Nghiên cứu khả năng đối kháng với một số vi khuẩn sinh esbl và staphylococcus aursus kháng methicillin (mrsa) của bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT THƯỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT THƯỞNG

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI MỘT SỐ

VI KHUẨN SINH ESBL VÀ STAPHYLOCCCUS AUREUS

KHÁNG METHICILLIN (MRSA) CỦA BỘ SƯU TẬP VI

SINH VẬT NỘI SINH CÂY DƯỢC LIỆU

Mã số đề tài:

Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ sinh – Y sinh

Bình Dương, 03/2016

Bình Dương, 03/2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI MỘT SỐ

VI KHUẨN SINH ESBL VÀ STAPHYLOCCCUS AUREUS

KHÁNG METHICILLIN (MRSA) CỦA BỘ SƯU TẬP VI

SINH VẬT NỘI SINH CÂY DƯỢC LIỆU

Mã số đề tài :

Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ sinh- Y sinh

Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ THU AN Nam, Nữ: Nữ

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 6

1.GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH: 7

1.1.Phân loại đề kháng kháng sinh: 7

1.2.Cơ chế đề kháng kháng sinh: 8

2.GIỚI THIỆU VỀ ENZYME β- LACTAMASE PHỔ RỘNG (ESBL) VÀ STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN: 10

2.1.Giới thiệu về enzyme β – lactamase phổ rộng: 10

2.2.Tình hình dịch tễ học của vi khuẩn sinh ESBL: 11

2.3.Một số vi khuẩn sinh ESBL: 12

2.4.Giới thiệu về Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA): 16

3.CÂY DƯỢC LIỆU VÀ VI SINH VẬT NỘI SINH CÂY DƯỢC LIỆU: 18

3.1 Giới thiệu về cây dược liệu: 18

4.2.Vi sinh vật nội sinh cây dược liệu: 24

5.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI: 26

5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới: 26

5.2.Tình hình nghiên cứu trong nước: 27

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

1.VẬT LIỆU: 29

1.1.Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 29

1.2.Đối tượng nghiên cứu: 29

1.3.Thiết bị, dụng cụ, môi trường: 29

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 30

2.1.Tái kiểm tra, khẳng định các chủng vi khuẩn sinh ESBL: 32

2.2.Tái phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ bộ sưu tập cây dược liệu: 33

2.4.Thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu với vi khuẩn sinh ESBL và MRSA: 37

2.5.Thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu với vi khuẩn sinh ESBL và MRSA: 38

2.6.Thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi nấm nội sinh từ cây dược liệu với vi khuẩn sinh ESBL và MRSA: 39

2.7.Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh của vi sinh vật nội sinh từ cây dược liệu với

một số loại kháng sinh: 40

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

1.KẾT QUẢ: 44

1.1.Tái kiểm tra, khẳng định chủng vi khuẩn sinh ESBL: 44

1.2 Thu nhận chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin: 45

1.3 Tái phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ bộ sưu tập cây dược liệu: 45

1.4 Phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ bộ sưu tâp cây dược liệu: 59

1.5 Thử nghiệm khả năng kháng các chủng vi khuẩn sinh ESBL của vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu: 62

1.6 Thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn nội sinh các cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzyme ESBL : 73

1.7 Thử nghiệm khả năng đối kháng chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin của vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu: 76

1.8.Thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh từ các cây dược liệu với Staphylococcus aureus kháng Methicillin: 79

1.9.Thử nghiệm đối kháng của các chủng vi nấm nội sinh từ các cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzyme ESBL: 82

1.10 Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu với các loại kháng sinh (CLSI, 2013): 85

CHƯƠNG 4- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 87

4.1 KẾT LUẬN: 88

4.2 ĐỀ NGHỊ: 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

Hình 3.3: Hình đại thể vi nấm NDTC3, nội sinh cây Dừa Cạn

Hình 3 4: Kết quả thử đối kháng giữa vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn sinh ESBL

Hình 3.5: Kết quả thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn nội

sinh cây Dừa Cạn với Staphyloccocus aureus kháng methicillin

Hình 3.6: Kết quả thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn nội

sinh cây Vối và cây Dừa Cạn với Staphyloccocus aureus kháng Methicillin

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Tiêu chuẩn sàng lọc vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.1.Bảng các cây dược liệu sử dụng trong thí nghiệm

Bảng 2 1: Các chỉ tiêu quan sát nấm sợi trên thạch

Bảng 2.3:Các chỉ tiêu quan sát vi thể nấm sợi

Bảng 2.4: Tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vùng ức chế của kháng sinh

Bảng 3.2: Kết quả tái kiểm tra chủng vi khuẩn sinh ESBL

Hình 3.3: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Trầu Không

Hình 3.4: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ Hôi

Hình 3.5: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Sâm Đại Hành

Hình 3.6: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ bộ sưu tập cây Diếp Cá Hình 3.7:Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Khổ Qua

Hình 3.8: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Vối

Hình 3.9:Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ tập cây Dừa Cạn

Hình 3.10: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Diệp Hạ Châu Đắng Bảng 3.11: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ Mực

Bảng 3.12: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Đinh Lăng

Bảng 3 13:Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Neem

Bảng 3 14: Kết quả phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ cây Vối Bảng 3.16: Kết quả phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ cây Cỏ Hôi Bảng 3.15: Kết quả phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ cây Dừa Cạn

Bảng 3.15: Kết quả phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ cây Dừa Cạn

Bảng 3.16: Kết quả phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ cây Cỏ Hôi

Bảng 3.17: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Trầu Không với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3 18: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Cỏ Hôi với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.19: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Sâm Đại Hành với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3 20: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Diếp Cá với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.21: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Khổ Qua với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.22: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Vối với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.23: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.24: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Diệp Hạ Châu Đắng với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.25: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Cỏ Mực với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.26: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Đinh Lăng với vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.27: Kết quả thử nghiệm đối kháng của chủng vi khuẩn nội sinh cây Neem với

vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.28: Kết quả thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn nội sinh cây dƣợc liệu

Bảng 3.29:Kết quả thử nghiệm đối kháng của một số chủng vi khuẩn nội sinh từ cây

Vối với Staphyloccocus aureus kháng methicillin

Bảng 3.30: Kết quả thử nghiệm đối kháng của một số chủng vi khuẩn nội sinh từ cây

Dừa Cạn với Staphyloccocus aureus kháng methicillin

Bảng 3.31: Kết quả thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn khuẩn từ vi

khuẩn nội sinh cây Vối với Staphyloccocus aureus kháng methicillin (mm)

Bảng 3.32: Kết quả thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn nội

sinh cây Dừa Cạn với Staphyloccocus aureus kháng methicillin (mm)

Bảng 3.33 Kết quả thử nghiệm đối kháng của các chủng vi nấm nội sinh cây Cỏ Hôi với các chủng vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.34 : Kết quả thử nghiệm đối kháng của các chủng vi nấm nội sinh cây Dừa Cạn với các chủng vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3.35: Kết quả thử nghiệm đối kháng của các chủng vi nấm nội sinh cây Vối với các chủng vi khuẩn sinh ESBL

Bảng 3 36: Kết quả thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn nội sinh cây dƣợc liệu với các loại kháng sinh (CLSI, 2013)

DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ

- Sơ đồ 1 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

- Biểu đồ 3.1: So sánh khả năng đối kháng của hợp chất kháng khuẩn cây Diệp

Hạ Châu Đắng với các chủng vi khuẩn sinh ESBL

- Biểu đồ 3.2: So sánh khả năng kháng khuẩn của hợp chất kháng khuẩn từ vi

khuẩn nội sinh cây Vối và cây Dừa Cạn với Staphyloccocus aureus kháng

Methicillin (mm)

