Cây đơn bội kép tạo ra từ nuôi cấy bao phấn có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hoàn toàn không phân ly trong các thế hệ sau và có thể tạo ra được trong thời gian ngắn 1 thế hệ, tiết kiệm được
ĐẶC TÍNH SINH HỌC CÂY ỚT CAPSICUM ANNUUM L
Sơ lược về cây học Cà Solanaceae
Họ Cà (Solanaceae) gồm khoảng 120 chi và 2460 loài theo hệ thống APG II năm 2003, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Ở Việt Nam có khoảng 70 loài, gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ Một số loài được trồng làm thực phẩm như cà tím, cà pháo, cà chua và khoai tây; làm gia vị như ớt; là cây công nghiệp như thuốc lá; hoặc hoa kiểng Các cây trong họ Cà thường chứa alkaloid độc nên cũng có thể được dùng làm cây thuốc Nam.
Cây thường là thân thảo, mặc dù có cây bụi và cây gỗ nhỏ Hoa của chúng có dạng hình nón hay hình phễu với 5 cánh hoa, thông thường là hòa lẫn Lá mọc so le, thường có lông hoặc bề mặt hơi dính Các loài trong họ này sinh ra quả hoặc là quả mọng (cà chua) hay quả nang dễ nứt (chi Datura) Hạt thường tròn và bẹt, đường kính 2-4 mm Các bầu nhụy ở phía dưới nhụy hoa dưới bầu là loại quả tụ nằm xiên so với điểm giữa
Số lượng nhiễm sắc thể là 2n = 24
Sơ lược về cây ớt Capsicum annuum L
1.2.2 Nguồn gốc, phân bố Ớt đã là một phần trong ẩm thực của loài người ít nhất là 7500 năm trước Công nguyên và có lẽ sớm hơn Có những bằng chứng khảo cổ ở các khu vực ở tây nam Ecuador cho thấy ớt đã được thuần hóa hơn 6000 năm về trước, và là một trong những loại cây trồng đầu tiên ở châu Mỹ Người ta cho rằng ớt đã được thuần hóa ít nhất năm lần bởi những cư dân tiền sử ở các khu vực khác nhau của Nam và Bắc Mỹ, từ Peru ở phía nam đến Mexico ở phía bắc và một số vùng của các bang Colorado và New Mexico bởi các dân tộc Pueblo Cổ đại
Christopher Columbus đã là một trong những người châu Âu đầu tiên thấy ớt (ở Caribe), và gọi chúng là "tiêu" vì chúng có vị cay tương tự (không phải bề ngoài giống nhau) Ớt đã được trồng khắp nơi trên thế giới sau thời Columbus Diego Álvarez Chanca, một thầy thuốc trong chuyến đi thứ hai của Columbu đến West Indies năm 1493, đã mang những hạt ớt đầu tiên về Tây Ban Nha
Từ Mexico, vào thời đó đang là thuộc địa của Tây Ban Nha, cũng là một nước kiểm soát thương mại với châu Á, ớt đã nhanh chóng được chuyển qua Philippines và sau đó là Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản với sự trợ giúp của các thủy thủ châu Âu Gia vị mới này đã nhanh chóng được sử dụng trong chế biến thức ăn của các quốc gia này Ớt là cây "đặc sản" của vùng nhiệt đới, các giống ớt trồng ở vùng này thuộc nhóm cay hoặc hơi cay Tuy nhiên ngày nay ớt được trồng rộng rãi trên toàn thế giới từ 55°B - 55°N, đặc biệt nhiều nước ở châu Mỹ và một số nước châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc, Indonesia, Việt Nam, Malaysia Nước trồng ớt sớm nhất ở Đông Nam Á là Indonesia, sớm hơn châu Âu
Hiện nay, Ấn Độ là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt (100lb mỗi bao) Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu đầy đủ về lịch sử trồng trọt ớt cay, nhưng căn cứ vào sự đa dạng của các giống địa phương đã khẳng định ớt được trồng từ rất lâu đời Nhiều giống ớt cũng được người Pháp đưa sang trồng rất sớm, từ đó ớt được trồng phổ biến ớ các vùng sinh thái khác nhau và chủ yếu trong vụ Xuân Hè Trong khu vực này có nhiều giống ớt địa phương được hình thành để phục vụ cho từng mục đích sử dụng khác nhau (Lê Thị Khánh, 2009)
1.2.3 Đặc tính sinh học của cây ớt Ớt là cây loại cỏ mọc hàng năm tại những nước ôn đới, sống lâu năm và thân phía dưới hóa gỗ ở những nước nhiệt đới (Đỗ Tất Lợi, 2004)
Bộ rễ ớt ăn sâu và phân nhánh mạnh về bốn phía, có thể tới 70-100 cm để cố định cây, nhưng chủ yếu tập trung ở tầng đất 0-30 cm, phân bố theo chiều ngang với đường kính 50-70 cm Có hai loại rễ: rễ chính (rễ trụ) và rễ phụ (rễ bên) Bộ rễ ớt rất háo nước, ưa ẩm, ưa tơi xốp và không có rễ bất định Độ sâu và mức độ ăn sâu của bộ rễ liên quan đến sự phát triển của các bộ phận trên mặt đất (Lê Thị Khánh, 2009).
