Bộ Giáo dục và Nghiên cứu Cộng hoà Liên bang Đức tài trợ

Mẫu bướm được thu từ ngày 20 đến ngày 25 tháng 05 năm 2019 tại vùng

Văn, tỉnh Hà Giang, ở độ cao 1.600 mét so với mực nước biển (xem Hình 2.1)

Hình 2.1 Vị trí thu mẫu (chấm tròn ) thuộc xã Lũng Cú, huyện Đồng Văn

(Nguồn: Công ty Địa ốc Thông Thái [46])

Trang 26

Chúng tôi đã lựa chọn 28 mẫu đại diện cho 14 loài thuộc 05 họ bướm khác nhau, với 02 mẫu / 01 loài (xem Bảng 2.1 và Phụ lục 1), dựa theo một số tiêu chí sau: (1) chưa có dữ liệu trình tự vùng gen CO1 ở Việt Nam; (2) đã có

dữ liệu nhưng chưa đạt đủ độ dài 658 bp hoặc chỉ mới có một mẫu; (3) đặc trưng cho khí hậu, sinh cảnh rừng trên núi cao 1.600 mét; (4) sự khác biệt về hình thái giữa cá thể đực và cái trong cùng một loài; (5) loài còn đang tranh cãi

về mặt phân loại

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu bướm được dùng trong nghiên cứu

1

3

5

7

9

11

13

15

17

19

21

23

25

27

Trang 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Định loại mẫu vật

Hệ thống phân loại họ và tên loài bướm ở Việt Nam dựa theo tài liệu của tác giả Monastyrskii và Devyatkin [41] Mẫu vật được định danh bằng hình thái dựa trên các tài liệu A Check list of Butterflies in Indo-China, chiefly from Thailand, Laos & Vietnam [45], Butterflies of Thailand [47], Butterflies of Vietnam [48], Butterflies of Laos [49], và một số bài báo có liên quan

2.2.2 Tách chiết DNA tổng số

Việc thu nhận DNA tổng số từ mẫu mô là khởi đầu quan trọng cho việc ứng dụng công nghệ sinh học và sinh học phân tử cho các nghiên cứu chuyên sâu về sau Có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số tùy thuộc vào các điều kiện bảo quản mẫu vật khác nhau đã được thực hiện trên thế giới, trong

đó việc tách thành công mẫu bướm khô, đặc biệt là những mẫu tiêu bản lâu năm là rất khó [12, 13, 14] Tại Việt Nam, khi nghiên cứu thử nghiệm ba phương pháp tách DNA khác nhau với ba điều kiện bảo quản mẫu bướm, chúng tôi nhận thấy cả ba phương pháp đều cho kết quả khả quan, trong đó phương pháp không sử dụng phenol vừa an toàn, dễ thực hiện và ít tốn kém, vừa cho hiệu quả thu nhận nồng độ DNA ổn định với lượng mẫu rất nhỏ [50]

Tuy nhiên, trong luận văn này, được sự hỗ trợ từ dự án VIETBIO, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số chủ yếu sử dụng bộ kit DNeasy Blood and Tissue của hãng Qiagen Dùng kéo và kẹp nhọn để phân mảnh chân của mẫu bướm thành các đoạn nhỏ, nhằm phá vỡ lớp vỏ kitin bên ngoài để lớp mô cơ bên trong dễ dàng tiếp xúc với dung dịch phá vỡ màng tế bào Quy trình tách chiết DNA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.2.3 Phản ứng khuếch đại gen và giải trình tự

Cặp mồi LCO1490 (5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)

và HCO2198 (5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’) [11] được

sử dụng cho phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction – PCR) nhằm thu nhận vùng gen CO1 có chiều dài 658 bp Chu trình nhiệt PCR được

Trang 28

lặp lại 35 lần bước 2, 3, 4 gồm (2) biến tính (denaturation) ở 94oC trong 40

trong 06 phút

Sản phẩm PCR được kiểm tra thông qua việc điện di với thạch agarose 0,9%, đánh dấu bằng thuốc nhuộm an toàn và chụp ảnh UV Sau đó, tinh sạch mẫu bằng bộ kit QIAquick PCR Purification của hãng Qiagen (Đức) và chuyển đến công ty Macrogen (Hà Lan) để giải trình tự hai chiều

2.2.4 Phân tích dữ liệu

Sử dụng phần mềm ChromasPro 2.1.10 nhằm kiểm tra chất lượng kết quả giải trình tự của các mẫu vật, với bốn nucleotide được thể hiện bằng bốn màu khác nhau: G–màu đen, T–màu đỏ, C–màu xanh dương, A–màu xanh lá (xem Hình 2.2) Sau đó hiệu chỉnh, loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu, thu nhận trình tự vùng gen CO1 đảm bảo có độ tin cậy cao, tiến hành đăng kí trình tự trên Genbank

