Nghiên cứu, thử nghiệm dòng nấm kí sinh côn trùng isaria sp bb v3 và ứng dụng trong phòng trừ sinh học rầy nâu và muỗi hành ở cây lúa đề tài nghiên cứu khoa học

Hiện nay, ỏ nước ta các chế phẩm sinh học từ nấm kí sinh côn trùng đang dần được sử dụng thay thế cho thuốc bảo vệ thực vật như: Chế phẩm sinh học- nấm bột Nomuraea rileyi phòng trừ sâu

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 3

ĐẶT VẤN ĐỀ 4

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1.ĐẶC ĐIỂM CỦA RẦY NÂU NILAPARVATA LUGENS 7

1.1.1.Phân bố và kí chủ của rầy nâu 7

1.1.2 Đặc điểm sinh thái học của rầy nâu Nilaparvata lugens 8

1.1.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại của rầy nâu 11

1.1.4 Triệu chứng gây hại của rầy nâu 12

1.1.5 Cách phòng trị rầy nâu trên đồng ruộng 12

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG 14

1.2.1 Khái niệm nâm kí sinh côn trùng 14

1.2.2 Cơ chế tác động của nâm trên cơ thể côn trùng 14

1.3.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG CHI ISARIA 16

1.3.1 Ngoài nước 16

1.3.2 Việt Nam 18

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 22

2.2 VẬT LIỆU 22

2.2.1 Nguồn rầy nâu 22

2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm 22

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG 22

2.3.1 Thiết bị 22

2.3.2 Dụng cụ 23

2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm 23

2.4 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 24

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 24

2.4.2 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu 24

2.4.3 Tiến hành định danh sơ bộ nấm kí sinh côn trùng 25

2.4.4 Nhân giống rầy nâu để làm thí nghiệm 25

2.4.5 Phương pháp hỗ trợ định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử 26

2.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chung nấm Isaria fumosorosea Bb- V3 27

2.4.7 Thử nghiệm tạo môi trường nuôi chủng nấm Isaria furomosae Bb- V3 để sản xuất chế phẩm khảo sát khả năng tiêu diệt rầy nâu trong điều kiện nhà lưới 29

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG ISARIA Bb- V3 33

3.2 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG Bb-V3 DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 34

3.2.1 Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm ký sinh côn trùng Bb-V3 34

3.2.2 Kết quả hỗ trợ định danh chủng nấm ký sinh côn trùng Bb-V3 bằng phương pháp sinh học phân tử 35

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm Isaria fmosorosea Bb-V3 38

3.3.2.Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 39

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

4.1 KẾT LUẬN 44

4.2 KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

A.Tài liệu tiếng Việt 45

B Tài liệu tiếng Anh 47

PHỤ LỤC 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường thạch 28

Bảng 3.2 Mật số bào tử (bt/ml) trên 5 loại môi trường ở thời điểm 6, 8, 10, 12 ngày sau cấy (NSC) 39

Bảng 3.3 Xác định độ che phủ của chủng nấm Iaria fumosorosea Bb- V3 của các

công thức môi trường sau 3 ngày, 5 ngày và 7 ngày nuôi cấy 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh trứng của rầy nâu kí sinh trên thân và lá lúa 8

Hình 1.2 Hình ảnh trứng của rầy nâu 10

Hình 1.3 Vòng đời của rầy nâu 11

Hình 1.4 Hình ảnh rầy nâu non ( ấu trùng); Rầy nâu trưởng thành cánh ngắn (bên trái) và rầy nâu trưởng thành cánh dài ( bên phải) 12

Hình 1.5 Hình ảnh cây lúa bị rầy nâu tấn công 12

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng (Thomas, Read, 2007) 166

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 24

Hình 2.2 Phản ứng PCR 26

Hình 2.2 Quy trình tạo chế phẩm tiêu diệt rầy nâu 26

Hình 3.1 Mẫu côn trùng bị nấm kí sinh Bb- V3 33

Hình 3.1 Đại thể( trái)và vi thể(phải) của các chủng nấm ký sinh côn trùng isaria fumosorosea Bb- V3 phân lập 33

Hình 3 2 Hình thái của nấm Isaria fumosorosea (Nguyễn Thị Thúy, 2016) 34

Hình 3.3 Hình thái của nấm Bb-V3……… 35

Hình 3 5 Khuẩn lạc Bb- V3 trên môi trường PDA ở 3; 30; 40 ngày nuôi 35

Hình 3.6 Phổ điện di DNA của chủng nấm ký sinh côn trùng Bb-V3 35

Hình 3.7 Cây phả hệ trình bày mối liên hệ di truyền của Bb-V3 và các chủng nấm ký sinh côn trùng với nhau bằng phần mềm MEGA 6.06 (Cây phả hệ Maximum Likehood - giá trị bootstrap với 1000 lần lặp lại) 36

Hình 3.8 Sự tăng trưởng đường kính khuẩn lạc của Isaria fumosorosea Bb-V3 38

Hình 3.9 Đặc điểm khuẩn lạc của Isaria Bb-V3 (B) trên các môi trường thạch sau 8

ngày sau cấy 40

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước thuần nông nghiệp, trong đó lúa là một trong những cây trồng quan trọng hàng đầu, vừa cung cấp nguồn lương thực trong nước cũng như xuất khẩu ra nước ngoài Tuy nhiên hiện nay rầy nâu đang là một mối nguy hại lớn đối với nông dân trồng lúa vì nó là một một trong những tác nhân chủ yếu gây bệnh nghiêm trọng trên cây lúa, gây thiệt hại nặng nề cho người nông dân về cả năng suất lẫn phẩm

chất lúa Theo thống kê cho thấy rằng trong 30 năm qua rầy nâu (Nilaparvata lugens)

luôn là một trong các loài sâu hại quan trọng nhất trên cây lúa, trong các năm cuối thập

kỉ 70, 80 diện tích ha bị nhiễm rầy nâu dao động khoảng 1 triệu ha Vào năm 1999, tỉ

lệ giống nhiễm rầy là 70% vào vụ đông xuân và 100% vào vụ mùa, trong khi đó miền Bắc các giống nhiễm rầy như C70, VN10, lúa lai, lúa thuần Trung Quốc chiếm từ 70 – 90% diện tích (Cục BVTV, 2000) Bên cạnh đó, rầy nâu được xem là nguyên nhân hàng đầu ảnh hưởng đến năng suất lúa vì những tác hại trực tiếp và gián tiếp mà chúng gây ra như bản thân chúng hút lấy chất nhựa trong cây lúa sẽ gây ra hiện tượng “cháy rầy” khi ở mật độ rầy cao, sẽ làm cả ruộng lúa bị khô héo, màu trắng tái hoặc trắng, hoặc rầy nâu là môi giới truyền bệnh virus làm gây bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá cho cây lúa, từ đó truyền bệnh cho các cây lúa khác, từ đó có thể làm giảm năng suất lúa tới 50% hoặc mất trắng