Thân cây ớt thuộc loại thân gỗ, tròn và dễ gãy, một số giống khi còn non có lông mỏng; khi già, phần sát mặt đất có vỏ xù xì và hóa bần Độ dài của thân chính phụ thuộc vào giống, trong khi trên thân các cành phát triển mạnh và có thể mọc đối xứng hoặc lệch tùy từng giống Chồi ngọn phân đôi thành hai đỉnh sinh trưởng, mỗi đỉnh sau đó sẽ phát triển thành một cành mới, chu kỳ phân đôi lại tiếp tục ở các chồi cành Sự phân nhánh trên thân chính cao hay thấp, sớm hay muộn bị ảnh hưởng bởi đặc tính của giống và kỹ thuật canh tác (Lê Thị Khánh, 2009).
Lá: Lá có hai dạng chủ yếu: Dạng elip (bầu dục), dạng lưỡi mác Phiến lá mỏng không có răng cưa, đầu lá nhọn, gân lá dày nổi rõ, phân bố dày và so le Cuốn lá mập khỏe, dài, chiều dài cuốn thường chiếm 1/3 so với tổng chiều dài lá (2,5 – 5 cm) tùy giống Lá thường có màu xanh đậm, xanh nhạt, xanh vàng và màu tím Một số giống trên mặt lá non có phủ lông tơ Lá ớt nhiều hay ít có ảnh hưởng đến sản lượng quả sau này Lá ít không những ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của cây mà còn làm cho ớt ít quả vì ở mỗi nách lá nơi phân cành là vị trí ớt ra hoa ra quả (Lê Thị Khánh, 2009)
Hoa: Hoa lưỡng tính (tự thụ phấn), công thức cấu tạo của hoa: K5C5A5G5, đầu nhụy chia hai vòi dài, thuận tiện cho quá trình tự thụ phấn Hoa mẫu 5, đều, thường có hiện tượng rụng hoa, rụng nụ trên cây Hoa thường phân bổ đơn hoặc thành chùm (1 - 3 hoa/chùm nhưng rất ít) Nhị có bao phấn tách rời và hợp lại thành 2 - 3 bó Mỗi hoa đều có cuống hoa, phát sinh từ nách lá và 2 cánh đối xứng nhau Cuống hoa màu xanh, đầu cuống hoa loe ra thành đế hoa Trên các đế hoa có các bộ phận chính như đài, tràng, nhị, nhụy hoa Khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi cho quá trình thụ phấn, thụ tinh và sinh trưởng dinh dưỡng, thì lớp tế bào riêng lẻ có cấu tạo đặc biệt bằng nhu mô được hình
7 là vị trí đính cuống hoa, tại giao điểm với cành nách lá Lớp tế bào ở khu vực này sẽ thoái hóa và chết đi, hình thành một tầng rời khiến hoa bị rụng Mức mẫn cảm của lớp tế bào này với điều kiện ngoại cảnh phụ thuộc vào giống, theo Lê Thị Khánh (2009).