Hình 2.2 Bốn nucleotide được thể hiện bằng bốn màu khác nhau trên phần

mềm ChromasPro 2.1.10

Sử dụng BLAST để tìm kiếm trên GenBank mẫu vật của các loài có trình

tự vùng gen CO1 tương đồng hoặc gần tương đồng với các loài nghiên cứu nhằm hỗ trợ việc định danh mẫu vật bằng nguồn gen Sau đó, lựa chọn mẫu vật của các loài có hình thái tương tự và/hoặc có vùng phân bố gần với loài nghiên

Trang 29

cứu Kiểm tra lại mẫu vật trên BOLD, đảm bảo mẫu được lựa chọn có trình tự vùng gen CO1 độ dài lớn hơn 500 bp, phù hợp với mẫu nghiên cứu Có 45 mẫu

đã được chọn lọc từ BOLD, trong đó mẫu MT080189 của loài Acherontia

lachesis được lựa chọn làm nhóm ngoài (xem Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Danh sách các mẫu được lựa chọn trên BOLD có trình tự vùng gen

CO1 tương ứng với mẫu nghiên cứu

longimaculatus MW115563 658 Trung Quốc

Trang 30

25 Vanessa vulcania KJ648986 658 Tây Ban Nha

Trang 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Giải trình tự vùng gen CO1 của các mẫu bướm

Kết quả điện di sản phẩm PCR cho ảnh rõ nét, thể hiện đoạn gen CO1 của 28 mẫu đại diện 14 loài bướm đã được khuếch đại và thu nhận thành công (xem Hình 3.1) Các đỉnh (peak) huỳnh quang sau khi giải trình tự của các mẫu vật cũng thể hiện rõ ràng, cường độ mạnh và tương ứng với từng loại nucleotide khi xem trên phần mềm ChromasPro 2.1.10 (xem Hình 3.2)

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu vật

Hình 3.2 Kết quả giải trình tự hai chiều của mẫu Hes9 thể hiện trên phần

mềm ChromasPro 2.1.10

Tất cả các mẫu đã đăng ký trình tự trên Genbank và được cấp mã số tương ứng, thể hiện ở Bảng 3.1 Vùng gen CO1 của các mẫu nghiên cứu được GenBank công nhận có độ dài là 658 bp, ngoại trừ 06 mẫu OK340914,

OK340915, OK340916, OK340917, OK340918 và OK340919 có độ dài là 600

Trang 32

bp Thông tin, dữ liệu mẫu vật được thể hiện chi tiết trên GenBank, ví dụ như

mẫu OK342239 của loài Carterocephalus alcina có độ dài vùng gen CO1 là

658 bp (xem Hình 3.3) và mẫu OK340917 của loài Dodona ouida có độ dài

vùng gen CO1 là 600 bp (xem Hình 3.4) Như vậy, các mẫu này đủ tiêu chuẩn làm mã vạch DNA và trình tự nucleotide, thông tin, dữ liệu của từng mẫu được

mô tả chi tiết trong phần Phụ lục 2 và Phụ lục 3

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu nghiên cứu được cấp mã số trên GenBank

mẫu

Mã số GenBank

1

3

5

7

9

11

13

15

17

19

21

23

25

27

Trang 33

Hình 3.3 Thông tin, dữ liệu mẫu OK342239 của loài Carterocephalus alcina

thể hiện trên trang web của GenBank

Trang 34

Hình 3.4 Thông tin, dữ liệu mẫu OK340917 của loài Dodona ouida thể hiện

trên trang web của GenBank

Trang 35

Trình tự đoạn gen CO1 của các mẫu trong cùng một loài hoàn toàn giống nhau hoặc sai khác rất nhỏ, chỉ 01 nucleotide, gồm có mẫu OK342273 và

OK342274 của loài Symbrenthia lilaea sai khác ở vị trí 41, mẫu OK342235 và OK342236 của loài Pieris canidia sai khác ở vị trí 196 (xem Phụ lục 2)