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ESBL: Extended Spectrum Beta Lactamase

PBP : Penicillin binding protein

EPEC: Enteropathogenic E coli

ETEC: Enterotoxigenic E Coli

EIEC : Enteroinvasive E Coli

MSSA : Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

WHO: World Health Organization

GC-MS: Gas Chromatography Mass Spectometry

MIC: Minimum inhibitory concentration

MBC: minimum bactericidal concentration

MDR: Multiple drug resistance

ATCC: American Type Culture Collection

NA: Nutrient agar

NB: Nutrient broth

MHA : Mueller Hinton Agar

BHI : Brain heart infusion

PDA : Potato Dextrose Agar

TSA: Tryptone casein soy agar

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN

SINH ESBL VÀ STAPHYLOCCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA)

CỦA BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT NỘI SINH CÂY DƯỢC LIỆU

- Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Thu An

- Lớp: DH12VS01 Khoa: Công nghệ Sinh học Năm thứ: 4 Số năm đào tạo:

4 năm

- Người hướng dẫn: Dương Nhật Linh Học hàm – Học vị: Thạc Sỹ

2 Mục tiêu đề tài: Xác định được khả năng đối kháng của các vi sinh vật nội sinh

trong cây dược liệu với một số vi khuẩn sinh ESBL và Staphylococcus aureus kháng

methicillin

3 Tính mới và sáng tạo:

Hiện nay, trên thế giới việc sử dụng kháng sinh trong phòng và điều trị bệnh đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh cũng tạo nên một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn Thêm vào đó việc sử dụng kháng sinh không đúng cách, không đúng liều lượng dẫn đến hiện tượng vi khuẩn đề kháng kháng sinh Hiện tượng đề kháng kháng sinh đang là mối lo ngại toàn cầu khi việc điều trị các chủng vi sinh vật này trở nên phức tạp hơn, gây nhiều nguy hiểm hơn tới người bệnh và cộng đồng khi các người bệnh không đáp ứng trước các phương pháp chữa trị thông thường và có khả năng lây truyền các chủng vi khuẩn kháng thuốc trên cho cộng đồng (WHO, 2014) Đặc biệt, đối với các vi khuẩn tiết ESBL thì các kháng sinh β-lactam phổ rộng thường dùng như amoxicillin/clavulanat, cefotaxim, ceftazidim,

ceftriaxon, cefepim đều đã bị kháng 100% Đối với Staphylococcus aureus thì các

kháng sinh trong nhóm carbapenem đều bị mất tác dụng kể cả meropenem cũng bị kháng 75% (Nguyễn Thị Thu Ba và cs, 2014) Các nhà y học trên thế giới phải đối mặt

với các vi khuẩn Klebsiella pneumoniae, Escherechiria coli, Enterobacter có khả năng tiết enzyme β - lactamase phổ rộng là một thế hệ enzyme β - lactamase mạnh nhất đề

kháng được tất cả các thế hệ cephalosporin kể cả thế hệ 3 và 4 (Fang, 1990; Pfaller, 1997) Tại Việt Nam nói chung cũng như Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng,)có trên

50% E coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp tiết ESBL (Nguyễn Thanh Bảo và cs,

2011) Có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam công bố về vi khuẩn sinh enzym ESBL Và MRSA Điều này chứng tỏ vi khuẩn sinh ESBL và MRSA đang lan rộng trong cộng đồng và đề kháng với kháng sinh nghiêm trọng Nghiên cứu về kháng sinh và các sản phẩm tự nhiên của vi sinh vật là chiến lược khả thi trong cuộc chiến toàn cầu chống lại các vấn đề phát triển đề kháng kháng sinh Điều này là cần thiết trong việc tìm kiếm kháng sinh mới để giải quyết các tác nhân nhiễm trùng đa kháng thuốc nêu trên (Christina và cs, 2013)

- Vi sinh vật nội sinh là các sinh vật trong toàn bộ hoặc một phần chu kỳ sống của nó có giai đoạn xâm nhập vào các mô của thực vật gây nhiễm trùng không có biểu hiện thành triệu chứng Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy vi khuẩn nội sinh cây dược liệu có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh,

đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Strobel và cs, 2003; Ryan, 2008) Nghiên cứu về ứng dụng của vi khuẩn nội sinh như nghiên cứu của Arunachalam và cộng sự đã chứng minh rằng dịch nuôi cấy vi khuẩn nội sinh phân lập từ lá cây thuốc

Andrographis paniculata cho thấy khả năng kháng cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

(6 vi khuẩn gây bệnh cho người và 2 vi khuẩn gây bệnh cho cá) (Arunachalam và cs, 2010) Các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ vi khuẩn nội sinh như ecomycins, pseudomycins, munumbicins và xiamycins là kháng khuẩn, chống nấm Một số các sản phẩm tự nhiên đã được báo cáo là có khả năng kháng virus Vì vậy, để đối phó với

sự gia tăng số lượng các mầm bệnh kháng thuốc, vi khuẩn nội sinh có thể xem là một nguồn nguyên liệu tiềm năng của thuốc kháng sinh mới (Christina và cs, 2013) Nước

ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, có nhiều cây thuốc, dược liệu quý mà từ xưa con người đã biết sử dụng trong điều trị và chữa lành vết thương Việc sử dụng vi sinh vật nội sinh

từ các cây dược liệu là một cách mới để có được các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm mang hiệu quả về kinh tế và mở ra một hướng mới cho các ngành y tế, nông nghiệp Hiện nay, trên thế giới cũng như trong nước chỉ mới công bố các công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng của vi khuẩn nội sinh cây dược liệu với vi khuẩn

gây bệnh thông thường như trong nghiên cứu của Maria Bintang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn nội sinh BS1 từ lá Trầu Không có khả năng kháng lại một số

vi khuẩn gây bệnh như: E coli, B cereus và S aureus, kết quả sự ức chế lớn nhất đối với S aureus (Bintang và cs, 2014) hay trong nghiên cứu của Jalgaonwala và cộng sự

năm 2010 đã đánh giá của một số vi sinh vật nôi sinh từ các bộ phận khác nhau của cây thuốc thuộc Jalgaon Maharashtra có hoạt tính kháng cả vi khuẩn và vi nấm gây bệnh (Jalgaonwala và cs, 2010), theo nhóm chúng tôi tìm hiểu thì vẫn chưa có công trình nghiên cứu cũng như bài báo khoa học nói về khả năng đối kháng với vi khuẩn tiết ESBL của các chủng vi khuẩn nội sinh từ các cây dược liệu Enzym ESBL là một

loại enzym β – lactamase do trực khuẩn Gram (-) sinh ra ESBL có hoạt tính phá hủy

tất cả các penicillin G, ampicillin, amoxicillin, aztreonam và các thế hệ cephalosporin ngoại trừ cephamycin Ngoài hoạt tính phá hủy kháng sinh mạnh như vậy, ESBL còn

có khả năng lây lan cao giữa các vi khuẩn cùng loài hay khác loài, nó gây ra những hậu quả vô cùng nghiêm trọng, có thể không có tác dụng trong việc điều trị nhiễm trùng, mà còn lây sang cho người khác.Vì vậy nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn nội sinh từ bộ sưu tập các cây dược liệu với vi khuẩn tiết ESBL và MRSA cho thấy hướng mới trong việc ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất kháng sinh, nguồn nguyên liệu tiềm năng trong sản xuất kháng sinh mới