Quả ớt là quả mọng nhiều nước, có cấu tạo gồm 3 phần (từ ngoài vào trong): thịt quả, xơ thịt (lõi quả) và hạt; nửa quả gần cuống to hơn và chứa nhiều hạt hơn nửa phía ngọn Hạt ớt nằm tập trung quanh lõi quả, phần cay chủ yếu tập trung ở giữa đến cuống quả Quả ớt khi chín có màu đỏ, vàng hoặc tím đen và có nhiều dạng: to hoặc nhỏ, dài hoặc nhọn cuối quả (chìa vôi), quả dài cong ở cuối (sừng bò), quả tròn dài; ớt ngọt thường to hơn Ớt cay và ớt ngọt có nhiều hình dạng tùy thuộc giống và kỹ thuật canh tác, như hình tròn dẹt như quả cà chua, hình tròn dài như cà tím, hình đào tròn bầu như quả lê, hoặc dạng sừng bò và chìa vôi Độ lớn, trọng lượng và số lượng quả trên cây phụ thuộc giống; tỉ lệ chất khô/tươi và hàm lượng chất cay, dinh dưỡng thay đổi ngay trong một quả và phụ thuộc vào giống cùng chế độ dinh dưỡng, nước tưới Hạt ớt nhẵn, dẹp có màu vàng; sức nảy mầm cao và nếu bảo quản tốt có thể giữ được 2–3 năm (Lê Thị Khánh, 2009).
1.2.4 Thành phần và công dụng của cây ớt Ớt chứa nhiều chất dinh dưỡng dễ tiêu hóa như đường, đạm, caroten (tiền vitamin A), các sinh tố khác như vitamin C, B1, B2 (Lê Thị Khánh, 2009) Trong 100 g ớt tươi có chứa các thành phần dinh dưỡng như: năng lượng 40 kCal; calcium 14 mg; phosphate 43mg; iron 1,03 mg; vitamin C 143,7 mg; niacin 1,244 mg; vitamin E 0,69 mg; pantothenic acid 0,201 mg (Cơ sở dữ liệu Dinh dưỡng Quốc gia Mỹ USDA, 2015)
Ngoài công dụng làm gia vị ớt còn dùng để chế biến thuốc chữa bệnh, nước hoa, dùng trong y học, trong quốc phòng Tinh dầu ớt được chiết để điều chế thuốc chống thấp khớp, rượu ớt đỏ là loại thuốc chống bệnh hoại huyết, ớt ngọt dùng làm thực phẩm (còn gọi là ớt thực phẩm), làm thức ăn trộn (salad), nhồi thịt Ớt đã tham gia vào ngành công nghiệp chế biến đồ hộp (tương ớt ở Mỹ) (Lê Thị Khánh, 2009)
8 Ớt là cây gia vị quen thuộc với nhân dân Ớt cay xay thành bột là một mặt hang xuất khẩu có giá trị trong nhiều năm gần đây Nếu chế biến được tinh dầu ớt thì giá trị xuất khẩu lại càng tăng lên gấp bội (Lê Thị Khánh, 2009)
Cây ớt được trồng ở hầu hết các nước trên thế giới, năm 2011 diện tích ớt tươi trên thế giới hơn 183 triệu ha và sản lượng ớt tươi hơn 29 triệu tấn, năng suất ớt tươi là 161 tấn/ha, diện tích ớt khô, ớt bột 20 nghìn ha và sản lượng ớt khô, ớt bột 3,4 triệu tấn, năng suất ớt khô, ớt bột 17 tấn/ha Châu Á đứng đầu thế giới về năng suất và sản lượng, với 60,5% diện tích và 64,8% sản lượng của toàn thế giới (FAO, 2012) Ở nước ta cây ớt được đưa vào trồng trọt từ lâu đời, do thích ứng được nhiều vùng đất khác nhau nên khả năng mở rộng diện tích lớn nhất, đặc biệt là những năm gần đây rất nhiều địa phương Năm 2012, FAO thống kê thì diện tích trồng ớt của cả nước là 6,5 nghìn ha, sản lượng 62,9 nghìn tấn, năng suất trung bình chỉ đạt 9,66 tấn/ha thấp hơn so với toàn thế giới là 14,5 triệu tấn/ha Việt Nam đứng thứ 7 trên toàn thế giới về diện tích trồng ớt khô, ớt bột và đứng thứ 5 về sản lượng Sản phẩm ớt bột ở nước ta hiện nay đang đứng đầu trong các mặt hàng gia vị xuất khẩu, với thị trường tiêu thụ khá ổn định ở các nước trên thế giới Ớt quả khô chủ yếu xuất sang thị trường Nhật Bản, Hồng Kông, Singapo ớt bột xuất sang các nước Liên Xô (cũ), Tiệp Khắc, Hunggari, Bungari, đem lại nguồn thu lớn cho đất nước
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
Khái niệm và ứng dụng
Thuật ngữ “nuôi cấy mô tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều
Điều kiện vô trùng đóng vai trò quyết định trong hệ thống nuôi cấy mô thực vật Hệ thống nuôi cấy mô thực vật được sử dụng để nghiên cứu các vấn đề liên quan đến thực vật, bao gồm sinh lý học, hóa sinh, di truyền học và cấu trúc thực vật (Dương Công Kiên, 2002).
Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô
2.2.1 Sự lựa chọn mẫu cấy
Việc lựa chọn nguồn mẫu cấy thích hợp là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả nuôi cấy mô Nói chung, mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây, trong khi chồi hoa non hoặc cụm hoa cũng thường cho kết quả tái sinh rất tốt Mẫu cấy phù hợp phải có khả năng biểu hiện tính toàn năng tế bào (totipotency), như đã được nêu trong công trình của Dương Công Kiên (2002).
Phần quan trọng nhất trong kĩ thuật vô trùng và quá trình nuôi cấy là khử trùng mẫu cấy, môi trường, duy trì trạng thái khi đưa mẫu vào bình Vi khuẩn và vi nấm là hai nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy mô thực vật Bào tử nấm có trọng lượng nhẹ và hiện diện khắp nơi trong môi trường sống của chúng ta Khi bào tử nấm tiếp xúc với môi trường nuôi cấy thì đây là điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm của bào tử và từ đó phát triển nguồn lây bệnh (Dương Công Kiên, 2002)
Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp là một yếu tố quan trọng quyết định sự thành công trong nuôi cấy mô Nhìn chung, môi trường nuôi cấy sẽ bao gồm các muối vô cơ (các khoáng đa lượng và khoáng vi lượng), các chất hữu cơ như: chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, đường Ngoài ra, môi trường nuôi cấy còn có các amino acid, kháng sinh hoặc các phức hợp tự nhiên (Dương Công Kiên, 2002).
Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy
2.3.1 Ánh sáng Đối với mô nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết, vì năng lượng được cung cấp dưới dạng glucid trong môi trường nuôi cấy Tuy vậy sự quang tổng hợp đường dường như không bị hủy bỏ mà chỉ giảm mạnh Ngoài ra,
10 ánh sáng còn cần thiết để điều hòa vài quá trình về hình dạng cây (Dương Công Kiên,
Nhiệt độ đóng vai trò quyết định đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây con trong hệ thống nuôi cấy in vitro Để tối ưu quá trình này, nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được duy trì ổn định ở khoảng 22–25°C, giúp hạn chế stress nhiệt và nâng cao tỷ lệ sống cũng như chất lượng cây con Theo Dương Công Kiên, việc kiểm soát nhiệt độ phù hợp là yếu tố then chốt trong quy trình nuôi cấy, ảnh hưởng trực tiếp đến sự phân hóa mô, phát triển chồi và tăng trưởng toàn diện của cây con in vitro.
2.3.3 pH Ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho cây Người ta thường chỉnh pH khoảng 5,8 đây là mức tốt để cây có thể hấp thụ muối khoáng (Dương Công Kiên, 2002)
Thông thoáng khí giúp cây trong nuôi cấy mô hô hấp và quang hợp tốt (Dương Công Kiên, 2002)
Nhu cầu khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời tương đồng với nhu cầu của cây ngoài tự nhiên Do đó, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lượng và vi lượng là thiết yếu cho sự phát triển của thực vật (Dương Công Kiên, 2002).