Hiện nay có một số biện pháp phòng trừ vấn đề rầy nâu hại lúa, một trong những biện pháp là sử dụng các loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc là hóa học Việc sử dụng thuốc trừ sâu có thể làm giảm thiệt hại do nấm bệnh và rầy nâu gây ra, nhưng cần phải đúng cách nếu không sẽ làm cho rầy nâu có hiện tượng mẫn cảm với thuốc trừ sâu, và tạo ra các chủng nấm bệnh kháng thuốc (Moenne, 1998) Hiện nay,tình trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ hóa học nhằm giúp cây trồng ngăn cản sự phá hoại của côn trùng và đồng thời giúp kích thích cây trồng phát triển, tuy nhiên việc làm này đã và đang sử dụng một cách bừa bãi đến mức dư thừa Điều này chẳng những làm tiêu tốn tiền bạc mà còn gây thiệt hại đến đất trồng,nguồn nước, làm cho môi trường bị ô nhiễm và đặc biệt ảnh hưởng đến sức khỏe con người cũng như những sinh vật trong môi trường ( Nguyễn Thị Huỳnh Như và cs, 2013)

Một trong những giải pháp hiện nay để khắc phục tình trạng trên là dùng các dòng nấm kí sinh có nguồn gốc từ côn trùng để tạo ra chế phẩm tăng cường sức cây

trồng cũng như bảo vệ cây trồng phòng ngừa các tác nhân gây bệnh Nấm kí sinh côn trùng chưa tạo ra tính kháng thuốc và có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại sâu khác nhau, ngoài ra nấm côn trùng không chỉ tiêu diệt trực tiếp sâu hại vào thời kì phá hoại

mà còn tích lũy trên đồng ruộng truyền cho thế hệ tiếp theo ( Lê Anh Tuấn,2013) Trong những năm gần đây, nấm kí sinh côn trùng đã được phát triển ở nhiều quốc gia xem như tác nhân phòng trừ sinh học côn trùng với hơn 100 sản phẩm thuốc trừ sâu vi sinh đã được thương mại hóa vào năm 2006 (Jaronski,2010) Hiện nay, ỏ nước ta các chế phẩm sinh học từ nấm kí sinh côn trùng đang dần được sử dụng thay

thế cho thuốc bảo vệ thực vật như: Chế phẩm sinh học- nấm bột ( Nomuraea rileyi) phòng trừ sâu hại rau, chế phẩm của nấm lục cương ( Metarhizum anisopliae) và nấm bạch cương (Beauveria bassiana) đã được sử dụng để phòng chống hàng loạt sâu bệnh

hại cây trồng: quản lí dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây có múi, chế phẩm sinh học (

Metarhizum anisopliae) trong phòng trừ rầy nâu nhỏ ( Laodelphax striatellus), sùng

đất,rầy lưng trắng,bọ xít,sâu cuốn lá, sâu đo tay Từ đó cho thấy triển vọng sử dụng nấm kí sinh côn trùng có hoạt lực mạnh như là một chiến lược kiểm soát sâu bệnh hại

thay thế Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ NGHIÊN

CỨU ,THỬ NGHIỆM DÒNG NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG ISARIA

FUMOROSEABb-V3 VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC RẦY

NÂU( NILAPARVATA LUGENS) Ở CÂY LÚA”

❖ Mục tiêu:

Nghiên cứu độc tính của dòng nấm Isaria fumosorosea BV-V3 và thử nghiệm trong phòng trừ rầy nâu (Nilaparvata lugens) hại lúa

❖ Nội dung nghiên cứu:

- Định danh hình thái và SHPT chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3

- Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3

- Tạo chế phẩm thử nghiệm khả năng tiêu diệt rầy nâu (Nilaparvata lugens) trên quy mô

nhà lưới

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.ĐẶC ĐIỂM CỦA RẦY NÂU NILAPARVATA LUGENS

Rầy nâu có tên hoa học là Nilaparvata lugens

Phân loại rầy nâu:

Bộ: hemiptera

Họ: Delphacidae

Chi: Nilaparvata

Loài: N lugens

1.1.1.Phân bố và kí chủ của rầy nâu

Phân bố của rầy nâu rộng khắp các nước trồng lúa ở Châu Á, Austalia và một số đảo ở Thái Bình Dương Trên thế giới phạm vi phân bố của rầy nâu rất rộng Theo Mochida (1970), rầy nâu phân bố ở hầu hết các nước trồng lúa nước ở Châu Á như Ấn

Độ, Thái Lan, Camphuchia, Lào, Bangladesh, Indonesia, Srilanca, Philippines, Malaysia, Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam

Tại Việt Nam rầy nâu xuất hiện và gây hại ở hầu hết các tỉnh trồng lúa của cả nước Từ lâu rầy nâu được coi là một trong những loài sâu hại quan trọng ở hầu hết các vùng sản xuất lúa trọng điểm, năm 1958 rầy nâu phát sinh thành dịch phá hoại lúa chiêm từ thời kì trổ- chín ở các tỉnh phía Bắc Vụ mùa năm 1962 và 1971, rầy nâu đã gây thiệt hại cho lúa ở Nghệ An (N D Định, 2009) Theo báo cáo của cục BVTV từ 1986-2000, rầy nâu gây hại mỗi năm khoảng 650.000ha, đặc biệt trong năm 1991, rầy nâu phá hại 1.394.910 ha và gây cháy rầy ở hầu hết các vụ trồng lúa của cả nước Vụ Đông Xuân năm 2006 đến 2009 rầy nâu bùng phát thành dịch trên diện rộng tại ĐBSCL

Lúa nước và cây dại thuộc họ cây thảo là kí chủ chính thích hợp cho rầy nâu sinh sống và đẻ trứng Thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Lúa Quốc Tế (IRRI, 2009) cho biết cỏ dại ở ruộng lúa như cỏ lồng vực, cỏ gối, lúa hoang có thể góp phần làm tăng số lượng rầy khi lúa gần chín, là do đã tạo được môi trường rậm rạp Tuy nhiên có một số tác giả khác cho rằng, các kí chủ hác ngoài cây lúa chỉ là nơi trú ngụ tạm thời của rầy nâu ( Himekly, 1963)