3.1.2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho từng loài bướm

3.1.2.1 Giống Carterocephalus

Mẫu OK342239 và OK342240 của loài Carterocephalus alcina được so

sánh với mẫu tương tự trên BOLD có mã số MW115558, MW115571, MW115563 Kết quả cho thấy mẫu nghiên cứu hoàn toàn tương đồng với mẫu MW115558, đạt 100%, chênh lệch 0%, không có sai khác (xem Phụ lục 2) Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại thể hiện rằng mẫu nghiên cứu xếp chung với mẫu MT124684 và tạo thành một nhóm tách biệt với các mẫu khác (xem Hình 3.5) Do đó, mẫu nghiên cứu và mẫu MT124684 được xem là cùng một

loài C alcina

thuộc giống Carterocephalus

Trang 36

3.1.2.2 Giống Sebastonyma

Mẫu OK342222 và OK342223 của loài Sebastonyma dolopia được so

sánh với mẫu tương tự trên BOLD có mã số MN199421 Kết quả cho thấy mẫu

nghiên cứu có độ tương đồng không cao với mẫu MN199421 của loài S

medoensis, đạt 96,96%, chênh lệch 3,04% với 20 sai khác ở vị trí 31, 106, 115,

124, 127, 206, 247, 263, 304, 313, 319, 349, 391, 428, 433, 490, 550, 578, 640,

653 (xem Phụ lục 2) Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại thể hiện rằng mẫu nghiên cứu và mẫu đối chiếu được phân thành hai nhánh khác xa nhau (xem Hình 3.6) Sự khác biệt di truyền giữa các loài trong nhóm bướm thường lớn hơn 3% [2], do vậy, mẫu nghiên cứu và mẫu MN199421 là hai loài khác

nhau, qua đó khẳng định mẫu nghiên cứu là loài S dolopia

thuộc giống Sebastonyma

Trang 37

3.1.2.3 Giống Catochrysops

Mẫu OK342114 và OK342115 của loài Catochrysops strabo được so

sánh với mẫu tương tự trên BOLD có ký hiệu MN727354, HQ570943 Kết quả cho thấy mẫu nghiên cứu hoàn toàn tương đồng với mẫu MN727354, đạt 100%, chênh lệch 0%, không có sai khác (xem Phụ lục 2) Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại thể hiện rằng mẫu nghiên cứu xếp chung với mẫu MT124684

và tạo thành một nhóm tách biệt với các mẫu khác (xem Hình 3.7) Do đó, mẫu

nghiên cứu và mẫu MT124684 được xem là cùng một loài C strabo

thuộc giống Catochrysops

Trang 38

3.1.2.4 Giống Cigaritis (Spindasis)

Mẫu OK342112 và OK342113 của loài Cigaritis syama được so sánh

với mẫu tương tự trên BOLD có ký hiệu MT124684, MW503431, HQ990428, KT236354 Kết quả cho thấy mẫu nghiên cứu hoàn toàn tương đồng với mẫu MT124684, đạt 100%, chênh lệch 0%, không có sai khác (xem Phụ lục 2) Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại thể hiện rằng mẫu nghiên cứu xếp chung với mẫu MT124684 và tạo thành một nhóm tách biệt với các mẫu khác (xem Hình 3.8) Do đó, mẫu nghiên cứu và mẫu MT124684 được xem là cùng một

loài C syama

thuộc giống Cigaritis (Spindasis)

Trang 39

3.1.2.5 Giống Curetis

Mẫu OK342117 và OK342118 của loài Curetis bulis được so sánh với

mẫu tương tự trên BOLD có ký hiệu KF491662, KF226370, HQ570708 Kết quả cho thấy mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao nhất với mẫu KF491662, đạt 99,09%, chênh lệch 0,91%, với 06 sai khác ở vị trí 38, 40, 67, 187, 212, 532 (xem Phụ lục 2) Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại thể hiện rằng mẫu nghiên cứu phân nhánh riêng và có quan hệ gần gũi với mẫu KF491662, tạo thành một nhóm tách biệt với các mẫu khác (xem Hình 3.9) Do đó, mẫu nghiên

cứu và mẫu MN199378 được xem là cùng một loài C bulis

thuộc giống Curetis

Trang 40

3.1.2.6 Giống Dilipa

Mẫu OK342125 và OK342126 của loài Dilipa morgiana được so sánh

với mẫu tương tự trên BOLD có ký hiệu AB501204, EF534094, MW318398 Kết quả cho thấy mẫu nghiên cứu hoàn toàn tương đồng với mẫu AB501204, đạt 100%, chênh lệch 0%, không có sai khác (xem Phụ lục 2) Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại thể hiện rằng mẫu nghiên cứu xếp chung với mẫu AB501204 và tạo thành một nhóm tách biệt với các mẫu khác (xem Hình 3.10)

Do đó, mẫu nghiên cứu và mẫu MT124684 được xem là cùng một loài Dilipa

morgiana

Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại mẫu Nym-A09 và Nym-B09 với các loài

thuộc giống Dilipa

Định dạng
Số trang	120
Dung lượng	21,45 MB