Cây in vitro sống chủ yếu bằng phương thức dị dưỡng, mặc dù dưới ánh sáng nhân tạo cây có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nhưng bị hạn chế nên việc đưa vào môi trường nuôi cấy các nguồn carbon dưới dạng hữu cơ là bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối Tùy mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô có thể dùng các loại đường khác nhau: sucrose, glucose, maltose, galactose, lactose ở nồng độ thường 20 - 40 g/L (Dương Công Kiên, 2002) Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng, thoái biến và hình thành melanoidin, một chất màu sẫm và có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào
Tất cả tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp các vitamin cơ bản, nhưng lượng sản phẩm thường ở mức dưới mức yêu cầu cho sự phát triển tối ưu Để mô nuôi cấy có sức sinh trưởng tốt, môi trường nuôi cấy cần được bổ sung thêm một hoặc nhiều loại vitamin thiết yếu cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào Việc bổ sung vitamin giúp thuận lợi cho sự phát triển của cây nuôi cấy in vitro (Dương Công Kiên, 2002).
Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol Trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Agar là một polyoside có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidium Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi trường gây chết mô do thiếu oxy (Dương Công Kiên, 2002).
Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng
Auxin được gọi là hormone sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của, sự sinh trưởng của quả tạo ra quả không hạt (Ngô Xuân Bình, 2009)
Auxin gây ảnh hưởng đến sự kéo dài trong tế bào chồi trong vùng gần đỉnh và giống như indole-3-acetic acid (IAA) trong hoạt động sinh lý Auxin cũng có những ảnh hưởng khác bên cạnh sự kéo dài, nhưng sự kéo dài là quan trọng nhất Auxin nói chung mang tính acid với một nhân không bão hòa hoặc những dẫn xuất của chúng (Bùi Trang Việt,
Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự phân chia tế bào nhanh) Auxin sẽ di chuyển xuống rễ và tích tụ ở đó Auxin có sự tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và kích thích sự phân hóa mô dẫn (Bùi Trang Việt, 2000)
Auxin có thể được chia thành 6 nhóm sau:
Những dẫn xuất indole: Indole-3-acetic (IAA) và Indole-3-butyric acid (IBA)
Những chlorophenoxyacetic acid: 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) và 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)
Picolinic acid: 4-amino-3,5,6-trichloropiconic acid (Tordon hay Pichloram)
Những naphthalene acid: α và β-naphthaleneacetic acid (α và β-NAA)
Những naphthoxyacetic acid: α và β-naphthoxyacetic acid (α và β-NOA)
Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric axid), IAA (3
- indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic axid), 2,4-D (2,4-D Dichlorophenoxyaxetic axid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic axid) Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển callus Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc NaOH pha loãng
Trong số các loại auxin được sử dụng, 2,4-D được xem là một auxin mạnh, có tác dụng giúp hình thành mô sẹo Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng độ quá cao auxin này sẽ gây độc cho tế bào, thậm chí gây biến đổi di truyền Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thường đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất điều hòa nội sinh trong cây được nuôi cấy Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng IAA nội sinh tích lũy tăng cao Điều này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động của enzyme IAA oxidase, IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định (Bùi Trang Việt,
Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, từ đó thúc đẩy tăng trưởng và phát triển mô ở cây Vì tác dụng kích hoạt phân bào, cytokinin được xem như một hóa chất hoạt hóa quá trình phân chia tế bào, đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của rễ, thân và chồi cũng như sự phân hóa tế bào ở các mô sinh trưởng.