Rầy trưởng thành và rầy non bám vào bẹ lá phần gốc lá, khi mật độ cao chúng

có thể tập trung lên cả phần lá đòng, phiến lá và cổ bông lúa ( N C Thuật và N V Hành, 1980) Rầy nâu đẻ thành từng ổ vào mô bẹ của lá lúa hoặc vị trí khác nhau ( gân

lá chính, phiến lá) tùy thuộc vào giai đoạn sinh trưởng của cây lúa và mật độ của rầy (N C Thuật, 1989) Rầy non chủ yếu bám vào và di chuyển dưới gốc lúa, mật độ cao

có thể di chuyển lên phần thân trên hoặc các lá lúa, bông lúa Rầy nâu có đặc điểm phân bố không đồng đều trên ruộng lúa theo kiểu co cụm, các ổ rầy khá riêng biệt

Hình 1.1 Hình ảnh trứng của rầy nâu kí sinh trên thân và lá lúa

1.1.2 Đặc điểm sinh thái học của rầy nâu Nilaparvata lugens

1.1.2.1 Những nghiên cứu về sinh thái rầy nâu Nilaparvata lugens ở nước ngoài

Rầy nâu có thể di cư với khoảng cách hàng nghìn km, hiện tượng di cư của rầy nâu qua Biển Đông từ Vệt Nam, Trung Quốc tới Nhật Bản và Hàn Quốc ( Kisimoto, 1977; Song và ctv 2018) Rầy nâu trưởng thành có hai dạng cánh ngắn và cánh dài Khi mật độ quần thể tăng lên thì tỷ lệ cánh dài cũng tăng Số lượng và chất lượng cũng tăng Số lượng và chất lượng thức ăn có ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ cánh ngắn và cánh dài, trưởng thành cánh ngắn có thời gian phát dục ngắn hơn trưởng thành cánh dài kể

cả đực và cái ( Kisimoto, 1956) Sự sinh trưởng và phát triển của rầy nâu có mối quan

hệ mật thiết với điều kiện nhiệt độ và ẩm độ Nếu nhiệt độ thay đổi nhanh chóng, sự phát triển, sự phục hồi quần thể và sự sống sót của rầy nâu cũng sẽ bị ảnh hưởng mạnh

mẽ và ảnh hưởng tới phân bộ nhập cư và di cư của rầy nâu ( Bae, 1995)

Theo các tác giả rầy nâu có thể có từ 6-7 lứa ( Wang, 1977), 10 lứa ( Ho và Liu, 1969), 11 lứa ( Chiu,1970) hoặc 8- 11 lứa trong một năm ( Yen và Chen, 1977) Trong

một năm có hai đỉnh cao tương đương với vụ lúa chín trong năm Ở Bắc Bán Cầu, hầu hết các theo dõi đã cho thấy đỉnh cao nhất của rầy nâu vào mùa nửa cuối năm, trong lứa thứ hai ( Choi, 1975; Karim, 1977) Tuy nhiên một số trường hợp cho thấy đỉnh cao nhất lại nằm vào mùa nửa đầu năm hoặc trong vụ lúa thứ nhất ( Alam, 1971)

1.1.2.2 Những nghiên cứu về sinh thái rầy nâu Nilaparvata lugens ở Việt Nam

Ở Việt Nam, rầy nâu tồn tại quanh năm nhưng sự phát sinh gây hại phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện thời tiết, tập quán canh tác của từng vùng miền Ở cắc tỉnh phía Bắc thời tiết khí hâu có bốn mùa rõ rệt thì rầy nâu thường phát sinh từ tháng 1 đến tháng 11 hàng năm và thường có từ 7 đến 8 lứa trong đó gây hại nặng ở lứa 2, lứa 3(

136 lần (N C Thuật, 1989)

Có rất nhiều các tác giả và tài liệu công bố về đặc điểm sinh học của rầy nầu Tuy nhiên người có nhiều công trình liên quan hơn cả phải kế đến là cố PGS.TS Nguyễn Công Thuật (1978) Khi theo dõi đặc điểm sinh học của rầy nâu Ông cho biết: tại Long

An, nhiệt độ nuôi từ 25℃-27℃ thì thời gian phát dục của rầy nâu như sau: trứng từ

6-8 ngày, rầy non từ 12-15 ngày, rầy trưởng thành sống trung bình là 19,2 ngày (cái) và

8 ngày (đực) Tại Hà Nội thời gian phát triển các pha của rầy nâu nuôi trong điều kiện nhiệt độ từ 24,5℃-29,3℃ thời gian trứng là 6,6-7,4 ngày, rầy non 13,4-15,7 ngày, rầy trưởng thành sống 12,2-14,7 ngày Vòng đời từ 26-31 ngày Tháng 11, khi nhiệt độ khoảng 22,3℃, vòng đời rầy từ 35-40 ngày Trong tháng 2- 3, với nhiệt độ thấp hơn khoảng 17℃-20,2℃ vòng đời kéo dài tới 50- 55 ngày

1.1.2.3 Sự phát triển trứng của rầy nâu

Theo N Đ K (1995, thời gian phát dục của rầy nâu trong) vụ mùa nhiệt độ từ 25℃-29℃ thì thời gian trứng khoảng 6,5 ngày, rầy non khoảng 13,5 ngày-16 ngày, trưởng thành từ 6 ngày-9 ngày, trước đẻ trứng 2,5 đến 3 ngày, vòng đời 26 ngày- 30 ngày, nhiệt độ thấp hơn 20℃ hoặc cao hơn 30℃ đều làm cho tỷ lệ nở của trứng giảm ( Visarto, 2005) Số trứng trên mỗi ổ ít nhiều phụ thuộc vào giống lúa làm thức ăn cho

rầy, trên giống nhiễm rầy số trứng/ ổ cao gấp 2 lần so với giống kháng rầy.Bên cạnh

đó, khả năng đẻ trứng còn phụ thuộc vào mùa vụ, trong một năm thì vụ xuân rầy đẻ trứng nhiều hơn mùa vụ, vụ xuân đẻ 255 trứng nhưng vụ mùa chỉ đẻ 164 trứng thấp hơn 1, 37 lần so với vụ xuân Trứng của rầy nâu có hình dạng “ quả chuối tiêu” mới đẻ trong suốt, gần nở chuyển sang màu vàng và có hai điểm mắt đỏ Đẻ thành từng ổ từ 5-

12 trứng nằm sát nhau theo kiều “ úp thìa” đầu nhỏ quay vào trong, đầu to quay ra ngoài biểu bì của bẹ lá Mới đẻ nằm chìm trong mô biểu bì, sắp nở chồi đầu trứng ra ngoài biểu bì bẹ lá Trứng được đẻ ở bẹ lá là chính( lúa non) và ở gân chính của lá lúa ( lúa già) ( Viện BVTV 2003)