4 Kết quả nghiên cứu:

Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi đã thực hiện các mục tiêu đã hoàn thành mục tiêu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật nội sinh từ bộ sưu

tập cây dược liệu với vi khuẩn tiết ESBL và Staphylococcus aureus kháng methicillin

Từ 164 chủng vi khuẩn nội sinh từ bộ sưu tập cây dược liêu, thu được 45 chủng

vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng vi khuẩn tiết ESBL

Tiến hành thử nghiệm đối kháng hợp chất kháng khuẩn của 9 chủng vi khuẩn nội sinh các cây dược liệu với 8 chủng vi khuẩn sinh enzyme ESBL, kết quả thu được 3 chủng vi khuẩn (RD2, RD18, LD2) nội sinh từ cây Diệp Hạ Châu Đắng có khả năng kháng khuẩn

Tiến hành thử nghiệm đối kháng của 35 chủng vi khuẩn nội sinh cây dược liệu

với Staphylococcus aureus kháng methicillin, kết quả thu được 20 chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin

Tiến hành thử nghiệm đối kháng hợp chất kháng khuẩn 20 của vi khuẩn nội sinh

từ các cây dược liệu với Staphylococcus aureus kháng methicillin kết quả thu được 5

chủng vi khuẩn có khả năng kháng MRSA

Tiến hành thử nghiệm đối kháng của 20 chủng vi nấm nội sinh từ các cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzyme ESBL, kết quả thu được 10 chủng vi nấm nội sinh từ cây Cỏ Hôi, 3 chủng vi nấm nội sinh từ cây Dừa Cạn, 7 chủng vi nấm nội sinh từ cây Vối Trong đó, có 4 chủng vi nấm nội sinh từ cây Cỏ Hôi (B1, B2, H1, H4, H6, H7) có

khả năng kháng được 1 chủng vi khuẩn sinh ESBL (Acinetobacter spp 58a)

Trong 7 chủng vi khuẩn nội sinh thử nghiệm có 7 chủng nhạy với ampicillin, gentamicin, ofloxacin, cloramphenicol, erythromycin, azithromycin , 3 chủng trung gian với tetracycline và 1 chủng trung gian với streptomycin

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

Thành công của đề tài là tiền đề cho các công trình nghiên cứu mới về các hợp

chất kháng khuẩn, kháng nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu Qua

đó, đã cho thấy một thấy hướng mới trong việc ứng dụng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu trong sản xuất kháng sinh, nguồn nguyên liệu tiềm năng trong sản xuất

kháng sinh mới

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài hoặc nhận xét,

đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

Sinh ngày: 17 tháng 10 năm 1994

Nơi sinh: Quảng Ngãi

Lớp: DH12VS01 Khóa: 2012-2016

Khoa: Công nghệ sinh học

Địa chỉ liên hệ: 23/15/4 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, Tp Thủ Dầu Một, Bình Dương

Điện thoại: 01647077024 Email: anpham1710@gmail.com

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

* Năm thứ 1:

Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình- Khá

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trên thế giới việc sử dụng kháng sinh trong phòng và điều trị bệnh đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh cũng tạo nên một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn Thêm vào đó việc sử dụng kháng sinh không đúng cách, không đúng liều lượng dẫn đến hiện tượng vi khuẩn đề kháng kháng sinh Sự kháng kháng sinh là sức đề kháng của vi sinh vật qua một loại thuốc kháng sinh mà ban đầu có hiệu quả để điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi nó (WHO, 2015) Hiện tượng đề kháng kháng sinh đang là mối lo ngại toàn cầu khi việc điều trị các chủng vi sinh vật này trở nên phức tạp hơn, gây nhiều nguy hiểm hơn tới người bệnh và cộng đồng khi các người bệnh không đáp ứng trước các phương pháp chữa trị thông thường và có khả năng lây truyền các chủng vi khuẩn kháng thuốc trên cho cộng đồng (WHO, 2014) Đặc biệt, đối với các vi khuẩn tiết ESBL thì các kháng sinh β-lactam phổ rộng thường dùng như amoxicillin/clavulanat, cefotaxim,

ceftazidim, ceftriaxon, cefepim đều đã bị kháng 100% Đối với Staphylococcus aureus

thì các kháng sinh trong nhóm carbapenem đều bị mất tác dụng kể cả meropenem cũng

bị kháng 75% (Nguyễn Thị Thu Ba và cs, 2014) Các nhà y học trên thế giới phải đối

mặt với các vi khuẩn Klebsiella pneumoniae, Escherechiria coli, Enterobacter có khả năng tiết enzyme β - lactamase phổ rộng là một thế hệ enzyme β - lactamase mạnh

nhất đề kháng được tất cả các thế hệ cephalosporin kể cả thế hệ 3 và 4 (Fang, 1990; Pfaller, 1997) Tại Việt Nam nói chung cũng như Thành phố Hồ Chí Minh nói

riêng,)có trên 50% E coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp tiết ESBL (Nguyễn Thanh Bảo và cs, 2011) Có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam công bố về vi khuẩn sinh enzym ESBL Năm 2010, Võ Thị Chi Mai và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu ở bệnh nhân không mắc hội chứng nhiễm khuẩn tiêu hóa đến khám vì lý do khác cho thấy tình trạng chiếm cư đường ruột của vi khuẩn tiết

ESBL là 76,4%, chủ yếu là E coli chiếm tới 65,8% (Võ Thị Chi Mai và cs, 2010) Lê

Kim Ngọc Giao và cộng sự đã xác định được tỷ lệ người khỏe mạnh mang vi khuẩn sinh enzym ESBL chiếm cư đường tiêu hóa là 53,7% (Lê Kim Ngọc Giao và cs,

2010) Điều này chứng tỏ vi khuẩn sinh ESBL đang lan rộng trong cộng đồng và đề kháng với kháng sinh nghiêm trọng Nghiên cứu về kháng sinh và các sản phẩm tự nhiên của vi sinh vật là chiến lược khả thi trong cuộc chiến toàn cầu chống lại các vấn

đề phát triển đề kháng kháng sinh Điều này là cần thiết trong việc tìm kiếm kháng

sinh mới để giải quyết các tác nhân nhiễm trùng đa kháng thuốc nêu trên (Christina và

cs, 2013)

Vi sinh vật nội sinh (Endophyte) là thuật ngữ chỉ các sinh vật trong toàn bộ hoặc một phần chu kỳ sống của nó có giai đoạn xâm nhập vào các mô của thực vật gây nhiễm trùng không có biểu hiện thành triệu chứng Chúng sinh sống ở phần lớn các cây khỏe mạnh, trong các mô khác nhau, hạt, rễ, thân, cành và lá Vùng rễ là nơi xuất phát nhiều vi khuẩn nội sinh chui vào rễ, thân, lá để sống nội sinh; sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel và cs, 2002) Thực vật ký chủ đem lại lợi ích rộng rãi bằng cách nuôi dưỡng những vi sinh vật nội sinh này và các vi sinh vật nội sinh này giúp thúc đẩy tăng trưởng, nâng cao đề kháng các tác nhân gây bệnh khác nhau bằng cách sản xuất kháng sinh cho thực vật ký chủ Vi sinh vật nội sinh cũng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có tầm quan trọng trong y học hiện đại, nông nghiệp

và công nghiệp Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy vi khuẩn nội sinh cây dược liệu có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Strobel và cs, 2003; Ryan, 2008) Nghiên cứu của Phongpaichit năm 2006 đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch lên men vi