13 chia tế bào Có hiệu quả này là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp axit nucleic và protein (Ngô Xuân Bình, 2009)
Cytokinin có hai loại: tự nhiên như zeatin và 2-ip hoặc được tổng hợp như kinetin, BA, TDZ Kinetin là chất có khả năng phân chia tế bào mạnh mẽ và có ảnh hưởng đến sự nảy mầm TDZ là chất có tác động tích cực trong việc cảm ứng và hình thành phôi
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6benzyladenin (BA), 6-γ-γdimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1 Hpurine- 6amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Nói chung chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng
Cytokinins được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh và không ký sinh, vi khuẩn và tế bào động vật Hiện nay đã có trên 200 loại cytokinin tự nhiên và tổng hợp được phát hiện (Bùi Trang Việt, 2000) Ở nồng độ cytokinin cao có thể tạo thành các cụm chồi, số lượng chồi phụ thuộc vào mức độ nồng độ; tuy nhiên việc điều chỉnh để cảm ứng tạo nhiều chồi cũng gặp một số bất lợi Nồng độ cytokinin thấp kích thích sự phát triển chồi ở nách, còn ở nồng độ cao hơn có thể kích thích hình thành chồi vô định hình nhưng chồi khó ra rễ.
Có 3 loại cytokinin chính thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là:
- Kinetin là sản phẩm được phát hiện đầu tiên, có cấu trúc phân tử N-(2- furfurylamino)-1 Hpurine-6amine Kinetin được hình thành từ chế phẩm AND ở điều kiện nhiệt độ cao Trong cơ thể sống có thể không có kinetin tồn tại Kinetin kích thích sự phát sinh chồi nuôi cấy (Nguyễn Xuân Bình, 2009)
- Zeatin cũng là một dẫn xuất của adenine Công thức hóa học của zeatin: 6-(4- hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine Tác dụng của zeatin tương tự như kinetin Trong thực tiễn nuôi cấy mô, zeatin chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt (Nguyễn Xuân Bình, 2009)
- 6-benzylaminopurine (BAP): Tác dụng của BAP tương tự như hai trường hợp trên nhưng hoạt tính của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bền vững hơn zeatin dưới tác dụng của nhiệt độ cao (Nguyễn Xuân Bình, 2009).
Cây đơn bội và đơn bội kép
Cây đơn bội là cây có một bộ nhiễm sắc thể duy nhất (n) Việc nuôi cấy được thực hiện bằng cách sử dụng bao phấn hoặc noãn chưa thụ tinh làm vật liệu nuôi cấy nhằm tạo ra cây đơn bội Các cây đơn bội có vai trò quan trọng trong sản xuất dòng đồng hợp tử (cây đồng hợp tử) và cải thiện giống cây trồng thông qua quá trình nhân giống, giúp rút ngắn thời gian tạo ra cây có đặc tính đồng nhất và tăng hiệu quả chọn lọc trong cải thiện giống.
Hầu hết các loài cây trồng của chúng ta đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội 2n và tứ bội 4n Như vậy mỗi đặc điểm di truyền ở những cơ thể này đều bị hai hay nhiều allen của một gene chi phối Nếu đó là những cơ thể dị hợp tử, tức là các gene trong mỗi bộ gene nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng (phenotyp) của gene đó hoàn toàn tuỳ thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định Vì vậy mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng phải là mức đơn bội hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng phải đồng nhất tuyệt đối (Lê Tiến Dũng, 2009)
Cây đơn bội có nhiều tính trạng tương tự cây lưỡng bội, tuy nhiên từ kích thước tế bào đến các bộ phận đều nhỏ hơn do số lượng gen và nhiễm sắc thể bị giảm đi Chúng có sức sống yếu và mang những nét đặc thù riêng vì các gen lặn ở trạng thái đơn bội được thể hiện ra kiểu hình Các cây đơn bội thường bất dục vì các giao tử không phân chia và mang nhiễm sắc thể ở trạng thái n Khi được lưỡng bội hóa, cây đơn bội sẽ tạo thành cây có kiểu gen đồng hợp tử ở tất cả các gen, dẫn đến trạng thái thuần chủng Điều này mang ý nghĩa to lớn trong việc rút ngắn thời gian tạo dòng thuần, góp phần hữu ích cho công tác nghiên cứu và chọn tạo giống.