Hình 1.2 Hình ảnh trứng của rầy nâu

1.1.2.4 Một số đặc điểm hình thái và sinh học của rầy nâu

Rầy nâu có hai dạng cánh: một dạng cánh dài và một dạng cánh ngắn con cái cánh dài có chiều dài khoảng 4,5mm-5mm, con đực dài khoảng 3,6mm-4 mm Khi rầy nâu ở các điều kiện khác nhau như nhiệt độ, ánh sáng, mật độ, thức ăn ảnh hưởng hưởng lớn đến sự hình thành dạng cánh

Rầy nâu trưởng thành vũ hóa vào buổi sáng, những hoạt động của chúng hình thành sau khi cánh khình thành ( Kisimoto, 1969) Những con cái ngắn bắt đầu giao phối với con cái đực sau khi vũ hóa từ 2 ngày-4 ngày, và 3 ngày-7 ngày đối với những con cái cánh dài ở điều kiện nhiệt độ 25℃, trong khi đó cả hai dạng cánh dài và cánh ngắn của con đực trưởng thành có thể giao phối ngay sau khi vũ hóa ( Kisimoto, 1965)

Đối với rầy nâu trưởng thành cánh dài, con đực hoạt động bình thường trong phạm vi nhiệt độ từ 9℃-31℃, tuổi thọ của rầy trưởng thành giảm khi nhiệt độ tăng trong phạm vi 20℃-33℃ ( Mochida, 1964) Thời kì tiền đẻ trứng và đẻ trứng của rầy

nâu trưởng thành có quan hệ với nhiệt độ, nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gian để trứng

và trước đẻ Rầy nâu đẻ nhiều nhất và điều kiện thuận lợi nhất cho sự phát triển của rầy trưởng thành thành là 27,5℃ ( Chen và ctv,1982)

Rầy non có 5 tuổi, rất linh hoạt, thời gian các tuổi kéo dài từ 2-6 ngày, tuổi từ 2-3 trở lên có màu nâu vàng, trưởng thành có màu nâu tối Vòng đời của rầy từ trưởng thành lứa trước đến trưởng thành lứa sau khoảng 26-31 ngày

Hình 1.3 Vòng đời của rầy nâu

1.1.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại của rầy nâu

Rầy trưởng thành thường tập trung thành từng đám ở thân cây lúa phía dưới khóm, khi bị khua động thì lẩn trốn bằng cách bò ngang hoặc nhảy sang cây khác Ban ngày rầy trưởng thành ít hoạt động trên lá lúa, chiều tối bò lên phía trên thân

và lá lúa Khi lúa ở thời kỳ chín, phần dưới của thân cây đã cứng khô thì ban ngày rầy tập trung phía trên cây hoặc gần chỗ non, mềm của cuống bông để hút nhựa

Sự xuất hiện rầy dạng cánh dài và cánh ngắn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ,

độ ẩm và dinh dưỡng Khi nhiệt độ thấp, ẩm độ cao, thức ăn phong phú thì xuất hiện dạng cánh ngắn nhiều.Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, thức ăn không thích hợp thì xuất hiện dạng cánh dài nhiều

Rầy dạng cánh ngắn có tuổi sống dài, tỷ lệ đực cái cao, số lượng rầy đẻ trứng cao hơn cánh dài Do đó khi tỷ lệ cánh ngắn nhiều thì có khả năng phát sinh thành dịch Một năm phát sinh từ 6 - 7 lứa, trong đó có hai lứa cần chú ý theo dõi và phòng trừ đó

là lứa rầy phá hại vào tháng 4 - 5 với lúa vụ xuân và tháng 8 - 9 với lúa vụ mùa

Hình 1.4 Hình ảnh rầy nâu non (A), rầy nâu trưởng thành cánh ngắn (B) và rầy

nâu trưởng thành cánh dài ( C)

1.1.4 Triệu chứng gây hại của rầy nâu

- Lúa thời kỳ đẻ nhánh nếu bị hại thì hình thành các vết màu nâu đậm, nếu bị hại nặng thì làm cho cây vàng còi cọc, khô héo và chết

- Lúa thời kỳ làm đòng, trổ bông nếu bị rầy gây hại với mật độ cao, làm cây khô héo, hạt và bông lép đen một phần hoặc cả bông

- Khi lúa bị gây hại sẽ làm cho nấm bệnh xâm nhập làm cây thối nhũn, đổ rạp có thể lan rộng ra cả ruộng, cả cánh đồng nếu không phòng trừ kịp thời

Hình 1.5 Hình ảnh cây lúa bị rầy nâu tấn công

1.1.5 Cách phòng trị rầy nâu trên đồng ruộng

- Để hạn chế tác hại của rầy, cần áp dụng các biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp IPM trên đồng ruộng Sử dụng giống kháng rầy, vệ sinh đồng ruộng, cấy thưa 25 -

35 khóm/m2, bón phân NPK cân đối

- Ngoài ra, cần bảo vệ và tăng cường hoạt động của các loài ký sinh thiên địch như tạo nơi cư trú, hạn chế sử dụng thuốc hóa học trong giai đoạn đầu của cây lúa

- Khi mật độ rầy khoảng 50 - 60 con/khóm, tương đương 1.500 con/m2 trở lên thì

sử dụng thuốc đặc hiệu để phun trừ Nếu mật độ cao cần phun 2 lần, lần 2 cách lần 1 từ

5 - 7 ngày

- Dự tính dự báo: Thực hiện dự tính dự báo là cơ sở quan trọng trong công tác

phòng chống sâu bệnh hại cây trồng Dự tính dự báo bằng bẫy đèn, điều tra trực tiếp ngoài đồng ruộng, dự báo sớm sự phát sinh và tỷ lệ rầy nhiễm bệnh là những nội dung quan trọng của qui trình phòng trừ tổng hợp rầy nâu và bệnh vi rút hại lúa (Viện BVTV, 2006)

- Không nên gieo xạ liên tục, nếu điều kiện cho phép nên cho đất có thời gian nghỉ giữa hai vụ lúa khoảng 20- 30 ngày

- Trước khi xuống giống, cần vệ sinh đồng ruộng sạch sẽ, dọn sạch cỏ dại xung quanh bờ, đặc biệt là lúa chét

- Không gieo xạ quá dày, chỉ nên xạ từ 100kg- 200kg giống/ ha ( hoặc 70- 80kg, nếu xạ sàng)

- Sau khi xạ vài ngày, cho nước vào ruộng với độ cao thích hợp để hạn chế rầy chích hút và truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá cho cây lúa non ở đầu vụ

- Bón phân cân đối giữa đạm, lân và kali để cây lúa khỏe, có sức chống chịu với sâu bệnh