nấm nội sinh từ Garcinia species, kết quả cho thấy từ 377 trong số 1979 vi nấm phân lập được có khả năng kháng lại S aureus, S aureus kháng Methicillin, Candida

albicans, Cryptococcus neoformans, trong đó 2 chủng D15 và M76 có khả năng kháng

lại tất cả các chủng S aureus Năm 2013, Sunkar và cộng sự đã phân lập và xác định được vi khuẩn nội sinh Brassica oleracea có khả năng sinh các enzym amylase,

protease, cellulase có tiềm năng trong sản xuất enzym với quy mô lớn, đồng thời cho

thấy hoạt động kháng khuẩn đối với Klebsiella pneumoniae (20 mm), Staphylococcus

như nghiên cứu của Arunachalam và cộng sự đã chứng minh rằng dịch nuôi cấy vi

khuẩn nội sinh phân lập từ lá cây thuốc Andrographis paniculata cho thấy khả năng

kháng cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) (6 vi khuẩn gây bệnh cho người và 2 vi

khuẩn gây bệnh cho cá) (Arunachalam và cs, 2010) Các hợp chất điều trị tự nhiên được sản xuất bởi vi sinh vật nội sinh có nhiều ứng dụng khả quan trong ngành công nghiệp dược phẩm Các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ vi khuẩn nội sinh như

ecomycins, pseudomycins, munumbicins và xiamycins là kháng khuẩn, chống nấm Một số các sản phẩm tự nhiên đã được báo cáo là có khả năng kháng virus Vì vậy, để đối phó với sự gia tăng số lượng các mầm bệnh kháng thuốc, vi khuẩn nội sinh có thể xem là một nguồn nguyên liệu tiềm năng của thuốc kháng sinh mới (Christina và cs, 2013) Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, có nhiều cây thuốc, dược liệu quý mà từ xưa con người đã biết sử dụng trong điều trị và chữa lành vết thương Việc sử dụng vi sinh vật nội sinh từ các cây dược liệu là một cách mới để có được các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm mang hiệu quả về kinh tế và mở ra một hướng mới cho các ngành y

tế, nông nghiệp, Đồng thời, việc nghiên cứu các nhóm vi khuẩn nội sinh trong cây dược liệu có khả năng kháng lại với một số vi khuẩn sinh enzyme ESBL và MRSA là rất cần thiết nhằm tìm ra loại kháng sinh mới trong tương lai, hỗ trợ thiết thực cho việc điều trị nhiễm trùng

Xuất phát từ những lý do trên mà chúng tôi quyết định thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu khả năng đối kháng với một số vi khuẩn sinh ESBL và Staphylocccus aureus kháng methicillin (MRSA) của bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu”

Mục tiêu:

Xác định được khả năng đối kháng của các vi sinh vật nội sinh trong cây dược

liệu với một số vi khuẩn sinh ESBL và Staphylococcus aureus kháng methicillin

Nội dung thực hiện:

- Tái kiểm tra, khẳng định các chủng vi khuẩn sinh enzyme ESBL (CLSI, 2013)

- Tái phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ các cây dược liệu

- Phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ các cây dược liệu

- Thử nghiệm đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh từ các cây dược liệu với

vi khuẩn sinh enzyme ESBL và Staphylococcus aureus kháng methicillin

- Thử nghiệm đối kháng của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn nội sinh các cây

dược liệu với vi khuẩn sinh enzyme ESBL và Staphylococcus aureus kháng

methicillin

- Thử nghiệm đối kháng của các chủng vi nấm nội sinh từ các cây dƣợc liệu với

vi khuẩn sinh enzyme ESBL và Staphylococcus aureus kháng methicillin

- Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh của vi sinh vật nội sinh từ cây dƣợc liệu với một số loại kháng sinh

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN

1.GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH:

Đề kháng kháng sinh là do tác nhân gây bệnh thay đổi và đề kháng với thuốc kháng sinh làm cho thuốc không có hiệu quả chống lại các bệnh nhiễm trùng trước đó

đã bị sử dụng để điều trị, và được coi là một mối đe dọa sức khỏe cộng đồng toàn cầu (Quet và cs, 2015) Thời gian gian thế hệ ngắn là một ưu điểm của vi khuẩn mà nhờ đó chúng có thể phát triển các gen kháng kháng sinh mới nhanh hơn việc chúng ta tìm ra các loại kháng sinh mới (Angela Huttner và cs, 2013)

1.1.Phân loại đề kháng kháng sinh:

Đề kháng được chia làm hai loại đề kháng: đề kháng giả và đề kháng thật

1.1.2.Đề kháng thật:

+ Đề kháng tự nhiên: là do cấu trúc di truyền của một số loài vi khuẩn, ví dụ một

số loài vi khuẩn không có hệ thống vận chuyển kháng sinh hoặc không có đích tác

động của kháng sinh như P aeruginosa không chịu tác dụng của penicilin G,

Staphylococcus aureus không chịu tác dụng của colistin, hay Mycoplasma thuộc loại

vi khuẩn không có vách sẽ không chịu tác động của kháng sinh tác dụng lên vách như

β – lactam (Bộ Y tế, 2015) Ở một số các vi khuẩn Gram (-), tế bào vi khuẩn được bao

bọc bởi một lớp vỏ truyền bên ngoài sẽ ngăn không cho kháng sinh xâm nhập vào bên

trong tế bào (Nguyễn Hữu Hồng, 2007)

+ Đề kháng thu được: do một số biến cố di truyền như đột biến hoặc nhận được gen đề kháng để một vi khuẩn đang từ không có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng, nghĩa là đang nhạy cảm trở thành có khả năng đề kháng kháng sinh Có rất nhiều cơ chế đã được vi khuẩn phát triển để kháng lại kháng sinh (Bộ Y tế, 2015) Các

đề kháng thu được này liên quan đến sự thay đổi nhiễm sắc thể của vi khuẩn đó hoặc

do được truyền các gen kháng kháng sinh nằm trên các plasmid và class I intergron cho vi khuẩn cùng và khác loài thông qua hình thức biến nạp và tiếp hợp (Nguyễn Hữu Hồng, 2007)

1.2.Cơ chế đề kháng kháng sinh:

Kháng sinh có bốn cơ chế tác động lên cấu trúc sống còn của vi khuẩn Để đối kháng lại, vi khuẩn cũng có bốn cơ chế đề kháng lại tác động của kháng sinh (Phạm

Hùng Vân, 2013)

2.2.1.Tiết enzyme phá hủy kháng sinh:

Enzym được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh bằng cách thủy phân kháng sinh Có ba loại enzyme chính làm bất hoạt kháng sinh: β-lactamases, aminoglycoside-modifying enzymes, và chloramphenicol acetyltransferases (Giedraitiene và cs, 2011) Trong các loại enzym do vi khuẩn tiết ra

để phá hủy kháng sinh, đáng quan tâm nhất là β – lactamase phá hủy các kháng sinh β

– lactam vì tầm quan trọng của cơ chế đề kháng này trên thực trạng đề kháng các kháng sinh của vi khuẩn hiện nay không chỉ trong bệnh viện mà cả trong cộng đồng (Phạm Hùng Vân, 2013)

Enzym β– lactamase được biết đến với 300 loại β– lactamase khác nhau (Giedraitiene và cs, 2011), có thể kháng với các kháng sinh β -lactam mới nhất (

Jacoby và cs, 2005) ESBL là enzym có khả năng thủy phân penicillin, cephalosporin phổ rộng và monobactams, có nguồn gốc từ TEM và SHV- type ( Rupp và cs, 2003),

là enzym có nguồn gốc gen là trên plasmid nên sự đề kháng này có khả năng lan truyền trong cùng một loài hay thậm chí khác loài do vi khuẩn sinh ra và lây truyền theo đường plasmid