Trong quá trình nuôi cấy bao phấn, không phải hầu hết các cây thu được đều là đơn bội Mô giao tử có thể tự lưỡng bội hóa, mô sẹo và phôi lưỡng bội cũng có thể phát triển từ tế bào bao phấn nên cây tái sinh sẽ là cây lưỡng bội giống hệt cây mẹ
Có thể xác định cây đơn bội bằng cách: đếm trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể, đo gián tiếp hàm lượng DNA của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước và khả năng tăng trưởng, phát triển (Phan Hữu Tôn, 2004)
2.5.2 Tạo cây đơn bội in vitro
Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau:
- Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối Đây là một hướng có thể coi là thủ công và rất mất thời gian Thường phải mất 5 – 7 thế hệ mới tạo được dạng đồng hợp tử
Phương pháp tạo cây đơn bội bằng in vitro đang chiếm ưu thế nhờ sự tiện lợi và nhanh chóng; chỉ sau một thế hệ có thể thu được cây đơn bội Kỹ thuật này kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây thông qua nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và noãn chưa thụ tinh thành cây đơn bội, mang lại hiệu quả nhanh chóng và tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và cải thiện giống cây trồng.
Guha Mahsehawari (1964, Ấn Độ) đã nuôi cấy thành công hạt phấn cây bí để tạo phôi và từ phôi đó nuôi được cây con hoàn chỉnh; ngoài nuôi cấy bao phấn, các nhà khoa học còn đạt được những thành công lớn trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và nuôi cấy hạt phấn tách rời Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử hoặc đại bào tử trong nuôi cấy hạt phấn và noãn cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây đơn bội, phục vụ cho nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng (Nguyễn Xuân Bình, 2009).
Hai phương pháp cơ bản được áp dụng phổ biến nhất là:
Nuôi cấy trực tiếp từ hạt phấn hay từ noãn chưa thụ tinh:
Tiểu bào tử trong bao phấn Phôi Cây đơn bội (n = 1)
Cấu trúc dạng phôi (embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn Quá trình này thường xảy ra trong bao phấn (Nguyễn Xuân Bình, 2009)
Nuôi cấy gián tiếp thông qua mô sẹo:
Tiểu bào tử trong bao phấn tham gia vào quá trình hình thành callus chồi cây đơn bội (n = 1) Cây hoàn chỉnh phát triển từ khối callus, khối mô này thường phát triển ra ngoài bao phấn, cho thấy liên kết giữa tiểu bào tử và sự biệt hóa thành cây con bắt nguồn từ khối callus (Nguyễn Xuân Bình, 2009).
Cây đơn bội đầu tiên đã được tạo ra từ cây cà độc dược lùn bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn (Blakelsee et al., 1922) Thành tựu này mở ra một nhánh nghiên cứu mới về nuôi cấy cơ quan sinh dục và tiềm năng của cây đơn bội trong di truyền học và chọn giống Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã được tiến hành để tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy, tăng cường hồi phục và phát triển của các dòng đơn bội, cũng như khám phá ứng dụng của công nghệ này trong cải tạo giống và nghiên cứu di truyền thực vật.
16 tiến hành như: lúa mạch (Kasha và Kao, 1970), thuốc lá (Burk et al., 1979), hành
2.5.3 Tạo cây đơn bội kép
Cây đơn bội kép thường được tạo ra bởi hai phương pháp chính là xử lý bằng colchicine và tái sinh trực tiếp từ lá cây đơn bội
Để kích thích tăng gấp đôi bộ nhiễm sắc thể, phương pháp được sử dụng chủ yếu là xử lý bằng colchicine, được chứng thực qua các công trình của Caglar & Abak (1997), Nikolova & Niemirowicz-Szczytt (1996), Sari & Abak (1996) và Yetisir & Sari (2003) Tỷ lệ cây con có nhiễm sắc thể lưỡng bội cao nhất, trên 60%, được ghi nhận khi ngâm cây con trong dung dịch colchicine 0,5% trong 4 giờ (Caglar & Abak, 1997).