- Làm cỏ tỉa dặm kịp thời để ruộng thông thoáng, hạn chế nơi trú ngụ của rầy

- Không nên dùng thuốc có phổ rộng để bảo vệ thiên địch trên ruộng lúa.v.v

- Phòng chống rầy nâu bằng biện pháp sử dụng giống chống chịu: đây là một nội

dung cơ bản trong phòng trừ tổng hợp Sử dụng giống lúa kháng rầy là biện pháp rẻ tiền, hiệu quả, dễ thực hiện trên diện rộng để hạn chế tác hại của rầy nâu Các giống lúa kháng rầy nâu như Mudgo (gen Bph1), ADS7, IR36 (gen Bph2), CR 203, C 70, C180… làm cho rầy sinh trưởng kém, thời gian phát dục kéo dài, tỷ lệ tử vong cao Từ

đó dẫn đến sự phát triển quần thể của rầy nâu kém hơn rất nhiều lần so với khi chúng phát triển trên các giống nhiễm như giống lúa TN1, IR8, IR22

- Phòng chống rầy nâu bằng biện pháp sinh học: Có thể nói, cho đến nay, biện pháp sinh học được nhắc đến như một biện pháp không thể thiếu trong biện pháp bảo

vệ cây trồng Tuy nhiên, trên cây lúa, biện pháp này vẫn chủ yếu là bảo vệ các thiên địch trong tự nhiên thông qua việc thực hiện các biện pháp phòng trừ và canh tác làm giảm việc ảnh hưởng đến suy giảm quần thể của thiên địch trong tự nhiên (Viện BVTV, 2006)

- Phòng chống rầy nâu bằng biện pháp hoá học: Biện pháp hoá học vẫn cần thiết

trong một tương lai dài Theo quan niệm của một số nhà khoa học, phương pháp này không nhằm mục tiêu loại bỏ mà là sử dụng hợp lý và có chọn lọc hoá chất bảo vệ thực vật

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG

1.2.1 Khái niệm nâm kí sinh côn trùng

Khái niêm “ Nấm kí sinh côn trùng- Entomopathogenic fungi (EPF)” hay “ nấm côn trùng- Insect fungi” được các nhà khoa học sử dụng như là thuật ngữ đồng nghĩa,

đề cập về nhóm nấm kí sinh gây bệnh cho côn trùng Nấm kí sinh côn trùng dùng để

mô tả hiện tượng nhiễm vào kí chủ côn trùng khỏe mạnh gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng Trong khi đó, nấm kí sinh thứ phát chỉ có thể kí sinh trên côn trùng đã bị

suy yếu bởi một loại bệnh nào đó hoặc côn trùng bị thương ( Samon el al., 1998; Tzean el al., 1997)

Nấm kí sinh côn trùng được phân chia thành 4 nhóm chính: (1) Kí sinh trong tức

là nấm kí sinh trong các nội quan, xoang cơ thể của côn trùng: (2) Kí simh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng và gây nên bệnh hại cho côn trùng vật chủ; (3) Nấm mọc trên cơ thể côn trùng tức à những nấm đã được trưc tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng kí sinh trên côn trùng; (4) Cộng sinh có nghĩa là cả nấm

và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống (

Samson et al., 1998)

1.2.2 Cơ chế tác động của nâm trên cơ thể côn trùng

Nấm kí sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào côn trùng qua con đường tiêu hóa ( miệng côn trùng), hô hấp ( lỗ thở), qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp

vỏ, tức là phải có khả năng tiếp xúc, bám dính của bảo tử nấm trên bề mặt vỏ cơ thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp cuticun Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

1.2.2.1 Giai đoạn xâm nhập

Giai đoạn xâm nhập được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm cho đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng.Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ ticutin của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carbonxypeptidase A, esterase, cenlulase Các enzyme tạo ra nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và trong các chủng của một loài nấm Hai enzyme quan trọng nhất là protase và chitinase tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì ( thành phần chính là protein), liên quan trực

tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm kí sinh côn trùng ( Luangsa-ard et al., 2006)

1.2.2.2 Giai đoạn phát triển nấm trong cơ thể côn trùng đến khi côn trùng chết

Đây là giai đoạn sống kí sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm, chúng phân tán khắp xoang cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp, hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài, kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết ( Phạm Văn Lâm, 2000)

1.2.2.3 Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm kí sinh Xác của côn trùng chết là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận trong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng,

các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Pennicillium spp Và Fusarium spp định cư

ở lớp biểu bì và cạnh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng chết Do nấm côn trùng có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính sinh thuốc kháng sinhh ức chế hoạt động vi khuẩn của nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ khi bị phân hủy Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bảo tử

Ở giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học, sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật

chủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ lớp vỏ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và bảo tử, vì

vậy mà rất khó xác định loài côn trùng vật chủ ( Luangsa-ard et al., 2006)

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng (Thomas, Read, 2007)

Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiện trên bề mặt, có thể tại nơi bào tử bám vào mọc mầm xâm nhiễm vào bên trong cơ thể vật chủ

Nơi xâm nhập của nấm Beauveria basiana thường có vệt chấm đen hình dạng bất

định Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngưng hoạt động khoảng 2-3 ngày trước thời điểm

phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ Nếu bị bệnh do nấm Beauveria

basiana thì cơ thể sẽ ngưng hoạt động 7 ngày trước khi chết Cơ thể côn trùng bị chết

do nấm côn trùng không bao giờ bị nát, mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống toàn bộ bên trong cơ thể côn trùng chết chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu chết bệnh Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết bệnh do nấm côn trùng với các bệnh khác ( Phan Văn Lâm, 2000)

1.3.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG CHI ISARIA

1.3.1 Ngoài nước

Cho đến nay, trên thế giới đã phát hiện có khoảng 1,5 triệu loại nấm, với khoảng

2000 loài nấm kí sinh côn trùng Trong đó, đa dạng nhất là chi Cordyceps với 500 loài, tiếp theo chi Verticilium với 261 loài, chi Entomophthora với 152 loài, chi

Hypocrella 112 loài, chi Torrubiella 83 loài, chi Aschersonia 79 loài, chi Isaria 42

loài,…( Aung et al., 2008; Luangsa- ard và cs, 2006, Sung et al., 2007a)

Trước đây chi Isaria và chi Peacilomyces javanicus Vấn đề này đã gây ra nhiều

tranh luận cho các nhà khoa học và đến nay đã tách biệt thành 2 chi, 3 họ riêng biệt,

trong đó chi Isaria thuộc họ Cordyceps, chi và Ophiocordycipitaceae, bộ Hypocreales

Kết quả phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự RNAs riboxom, β-tubulin cho thấy

chi Isaria cùng chi với chi Cordyceps Cac loài thuộc chi Isaria có sinh sản dạng vô

tính (Anamorph), còn sinh sản hữu tính ( Telemorph) không có hoặc chưa được biết (

Luangsa- ard et al., 2009; Sung et al., 2007a; Petch, 2009)