- Enzyme carbapenemase:

Là enzyme thuộc họ β-lactamase có khả năng thủy phân linh hoạt các loại β– lactam như pencillin, cephalosporin phổ rộng và kể cả kháng sinh mạnh nhất hiện nay

là carbapenem, kháng sinh được khuyến cáo là hiệu quả dành cho điều trị nhiễm trùng

do trực khuẩn gram (-) tiết ESBL gây ra (Sahuquillo-Arce và cs, 2015; Phạm Hùng Vân, 2013; Queenan và cs, 2007) Tuy nhiên các trực khuẩn gram (-) vẫn không ngừng

phát triển và hiện nay chúng ta phải đối phó với các carbapenemase phá hủy được carbapenem có nguồn gốc gen nằm trên plasmid hay integron của nhiễm sắc thể do vậy mà có khả năng lây lan cao Các carbapenemase hiện nay đã xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới và đang được xem là “ác mộng” đề kháng kháng sinh đối với con người (Phạm Hùng Vân, 2013)

- Enzyme AmpC - β – lactamase (AmpC) cảm ứng:

Đây là loại enzyme phổ rộng, thường được mã hóa trên các nhiễm sắc thể của vi

khuẩn (Jacoby và cs, 2005) Enzyme AmpC có thể được phân biệt với các enzyme β-

lactamase phổ rộng khác bởi khả năng thủy phân cephamycins cũng như các

cephalosporin thế hệ 4 và không bị ức chế bởi các chất ức chế β – lactamase như acid

clavulanic, sulbactam, tazobactam (Manchanda và cs, 2003; Jacoby và cs, 2005;

Thomson, 2010 ), AmpC β - lactamase, thường gây cảm ứng bởi β - lactam, được mã

hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể trong nhiều trực khuẩn gram âm (Jacoby và cs,

2005) và cũng có một số vi khuẩn mang gen AmpC cảm ứng nằm trên plasmid (Manchanda và cs, 2003) Việc đề kháng do enzyme AmpC β – lactamase là ít phổ biến hơn so với đề kháng do sản xuất β - lactamase phổ rộng ở hầu hết các nơi trên thế

giới (Jacoby và cs, 2009)

- Enzym β – lactamase phổ rộng (ESBL):

Là một loại enzym β – lactamase do trực khuẩn Gram (-) sinh ra ESBL đề kháng

với penicillin (trừ temocillin), cephalosporin thế hệ thứ ba (ví dụ ceftazidime, cefotoxime, ceftriaxone), aztreonam, cefamandole, cefoperazone, tuy nhiên nó rất nhạy cảm với methoxy-cephalosporin (cephamycins và carbapenems), và có thể bị ức

chế bởi các thuốc ức chế β - lactamase như acid clavulanic, sulbactam, hoặc

tazobactam (Giedraitiene và cs, 2011) ESBL chủ yếu có nguồn gốc từ các thành viên

của TEM-, SHV-, và OXA- β -lactamase có một hoặc nhiều amino axit thay thế Điều này mở rộng phổ kháng sinh β - lactam dễ bị thủy phân bởi các enzym này (Alvarez và

cs, 2004; Paterson và cs, 2005 ) Các ESBL được mã hóa bởi các plasmid, ngoài hoạt tính phá hủy kháng sinh mạnh như vậy, ESBL còn có khả năng lây lan cao giữa các vi khuẩn cùng loài hay khác loài vì nguồn gốc gen là đột biến trên TEM– 1 và SHV– 1,

các gen này chịu trách nhiệm giúp vi khuẩn sinh ra enzym β – lactamase cổ điển nằm

trên trên gần vị trí tâm hoạt động của enzym plasmid, mà những đột biến này làm thay

đổi ở một nhóm khoảng từ 1– 7 amino acid nằm trên gần vị trí tâm hoạt động của enzym (Bradford, 2001), hay là gen mới xuất hiện cũng trên plasmid, hoặc là trên gen nhảy ở nhiễm sắc thể của vi khuẩn (Phạm Hùng Vân, 2013) Điều này cảnh báo một nguy cơ gia tăng vi khuẩn đề kháng kháng sinh và hết kháng sinh điều trị trong một tương lai rất gần, vì vậy lựa chọn kháng sinh trong điều trị sinh vật tạo ESBL là rất hạn chế (Paterson và cs, 2005)

2.2.2.Thay đổi cấu trúc đích mà kháng sinh tác động vào:

- Biến đổi các protein liên kết với penicillin (PBP) để đề kháng β – lactam

- Biến đổi vị trí gắn kết ở cấu trúc ribosome

- Vi khuẩn biến đổi cấu trúc của enzyme để tránh sự bất hoạt của kháng sinh

2.2.3.Thay đổi con đường biến dưỡng:

Vi khuẩn có thể thay đổi con đường biến dưỡng để vượt qua sự đề kháng, đây là

điển hình đề kháng sulfonamide và trimethoprim của Enterococci (Streptococcus

faecalis group D), (Phạm Hùng Vân, 2013)

2.2.4.Ngăn cản kháng sinh vào tế bào hay tăng bơm thải kháng sinh:

Các kháng sinh nhóm carbapenem có cấu trúc switterion (cân bằng ion) nên dễ dàng đi qua được kênh porin, nhờ vậy mà imipenem hay meropenem có tác dụng vượt

trội hơn các kháng sinh nhóm β– lactam khác trên các vi khuẩn này và các trực khuẩn Gram (-) khác Tuy nhiên, P aeruginosa và A baumannii cũng đã sớm phát triển cơ

chế mất kênh porin trên màng ngoài để kháng được imipenem và meropenem cũng như hình thành các bơm thải để bơm kháng sinh ra ngoài (Papp-Wallace và cs, 2011)

2.GIỚI THIỆU VỀ ENZYME β- LACTAMASE PHỔ RỘNG (ESBL)

VÀ STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN:

2.1.Giới thiệu về enzyme β – lactamase phổ rộng:

Đầu những năm 1980, các cephalosporins thế hệ 3 được đưa vào để điều trị các

vi khuẩn kháng thuốc Sự ra đời các kháng sinh β – lactams mới này đặc biệt là

cephalosporin thế hệ 3, đã là thành công lớn của khoa học trong cuộc chiến đấu lâu dài

với vi khuẩn sinh enzym β – lactamase (ví dụ chủng E coli tiết ra enzym TEM – 1 kháng ampicillin, chủng K pneumoniae sinh enzym SHV – 1 β – lactamase) Nhưng một loại enzym β – lactamase có khả năng phân hủy các cephalosporins thế hệ 2, 3 và

monobactams, có nguồn gốc do TEM – 1, TEM – 2, SHV – 1 đột biến thay đổi một số amino acid gọi là ESBL phổ rộng đã xuất hiện (Paterson và cs, 2005)