Đi tiên phong trong phòng trừ sinh học của nấm kí sinh côn trùng chủ yếu có 2

loài B bassiana và M anisoplie Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy các loài nấm chi Isaria cũng có nhiều triển vọng để phòng trừ sâu hại nông nghiệp Hiện nay, một số loài nấm chi Isaria được sử dụng trong phòng trừ sinh học cây trồng như I

javanica, I fariosa, I fumosorosea Các loài nấm này được nghiên cứu và ứng dụng

vào phòng trừ một số đối tượng sâu hại thuộc bộ Lepidoptera, Hemiptera, Diptera,

Cleoptera, Hymenoptera,…ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Hoa Kỳ,

Brazil, Thái Lan và cho kết quả tốt

Shimazu và Takatsuka (2010) lần đầu tiên phát hiện và phân lập được loài

I.javanica ký sinh trên sâu non sâu róm Lymantria dispar ở miền Bắc Nhật Bản vào

năm 2008 Nấm phát triển trên môi trường SDAY với nhiệt độ 10℃-30℃, tốt nhất ở

25℃ Loài I.Javanica đang nghiên cứu ứng dụng được xem là giai pháp riển vọng để

phòng trừ loài sâu nguy hiểm này ở Nhật Bản

Các nghiên cứu của Nigel và Hywel- Jones (2005) cho thấy chi Isaria có triển vọng trong phòng trừ sâu hại cây trồng điển hình như loài I fumosorosea, I javanica,

I tenuipes Năm 2008 ở Argentina đã sử dụng nấm Isaria phòng trừ sâu hại cây trồng

ở nồng độ 107 bào tử/ml đạt hiệu quả từ 26,6%- 76,6% sau 7 ngày sau lây nhiễm Mặt

khác các loài nấm thuộc chi Isaria thường dễ phân lập, phát triển nhanh, có số lượng

bảo tử nhiều nên có lợi thế nhân nuôi và ứng dụng phòng trừ

Nghiên cứu của Hong Z và cs (2013), nấm I javanica có khả năng gây hại cho

loài bọ phấn hại khoai lang trong phạm vi nhiệt độ khá rộng 15℃-35℃ Tỉ lệ chết của

bọ phấn đạt thấp ở độ ẩm tương đối thấp và không đổi, nhưng khi giữ độ ẩm cao trong

24 giờ đầu rồi chuyển sang độ ẩm thấp các mẫu phân lập có thể xâm nhiếm gây bệnh ở

tất cả các giai đoạn phát triển từ trứng đến nhộng Những kết quả này cho thấy loài I

javanica có tác dụng phòng trừ tốt loại bọ phấn ở các điều kiện khác nhau, có triển

vọng để phát triển thành một loại thuốc vi sinh vật để kiểm soát bọ phấn trắng

Hiệu lực của nấm I.javanica đối với loài mối Coptotermes gestroi đạt hiệu lực

khá cao với tât cả nồng độ thí nghiệm từ 104 đến 108 bào tử/ ml ở nhiệt độ 25℃ ± 1℃

và độ ẩm 80% ± 10% Kết quả cho thấy, nấm I javanica có hiệu quả trong phòng trừ loài mối này ( Lopes et al., 2011)

Isaria fumosorosea, được gọi là P fumosoroseus trong hơn 30 năm trước sửa đổi

phân loại, phân bố trên toàn thế giới và được phân lập từ nhiều côn trùng, đặc biệt là

Lepidoptera, cũng như không khí, nước, thực vật, các loại nấm khác và thường từ đất Isaria fumosorosea được coi là một phức hợp loài với ít nhất ba nhóm đơn thể (

Zimmermann, 2008) Tổ hợp loài I fumosorosea đã thu hút được sự chú ý trong

những năm gần đây do hiệu quả của chúng kiểm soát sinh học các loài bướm trắng

Bemisia và một số chủng thương mại được bán, đặc biệt ở Châu Âu dùng để kiểm soát

sinh học ruồi trắng và các loài sâu bệnh trong nhà kính ( Fana, Wraight, 2007)

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến khả năng nảy mầm của bào tử

nấm I.fumosorosea cho thấy, sự nảy mầm yếu trong điều kiện có ánh sáng ( 43% RH,

28℃) và ổn định trong điều kiện không có ánh sáng hoặc luân phiên (98% RH, 15℃) với mô phỏng khí hậu ôn đới Sự nảy mầm giảm khi nhiệt độ tăng cao và khả năng tồn

tại của bào tử khá cao ở nhiệt độ 45℃ và 50℃, 33% RH trong 160 giờ ( Bouamama et

al., 2010)

Kết quả nghiên cứu của Gabiel đông tác giả (2010) đã lựa chọn được môi trường

nhân sinh khối nấm I.fumosorosea trên môi trường gạo vỡ 3mm dài × 2mm dày (

ngâm nước 40 phút) và gạo nguyên ( ninh 8- 10 phút với nước) đều cho kết quả tốt về khả năng phát sinh bào tử

Nghiên cứu của Jae và đồng tác giả (2014) cho thấy bảo quản bào tử bột của nấm

I fumosorosea trên môi trường rắn của gạo để duy trì các bào tử chịu nhiệt tốt với điều kiện àm khô ở nhiệt độ thấp ( 10℃ và 20℃) trong vòng 48 giờ ( độ ẩm < 5%)

Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã và đang nghiên cứu, ứng dụng nâm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sinh học sâu hại Bên cạnh các loài nấm truyền thống thuộc

chi Beauvera và Metarhizium, thì chi nấm Isaria cũng đã bắt đầu được nghiên cứu và

hứa hẹn có thể tạo ra chế phẩm hiệu quả Kết quả bước đầu cho thấy các loài nấm chi

Isaria có triển vọng trong phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng

1.3.2 Việt Nam

Ở Việt Nam có một số điều tra khảo sát về thành phần các loài nấm kí sinh côn trùng chi Isaria ở hệ sinh thái rừng và hệ sinh thái nông nghiệp

Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An được đánh giá có tính đa dạng sinh học cao, chứa đựng nguồn lợi lớn về nấm kí sinh côn trùng Theo kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và đồng tác giả (2018a,b) đã thu thập và xác định được 71 loài nấm thuộc

17 chi kí sinh trên vật chủ thuộc 3 bộ côn trùng khác nhau, trong đó có chi Isaria có 4 loài là I farinosa, I javanica, I.tennuiqes, Isaria sp Trần Ngọc Lân và đông tác giả

(2011a) đã xác định được 101 loài nấm thuộc 21 chi kí sinh trên 11 bộ côn trùng, 1 bộ

nhện Chi Isaria có 10 loài, 143 mẫu, trong đó I tenuipes phổ biến nhất, tiếp theo là I

javanica

Theo Trần Ngọc Lân và tác giả (2011a,b) loài nấm I.tennuipes thu thập tại VQG

Pù Mát, Nghệ An chủ kí sinh trên sâu nhộng, sâu cánh vải, quả thể có 4 dạng hình thái ( hoa cúc trắng, lục bình trắng,bông tuyết, dạng vô tính kết hợp hữu tính), sinh trưởng nhanh trên PDA, bào tử dạng bột và có triển vọng phòng trừ sâu hại cây trồng

Ở hệ sinh thái nông nghiệp, Phan Thị Vượng và đồng tác giả (2014) đã thu thập, phân lập và xác định được tên khoa học của 6 loài nấm kí sinh rầy nâu hại lúa tại Thái

Bình, loài I javanicus chiếm ưu thế với 20.83% so với các loài nâm kí sinh côn trùng khác Trần Thị Tho và đồng tác giả (2014) đã thu thập được 7 chủng P.javanicus kí sinh trên rệp sáp giả gây hại vườn cây ăn quả tại Cần Thơ, Vĩnh Long và Sóc Trăng

Theo Nguyễn Thị Thúy và dồng tác giả (2012b) đã phát hiện dạng sinh sản hữu

tính của loài I tenuipes là Cordyceps takaomontana tại VQG Pù Mát Nấm Cordyceps

takaomontana kí sinh trên côn trùng bộ cánh vảy, quả thể từ 2- 4 cái; màu nâu nhạt

đến da cam nhạt; hình trụ hoặc hình chùy; dài 3,90 đến 11,20mm Nuôi cấy trên PDA

ở 25℃ nấm phát triển tương đối nhanh, đường kính tản nấm sau 12 ngày đạt

38,18±4,47mm Đây là một trong ít loài nấm thuộc cho Isaria xác định thuộc dạng hữu tính và thuộc chi Cordyceps

Theo Nguyễn Thị Thủy và đồng tác giả (2012a), nâm I.javanica sinh trưởng và

phát triển nhanh trên môi trường lên men rắn, với hàm lượng cơ chất 150g gạo lứt và 3g nhộng tằm trong bình 500ml Nấm bao phủ toàn bộ môi trường sau 10 ngày và đạt nồng độ bào tử cao nhất là 67,58 ×106 bt/g sau 12 ngày nuôi cấy Bên cạnh đó, môi trường SDAY3 gồm 10g cao thịt ( pepton), 40g đường ( dextrose), 2g cao nấm men ( yeast extract), khoáng, 1000ml nước cất) cũng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát

triển của nấm P javanica, mật độ đạt 108 bào tử/cm2 Hai hoạt chất Hexaconzole và Carbendazim trong thuốc trừ nấm ức chế hoàn toàn khả năng phát triển của nấm này theo Trần Thị Tho và đồng tác giả(2014)

Trên sâu khoang nấm xâm nhiễm, gây bệnh và phát triển nhanh quá 5 giai đoạn, với vòng đời 7,82 ±0,23 ngày và chu kì 12,79±0,36 ngày Mỗi giai đoạn có những triệu chứng khác nhau và điểm đặc trưng là bảo tử hình thành sớm sau 5-6 ngày sâu chết, mật độ cao 7,1×107 bào tử/con, dạng bông xốp, màu xanh nhạt hoặc xám tro ( Nguyễn Thị Thùy, 2016)

Phan Thị Thu Hà và đồng tác giả (2014) đã nghiên cứu sản xuất và ứng dụng

nấm tím P javanica phòng chống rầy nâu hại lúa Kết quả cho thấy, sử dụng công

nghệ sản xuất lên men xốp với môi trường gạo hấp 100g trộn 30ml dung dịch CaCO3

0,5% từ chủng PaeR2 có thể sản xuất chế phẩm nấm đạt nồng độ 2,5×109 bào tử/g chế phẩm khô, Chế phẩm có hiệu lực trừ rầy đạt 82,26- 86,09% sau 11-14 ngày trong điều kiện nhà lưới; đạt 57,24% hiệu lực sau phun 10 và 14 ngày tương đương với thuốc hóa học Actara 25WG khi sử dụng trên đồng ruộng tại Thái Bình trong vụ mùa 2012

Nấm I.javanica có hiệu lực cao đối với 2 loại rệp Brevicoryme brasiceae (Linn.)

và rệp muội Aphis medicaginis (Koch) với tỷ lệ chết đạt trên 90% ở nồng độ 8,5×107

bt/ml sau 10 ngày lây nhiễm ở cả trong phòng thí nghiệm và ô lưới (theo Nguyễn Thị Thanh và đồng tác giả (2011b))

Nhìn chung các nghiên cứu về đà dạng sinh học hay nguồn lợi tự nhiên của chi

nấm Isaria còn ít Một số kết quả bước đầu cho thấy, các loại nấm Isaria phân bố khá

rộng ở nhiều nước trên thế giới nhưng không phổ biến Chi nấm này chủ yếu thu thập được ở hệ sinh thái rừng nhiệt đới với phổ vật chủ ký sinh khá đa dạng thuộc bộ Cánh màng, bộ Cánh vảy, bộ Cánh nửa, bộ Nhện lớn, ở pha sâu non nhộng và trưởng thành

Ngoài ra một số loài I fumosorosea và I javanica cũng mới phát hiện có phân bố ở cả

rừng trồng và hệ sinh thái nông nghiệp nhưng không phổ biến, sinh trưởng nhanh trên môi trường PDA ( Nguyễn Thị Thủy 2016)

PHẦN HAI: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2018- 03/2019 tại phòng thí nghiệm Động vật học và phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp HCM, cơ sở 3 Bình Dương số 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Nguồn rầy nâu

Thu thập nguồn rầy nâu từ các ruộng lúa tại huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở

Tp HCM, cơ sở 3 Bình Dương Trước đó tiến hành trồng lúa vào các thùng xốp tại vườn trường, miệng thùng được che phú bở các lớp màng lưới Sau khi gieo lúa vào các thùng xốp, tưới mỗi ngày, sau khoảng 10 ngày khi lúa bắt đầu lên đều khoảng 10cm, đem bỏ rầy râu thu thập được vào các thùng xốp trồng lúa để nuôi, xung quanh các thùng đều làm màng lưới che lại để rầy nâu không bay ra ngoài

2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm

Nguồn nấm kí sinh côn trùng được phân lập từ mẫu côn trùng bị nhiễm nấm kí sinh ngoài tự nhiên gồm mẫu ve sầu bị nấm kí sinh thu tại vườn cà phê, xã Sơ Pai, K’bang, tỉnh Gia Lai

Sau đó được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Động vật học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở, cơ sở 3 Bình Dương