Là một loại enzym β – lactamase do trực khuẩn Gram (-) sinh ra ESBL đề kháng

với penicillin (trừ temocillin), cephalosporin thế hệ thứ ba (ví dụ ceftazidime, cefotoxime, ceftriaxone), aztreonam, cefamandole, cefoperazone, tuy nhiên nó rất nhạy cảm với methoxy-cephalosporin (cephamycins và carbapenems), và có thể bị ức

chế bởi các thuốc ức chế β - lactamase như acid clavulanic, sulbactam, hoặc

tazobactam (Giedraitiene và cs, 2011) ESBL chủ yếu có nguồn gốc từ các thành viên

của TEM-, SHV-, và OXA- β -lactamase có một hoặc nhiều amino axit thay thế

ESBL có nguồn gốc từ đột biến của β – lactamase do cephalosporin thế hệ 3 cảm

ứng tạo thành Những đột biến này do sự thay đổi ở một nhóm khoảng từ 1 đến 7 amino acid nằm gần vị trí tâm hoạt động của enzym Những thay đổi trên đã tạo ra vị trí tâm hoạt động của enzym linh hoạt hơn, tiến hóa hơn vì thế gia tăng ái lực và tăng hoạt động thủy phân đối với cephalosporins thế hệ 3 (như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone,…) và monobactam (aztreonam) (Brafold, 2001)

2.2.Tình hình dịch tễ học của vi khuẩn sinh ESBL:

Từ năm 1983, khi trường hợp ESBL đầu tiên phát hiện tại Đức, sau đó bùng phát

ở Pháp, và cuối cùng xuất hiện ở Mỹ vào những năm 1990 ESBL đã được tìm thấy trong một loạt các vi khuẩn Gram âm, tuy nhiên, phần lớn các chủng tiết ESBL thuộc

họ Enterobacteriaceae (Gniadkowski và cs, 2001) Các nghiên cứu về lĩnh vực này vẫn không ngừng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học bởi tầm quan trọng của nó Gần đây, một sự gia tăng đáng kể về tình trạng lây nhiễm ESBL đã được quan sát trên toàn cầu (Rupinder và cs, 2013) Trong những năm gần đây, đã có đợt bùng phát lớn

của các chủng vi khuẩn tiết ESBL: một ổ dịch lớn ở Uppsala liên quan đến K

pneumoniae với CTX-M-15, và ở Kristiansand gây ra bởi một đa kháng E coli tiết

ESBL (Alsterlund và cs, 2009) Ngày nay các K pneumoniae đề kháng kháng sinh đã

đạt đến một cấp độ cao hơn với sự xuất hiện của carbapenemase như OXA-48, lần đầu tiên được tìm thấy ở Thổ Nhĩ Kỳ (Aktas và cs, 2008) Một nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm y tế công cộng quốc gia, Kathmandu, Nepal báo cáo rằng 31,57%

của E coli được xác nhận tiết enzyme ESBL (Thakur và cs, 2013) Trong một báo cáo

tiến hành tại một bệnh viện đại học ở Mwanza, Tanzania, tỷ lệ vi khuẩn tiết ESBL

trong tất cả các vi khuẩn Gram âm chiếm tới 29%, trong đó, tỉ lệ K pneumoniae tiết ESBL chiếm tới 64%, và E.coli tiết ESBL chiếm 24% (Mshana và cs, 2009) Tỷ lệ mắc các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi kháng sinh β - lactam do việc sản xuất các

enzym khác nhau có tăng trong những năm gần đây Phát hiện vi khuẩn tiết ESBL là hết sức cần thiết cả trong bệnh viện và cộng đồng Các học viên kiểm soát lây nhiễm

và bác sĩ lâm sàng cần nhanh chóng xác định và mô tả các loại khác nhau của vi khuẩn

đề kháng kháng sinh Điều này là cấp thiết để giảm thiểu sự lây lan của các vi khuẩn

và giúp chọn kháng sinh thích hợp (Shaikh và cs, 2015; Phumart và cs, 2012)

Tại Việt Nam, từ những nghiên cứu đầu tiên năm 1999, Nguyễn Việt Lan và cộng sự nghiên cứu 1228 trực khuẩn đường ruột phân lập tại bệnh viện Chợ Rẫy đã

tìm thấy 4,3% E coli tiết ESBL và 4,7% K pneumoniae tiết ESBL (Nguyễn Việt Lan

và cs, 2000) Theo báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện

Việt Nam năm 2008– 2009, đã cho thấy tỷ lệ sinh ESBL của các chủng E coli và

Klebsiella dao động giữa các bệnh viện, cao nhất ở bệnh viện Nhiệt đới Trung ương

với 54,7% trên E coli và 72,7% Klebsiella, sau đó là bệnh viện Chợ Rẫy với 49 % và

58,2%, bệnh viện Việt Đức với 57,3% và 48,5%, bệnh viện Bình Định và 2 bệnh viện

Nhi với tỷ lệ gần 40% trên E coli và 50% trên Klebsiella Đây cũng là các bệnh viện

có tỷ lệ E coli và Klebsiella kháng cephalosporins thế hệ 3 cao hơn các bệnh viện

khác (GARP – Vietnam, 2010)

2.3.Một số vi khuẩn sinh ESBL:

3.3.1Vi khuẩn Escherechia coli:

3.3.1.1.Phân loại theo khóa phân loại quốc tế:

Loài: Escherichia coli

Hình 3.1:Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Escherichia coli

(http://www.idimages.org)

3.3.1.2.Đặc điểm nuôi cấy:

E coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên các môi

trường nuôi cấy thông thường Nhiệt độ thích hợp là 350C – 370C, tuy nhiên có thể tăng trưởng từ 100C – 460C

Trong môi trường thạch thường, sau 18 – 24 giờ khuẩn lạc có đường kính khoảng 1,5mm, dạng S: tròn, bờ đều lồi bóng, không màu hoặc màu xám nhạt Có thể gặp

khuẩn lạc dạng M hoặc R E.coli mọc dễ dàng trên môi trường Maconkey, EMB,… Một số chất ức chế sự phát triển của E coli như chlorine và dẫn xuất, muối mật,

brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate, selenite

3.3.1.3.Khả năng gây bệnh:

Nhiễm khuẩn đường tiểu: 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu tiên

ở phụ nữ là do E coli với các triệu chứng tiểu lắc nhắc, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra

mủ Có thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn huyết

Nhiễm khuẩn huyết: khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn máu

Viêm màng não: E coli chiếm khoảng 40 % trường hợp gây viêm màng não ở trẻ

sơ sinh, 75 % trong số đó có kháng nguyên K1

Tiêu chảy: những chủng E coli liên quan đến tiêu chảy thuộc các nhóm EPEC,

ETEC, EIEC

3.3.1.4.Tình hình đề kháng kháng sinh:

Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn

E coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển

Các nghiên cứu tại Ấn Độ đã ghi nhận được các chủng E coli sinh ESBL chiếm

24,8%- 63,8% vi khuẩn sinh ESBL (Kumar và cs, 2006; Goyal và cs, 2009) Trong

năm 2013, tại 17 trong số 22 nước Châu Âu phân lập được 85% -100% E Coli sinh

ESBL (EARS-Net, 2014) Tại Việt Nam, theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại

bệnh viện Nhiệt đới Trung ương tỉ lệ kháng ampicillin của E coli lên tới 81,4%; kháng

amoxicillin/clavulanic và ampicillin/ sulbactam khoảng 40% Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 3 cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm fluoro – quinolon cũng bị kháng khoảng 45 % (Trần Thị Thùy Giang và cs, 2014)

3.3.2.Vi khuẩn Acinetobacter spp:

3.3.2.1.Phân loại theo khóa phân loại quốc tế:

Hình 3.2: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Acinetobacter spp

Sau 24 giờ cấy trên thạch máu, khuẩn lạc màu sáng đều đến đục, lồi và nguyên

vẹn, đặc biệt loài Acinetobacter baumannii không bao giờ tạo sắc tố, có phản ứng oxidase âm tính Phần lớn các dòng Acinetobacter spp mọc tốt trên môi trường

MacConkey, cho khuẩn lạc màu hồng nhạt

3.3.2.3.Khả năng gây bệnh:

Acinetobacter spp.được coi là những vi khuẩn cơ hội, vai trò gây bệnh của

chúng mới được chú trọng ở những năm gần đây Vi khuẩn Acinetobacter spp có thể

gây nhiễm khuẩn bệnh viện với những bệnh nặng như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi và nhiễm khuẩn huyết có khuynh hướng ngày càng gia tăng

3.3.2.4.Tình hình đề kháng kháng sinh:

Tỉ lệ Acinetobacter spp gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng lên một cách đều

đặn trong những năm gần đây trên thế giới Cùng với tỉ lệ nhiễm khuẩn tăng, tỉ lệ kháng kháng sinh cũng tăng một cách đáng kể, đặc biệt kháng sinh nhóm carbapenems của vi khuẩn này cũng đang tăng một cách nhanh chóng (Dijkshoorn và cs, 2007) Ở

Anh, sự nhiễm khuẩn bệnh viện do Acinetobacter kháng carbapenems đã xảy ra từ

năm 2000 Giữa năm 2004 và 2008 tỉ lệ kháng meropenem đã tăng từ 13- 29% Trong

năm 2008, tỉ lệ kháng của Acinetobacter với các lớp khác của kháng sinh được báo

cáo: aminoglycosides khoảng 20%; ciprofloxacin 30%; ceftazidime 70%; cefotaxime 89%; piperacillin/ tazobactam 50% Ở châu Âu, tỉ lệ kháng cao nhất được báo cáo ở các vùng Địa Trung Hải bao gồm Hi Lạp, Thổ Nhĩ Kì, Ý và Nhật Ở Mĩ, dữ liệu nhiễm

khuẩn bệnh viện xác định 65-75% bởi Acinetobacter đa kháng thuốc và không nhạy

với carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995 lên 57% trong năm 2008 (WHO, 2011)

Ngoài ra, Acinetobacter còn đề kháng với β –lactam qua các con đường: sản xuất

β-lactamase, thay đổi trong các mối quan hệ để protein gắn penicilin, giảm tính thấm của màng ngoài do sự thay đổi trong cấu trúc hoặc số lượng protein PORIN, và tăng hoạt động bơm ra ngoài (Munoz-Price và cs, 2008; Jain và cs, 2004) Hiện nay,

Acinetobacter được xem là vi khuẩn hàng đầu gây viêm phổi bệnh viện tại những bệnh

viện lớn trong nước và kháng với hầu hết kháng sinh kể cả những kháng sinh phổ rộng mạnh nhất hiện nay

2.4.Giới thiệu về Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA):

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là những chủng tụ cầu vàng

kháng methicillin và các kháng sinh thuộc nhóm β- lactam như penicillin và cephalosporin. Staphylococcus aureus đã được xác định là một tác

nhân gây bệnh lớn gây ra một loạt các bệnh nhiễm trùng từ nhiễm trùng da nhẹ đến nhiễm khuẩn huyết MRSA lần đầu tiên được báo cáo ở Châu Âu vào năm 1960 và số lượng các vi khuẩn kháng thuốc đã và đang gia tăng trong suốt những thập kỷ qua Theo một báo cáo của Song và cộng sự năm 2011 MRSA chiếm đến 74,1% liên quan đến nhiễm trùng bệnh viện và 31,1% trong nhiễm khuẩn cộng đồng tại Việt Nam (Song và cs, 2011) MRSA đề kháng penicillin M chủ yếu qua gen trung gian mecA

mã hóa cho protein 2a gắn penicillin (PBP 2A hoặc 2’) (Jesen và cs, 2009) Khi được tạo ra PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với các kháng sinh β – lactam nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được không chỉ với penicillin M mà còn với tất cả các kháng sinh β – lactam (Phạm Hùng Vân, 2013)

Vi khuẩn Staphylococcus aureus :

3.4.1Phân loại theo khóa phân loại quốc tế:

Hình 3.3: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Staphylococcus aureus

(http://www.idimages.org)

3.4.2.Đặc điểm hình thái

S aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, có thể

đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhầy của người và động vật máu nóng Trên môi trường Baird Parker, khuẩn lạc

có vòng sáng rộng 2 – 5 mm

3.4.3.Tình hình gây bệnh:

Staphylococcus aureus là một trong những tác nhân gây bệnh thường gặp nhất

gây nhiễm trùng sinh mủ ở người: nó có thể gây ra nhiễm trùng tại chỗ có mủ, viêm phổi, viêm đại tràng giả mạc, viêm màng ngoài tim, và nhiễm trùng toàn thân thậm chí nói chung, chẳng hạn như nhiễm trùng huyết và nhiễm khuẩn (Obadia và cs, 2015)

3.4.4.Tình hình đề kháng kháng sinh:

Đề kháng kháng sinh của S.aureus là vấn đề thời sự của nghành y tế và là thách

thức lớn cho điều trị Tổng kết tại Bệnh viện Chợ Rẫy và Bạch Mai cũng cho thấy tỉ lệ MRSA là 57% và 43% (Trần Thị Thanh Nga và cs, 2009) Từ tháng 8/2012 – tháng

8/2013, một nghiên cứu với 143 chủng S.aureus về tỉ lệ đề kháng kháng sinh của

S.aureus trong 4229 bệnh phẩm, được phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa

LAM Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy: S.aureus chiếm 23,6%

(n=143), đa số được phân lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và phân (10,5%) (n=143) Qua kết quả từ kháng sinh đồ, tỉ lệ đề kháng

của S.aureus với các kháng sinh là 93,7% với penicillin G, 65,0% với erythromycin,

60,8% với kanamycine, 58% với clindamycin Tỉ lệ MRSA là 39,2% và MSSA là 60,8% Ngày càng xuất hiện nhiều chủng đa kháng kháng sinh hơn Điều này cho thấy

tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp và một hệ

thống giám sát quốc gia về kháng sinh của vi khuẩn nói chung, của S.aureus nói riêng

là cần thiết, đặc biệt là đối với các chủng MRSA hay MSSA tại Việt Nam (Nguyễn

Hữu An và cs, 2013) Ngày nay, Staphylococcus aureus kháng Methicillin đã hiện diện từ 3-5% trên tất cả các chủng S aureus (Hemamalini và cs, 2015) Trong những

năm gần đây, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện toàn cầu đã chứng kiến một sự gia tăng đáng kể Tại Ấn Độ, tình trạng MRSA gia tăng đáng kể từ 29 % - 47% trong năm 2014 (CDDEP, 2015) Tại các bệnh viện lớn, toàn diện của Trung Quốc, gần 80% các trường hợp nhiễm trùng Staphylococcus aureus dương tính với MRSA (Chang và cs, 2015)

3.CÂY DƯỢC LIỆU VÀ VI SINH VẬT NỘI SINH CÂY DƯỢC LIỆU:

3.1 Giới thiệu về cây dược liệu:

Cây dược liệu là một phần của nền y học cổ truyền, đóng vai trò quan trọng trong nền y học truyền thống của nhiều nước WHO ước tính có khoảng 80% dân số thế giới chủ yếu dựa vào các loại thuốc từ cây dược liệu cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu của họ (Ahvazi và cs, 2012) Cây dược liệu có những đóng góp quan trọng trong việc chăm sóc sức khoẻ con người, được đánh giá là nguồn hoạt chất tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong điều trị bệnh ở người nên chúng ngày càng được phổ biến rộng rãi và được quan tâm nhiều hơn Nhiều cây dược liệu được sử dụng trong đối kháng nấm, kháng khuẩn và điều trị một loạt các bệnh nhiễm trùng (Mongalo và