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG

- Đũa thủy tinh

- Que cấy ( que cấy móc, que cấy vòng)

2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm

- Môi trường: Môi trường Potato Dextrose Agar ( PDA)

- Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm Lactophenol Control blue ( LPCB)

- Hóa chất: Nacl, đường Glucose, cồn 960, cồn 700, Tween 80

- Nguyên liệu: cám gạo, đậu tương, trấu, bột ngô, lúa

2.4 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

2.4.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu của đề tài đưa ra, chúng tối tiến hành bố trí thí nghiệm theo sơ đồ:

Chủng nấm Isaria Bb- V3 đã được phân lập

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Isaria

fumosorosea Bb- V3

Nghiên cứu tạo chế phẩm hảo sát hiệu lực tiêu diệt rầy nâu

chủa chủng nấm Isaria fumosorosea Bb- V3

Định danh các chủng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa

trên hình thái bằng kĩ thuật sinh học phân tử

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.4.2 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu

Chủng nấm Isaria sp Bb- V3 được phân lập từ mẫu ve sầu bị nấm kí sinh thu tại

vườn cà phê, xã Sơ Pai, Kbang, tỉnh Gia Lai đem về phòng thí nghiệm Động vật học Trường Đại Học Mở tp HCM cơ sở 3 Bình Dương để tiến hành

2.4.3 Tiến hành định danh sơ bộ nấm kí sinh côn trùng

- Mặt dưới đĩa petri

- Mặt trên đĩa petri

2.4.3.2 Quan sát trên kính hiển vi

Cách thực hiện: lấy một lame kính sạch, trong, đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2cm và có độ dày của cạnh khung là 0.3cm Đặt khung giấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch môi trường PDA bán lỏng ( khoảng 10µ) lên lam kính vào giữa khung giấy Tiếp đến cấy nấm vào giữa môi trường đã được bơm vào ( cấy đơn bào tử hay cấy đầu sợi nấm) Đậy lamen lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ấm ( ở đây sử dụng địa petri bên trong có chứa bông gòn ẩm bên trên có đặt thnah chữ U bằng sắt) Để trong hai ngày, sau đó lấy lam kính ra, bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát Quan sát đặc điểm vi thể: dạng bào tử, tơ nấm, cuống bào tử ở vật kính ×40 Chụp ảnh khóm nấm trên đĩa petri và vi thể nấm trên kính

Lưu ý:

- Cần chú ý thao tác vô trùng tránh nhiễm các vi sinh vật khác làm sai lệch kết quả

- Buồng ẩm và nước cất bơm vào tạo môi trường ẩm đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 20 phút

2.4.4 Nhân giống rầy nâu để làm thí nghiệm

Tiến hành trồng lúa vào các thùng xốp đặt ngoài vườn trường Đại học Mở Tp HCM cơ sở 3 Bình Dương, đợi lúa lên trong vòng 7 ngày, sau đó tiến thu mẫu rầy nâu tại các ruộng lúa tại huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang đem về thả vào thùng lúa vây lưới xung quanh

Chú ý: nên thường xuyên tưới nước cho lúa để lúa không bị khô héo, các thùng lúa nên để ở nơi có ánh sáng để rầy nâu có thể phát triển , sinh sản để nhân giống

2.4.5 Phương pháp hỗ trợ định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử

2.4.5.1 Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm kí sinh côn trùng Bb- V3

Hình 2.2 Phản ứng PCR

2.4.5.4 Điện di gel chứa sản phẩm PCR

Sản phẩm DNA của nấm kí sinh côn trùng sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR sẽ tiếp tục được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1% Sau khi điện di trên gel agarose

Cách tiến hành :

- Chuẩn bị gel agarose 1%

- Chạy điện di trên gel agarose: đặt khuân gel vào bể điện di TAE buffer 1X cho ngập giếng, load vào mỗi giếng 6µl DNA đã được trộn với 1µl loading buffer Load 6µl thang chuẩn vào giếng còn lại Bật nguồn điện cho thiết bị chạy ở 70V trong 40 phút Sau đó tắt nguồn điện cho thiết bị chay ở 70V trong 40 phút Sau

đó tắt nguồn điện, lấy khuân gel ra khỏi thiết bị điện di và chụp hình gel

- Chụp hình gel đã chạy điện di

2.4.5.5 Giải trình tự DNA và xây dựng cây phát sinh loài

Sản phẩm DNA sau khi được PCR và điện di được sử dụng giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự thông qua công ty VNDAT ( http://vndat.com.vn/vn/) Sử dụng chương trình BLAST và CLUSTAL để so sánh trình tự DNA của nấm với trình tự các đoạn DNA của bộ gen của các loài nấm có trong ngân hàng gen (NCBI) và vẽ cây phả

hệ để định danh vi nấm Xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.06

2.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chung nấm Isaria fumosorosea sp Bb- V3

2.4.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb- V3

Chủng nấm Isaria sp Bb- V3 thuần nuôi trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng sau đó

cấy một khoanh nấm đường kính khoảng 10mm vào giữa đĩa petri loại 9cm có chứa môi trường thạch, mỗi loại gồm : SDAY ( Sabouraud Dextrose Agar Yeast), SDAY1 ( Sabouraud Dextrose Agar Yeast( Sabouraud Dextrose Agar Yeast) , SDAY3 ( Sabouraud Dextrose Agar Yeast có thêm khoáng chất), SMAY (Sabouraud Maltose Agar Yeast), PDA ( Potato Dextrose Agar) được tham khảo sử dụng cho nghiên cứu ( Trần Văn Cảnh, 2012; Trịnh Thị Xuân, Lê Tuấn Anh, 2016)

Bảng 2.1 Thành phần môi trường thạch

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm chủng nấm phân lập được và môi trường dinh dưỡng khác nhau SDAY, SDAY1, SDAY3, SMAY, PDA Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

- Điều kiện: nhiệt độ phòng, tối hoàn toàn

- Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính khuẩn lạc ( cm) màu sắc khuẩn lạc sau 7, 14, 21 và

28 ngày nuôi cấy sẽ ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc bằng cách lấy trung bình đường kính trên 2 trục của khuẩn lạc theo công thức ( Trịnh Thị Xuân, Lê Tuấn Anh, 2016):

Trong đó: D1 và D2 là độ dài hai đường chéo phần khuẩn lạc phân bố

2.4.5.6.2 Ảnh hưởng của thời gian nuối cấy đến sự hình thành bào tử của nấm Isaria

sp Bb- V3

Chủng nấm Isaria sp Bb- V3 gốc nuôi trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng sau đó cấy

một khoanh nấm đường kính khoảng 10mm vào giữa bình serum ( cao 8cm, đường

vị tính

Công thức môi trường

SDAY SDAY1 SDAY3 SMAY PDA