Trầu Không có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm, vào các kinh: phế tỳ, vị, có tác dụng trừ phong thấp, chứng lạnh, hạ khí, tiêu đờm, tiêu viêm, sát trùng

Ở Việt Nam Trầu Không được

dùng chữa đau bụng đầy hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay đổi, bỏng, mụn nhọt, hắc lào, mề đay, ghẻ ngứa, sâu kiến đốt, viêm quanh răng, viêm tai, viêm họng (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trầu Không có các tác động dược lý khác nhau như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm, sử dụng như một tác nhân kháng nấm đặc biệt để điều trị nhiễm trùng tại chỗ, cũng như dùng trong nước súc

miệng chống lại nhiễm trùng

Candida miệng (Intzar Ali và

cs, 2010)

2 Cây Vối Cleistocalyx

operculatus

Roxb

Cây Vối Lá và nụ vối từ lâu đã

được nhân dân ta nấu với nước

để uống vừa thơm vừa tiêu cơm Lá Vối tươi hay khô sắc đặc được xem có tính chất sát trùng để rửa những mụn nhọt,

lở loét, ghẻ Trên cơ sở nghiên cứu mới đây, Viện đông y đang thử áp dụng vối chữa một số bệnh đường ruột, viêm họng, bệnh ngoài da (Đỗ Tất Lợi,

2004)

3 Cây Cỏ Hôi Ageratum

conyzoides L

Cây Cỏ Hôi còn gọi cây

Sử dụng làm thuốc tẩy, thuốc giảm sốt, chữa trị lở loét, băng

Bù Xích, Cỏ Hôi, cây Ngũ Sắc

bó vết thương Ở Việt Nam cây được sử dụng để chữa bệnh viêm xoang mũi, chữa bệnh rong huyết ở phụ nữ mới sinh, chữa bệnh thấp khớp, thuốc đau răng, thuốc ho, thuốc giun Ngoài ra một số người còn dùng nó để nấu nước gội đầu (Adewole-Okunade, 2000)

4 Cây Diếp

Cá

Houttuynia cordata

Cây Diếp Cá còn có tên là cây Giấp Cá,

Lá Giấp, Ngư Tinh Thảo

Cây có rất nhiều công dụng như: nước ép lá diếp cá được lấy để điều trị dịch tả, kiết lỵ, chữa thiếu máu và lọc máu Các rễ, chồi non, lá điều trị các bệnh sởi, kiết lỵ, lậu, bệnh ngoài da, bệnh trĩ, làm giảm sốt, thải các độc tố, làm giảm sưng, chảy mủ, chữa được một

số bệnh của phụ nữ (Kumar và

cs, 2014) Diếp Cá có khả năng kháng khuẩn và chống viêm, là tình trạng viêm và nhiễm trùng thường được tìm thấy trong đường sinh dục nữ Theo nghiên cứu của tác giả cho thấy rằng dịch chiết Diếp Cá có tác dụng điều hòa miễn dịch trên niêm mạc âm đạo (Satthakarn

và cs, 2015)

5 Cây Khổ

Qua

Momordica charantia

Rễ cây Khổ Qua dùng trị lỵ, nhất là amip Tại Ấn Độ, dịch

rễ (cũng như lá, trái) Khổ Qua được dùng trị bệnh tiểu đường,

do có tác dụng làm giảm đường huyết Dây Khổ Qua được dùng làm thuốc chữa viêm xoang, chảy nước mũi có mùi hôi hoặc bệnh gan làm vàng da (Phạm Thị Thọ và cs, 2003) Lá có vị đắng, tính mát

Ăn lá non trị bệnh nóng bức trong mình Uống nước lá Khổ Qua trị bệnh nóng mê man hoặc trị mụn nhọt, rôm sẩy Ngoài ra, lá còn có thể trị được

rắn cắn, hạ sốt

6 Cây Đinh

Lăng

Polyscias fruticosa

Đinh Lăng còn có tên gọi

là cây Gỏi

Cá, Nam Dương Lâm

Theo y học cổ truyền, rễ Đinh Lăng có vị ngọt, hơi đắng, tính mát có tác dụng thông huyết mạch, bồi bổ khí huyết, lá có vị đắng, tính mát có tác dụng giải độc thức ăn, chống dị ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ Năm

2015, nhóm tác giả Njateng đã nghiên cứu Đinh Lăng: sử dụng cho các ứng dụng địa phương chống lại bệnh nấm da

và uống chống lại bệnh nhiễm trùng đường sinh dục (Njateng

và cs, 2015) Một nghiên cứu của Bernard đã thử nghiệm trên chuột bạch tạng dùng lòng trắng trứng gây phù nề, và

nghiên cứu cho thấy rằng dịch chiết lá cây đinh lăng ở nồng

độ 500 mg / kg trọng lượng cơ thể có tác dụng ức chế đáng kể trên lòng trắng trứng gây ra phù nề ở chuột bạch tạng Hơn nữa, dịch chiết lá cây đinh lăng còn có tác dụng kháng viêm,

hạ sốt và các nghiên cứu sàng lọc hoạt tính giảm đau được tiếp nhận (Bernard và cs,

1998)

7 Cây Dừa

Cạn

Catharanthus roseus (L) G

Don., Vinca

rosea L, Lochnera rosea Reich

Cây Dừa Cạn còn gọi Trường Xuân Hoa, Hoa Hải Đằng, Bông Dừa, Dương Giác

Theo Đông y và kinh nghiệm dân gian, Dừa Cạn có tính mát,

vị đắng, tác dụng hoạt huyết, tiêu thũng, trị viêm, hạ huyết

áp Rễ Dừa Cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt Năm

2010, Roy và cộng sự đã khảo sát hợp chất tiết ra từ các chủng vi khuẩn nội sinh trên cây Dừa Cạn kháng được

Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Candida albicans gây bệnh ở

người (Roy và cs, 2010) Năm 2011,Kafur và cộng sự đã phân lập được 38 chủng xạ khuẩn có

khả năng kháng Bacillus

cereus,Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albican (Kafur và cs,

2011)

8 Cây Sâm

Đại Hành

Eleutherine subaphylla

Gagnep

Sâm Đại Hành còn gọi là: Tỏi Lào, Sâm Cau, Hành Lào, Tỏi Mọi

Sâm đại hành được dùng làm: thuốc bổ máu chữa thiếu máu, vàng da, xanh xao, hoa mắt, choáng váng, nhức đầu, mệt mỏi Còn dùng chữa ho gà, viêm họng, mụn nhọt, chốc lở Chiết xuất ethanol của củ đã được thử nghiệm chống lại mầm bệnh kháng đa thuốc và cho thấy đó là một nguồn tiềm năng của tác nhân kháng khuẩn chống lại Methicillin resistant

Staphylococcus aureus và Acinebacter baumannii, với

hoạt tính kháng khuẩn cao hơn

so với thuốc kháng sinh tiêu chuẩn (Subramaniam và cs,

Schum.et Thonn

Diệp Hạ Châu còn gọi

là Chó Đẻ Thân Xanh, Chó Đẻ Răng Cưa, Cam Kiềm, Rút Đất, Kham Ham

Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, tất

cả bộ phận cây Diệp hạ châu đắng được phơi khô, sắc uống dùng chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da,

lỡ ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm

má

10 Cây Cỏ

Mực

Eclipta prostrata L

Tên thường gọi: Cỏ Nhọ Nồi, Hạn

Cỏ Mực chứa các dẫn chất thiophen như dithienyl acetylene ester và nhiều dẫn