Một phương pháp khác là tái sinh trựac tiếp từ lá cây đơn bội (NiemirowiczSzczytt et al., 1995) Tuy nhiên kết quả thu được không hiệu quả bằng phương pháp xử lí bằng colchicine Khi tiến hành tái sinh từ lá thứ nhất và lá thứ hai của cây đơn bội, kết quả thu được có sự khác biệt rõ rệt Tất cả cây tái sinh từ lá thứ nhất đều là đơn bội kép nhưng khi từ lá thứ hai thì tỷ lệ đạt được là 70,5 %, lá tiếp theo là 28,2 % (Faris et al., 2000) Điều này cho thấy độ tuổi phát triển của mô được tái tạo góp một phần quan trọng trong việc làm tăng gấp đôi nhiễm sắc thể
Việc tạo ra cây đơn bội kép, bất kể phương pháp nào được dùng, vẫn là một bước tiến quan trọng hướng tới việc hình thành dòng đơn bội hoàn toàn đồng hợp tử và mang lại nhiều lợi ích cho nghiên cứu cũng như công tác chọn tạo giống mới Quá trình này đóng vai trò then chốt trong phát triển các dòng gen ổn định và hỗ trợ tối ưu hóa chiến lược lai tạo nhằm nâng cao chất lượng và độ đồng nhất của các giống cây trồng.
Từ rất lâu, người ta cũng đã biết đến giá trị của cây đơn bội tuy nhiên tần suất xuất hiện của cây đơn bội trong tự nhiên là rất thấp do đó không đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Các tác giả cho rằng bình quân các nhà nghiên cứu sẽ tiết kiệm được khoảng 5 năm khi sử dụng các phương pháp tạo cây đơn bội in vitro vào việc tạo ra giống mới Việc đưa cây đơn bội vào chương trình tạo giống đã trở thành phổ biến trên thế giới (Đỗ Năng Vịnh, 2005)
Tạo cây đơn bội kép từ cây đơn bội là một bước tiến hữu ích cho ngành lai tạo và chọn giống Với kiểu gen hoàn toàn đồng hợp tử chúng ta có thể dễ dàng lựa chọn những kiểu gen mong muốn Lofti và cs, (2003) đã sử dụng giống lai được lai tạo từ
KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cây bao phấn
Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả của phương pháp nuôi cấy bao phấn phụ thuộc và rất nhiều yếu tố như: kiểu gen của cây cho bao phấn, nhân tố thành bao phấn, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, ánh sáng, trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn (Dương Công Kiên, 2003)
3.1.1 Ảnh hưởng của cây cho bao phấn
Kiểu gen của cây cho bao phấn có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy, không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong một loài Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một đặc điểm có khả năng di truyền (Dương Công Kiên, 2003)
Olszewska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây ớt đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn nhận thấy: trong 17 kiểu gen của các giống đưa vào nuôi cấy chỉ có 11 giống tạo được phôi từ bao phấn Số liệu thu được cho thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn (Olszewska et al., 2014)
3.1.2 Ảnh hưởng của các giai đoạn phát triển bao phấn
Các giai đoạn phát triển của bao phấn nuôi cấy cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp đồng thời tỷ lệ bạch tạng càng cao Tuy nhiên, không phải tất cả các loại cây đều có giai đoạn tối ưu như nhau Theo Nizeki và Oono, 1968 thì giai đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho cây lúa, còn theo Clapham, 1971 cho rằng cây đại mạch có hiệu quả tạo mô sẹo cao nhất ở giai đoạn đơn nhân sớm Vì vậy, để đạt được hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn, giai đoạn phát triển của hạt phấn có ý nghĩa rất quan trọng
3.1.3 Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy
Việc xử lý lạnh hay xử lý nhiệt đối với bao phấn hoặc cây cho bao phấn trước khi nuôi cấy đều có tác động đối với sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây, nhiệt độ tối thích phụ thuộc vào từng giống Điều kiện lạnh sẽ kích thích việc tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây cao Các giống khác nhau cũng như trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý Ying, 1983 đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh trước nuôi cấy lên hiệu quả nuôi cấy bao phấn, kết quả cho thấy: xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo ở nhiều loài như thuốc lá, cà độc dược và lúa nước Tapia và cs,
1990 cũng cho là xử lý lạnh làm chậm sự lão hóa và làm tăng sự phân chia của hạt phấn,
19 giúp giải phóng những chất cần thiết cho sự sinh sản đơn tính đực Nghiên cứu của Sugimoto lại cho thấy 20 xử lý lạnh làm tăng lượng acid amin tự do dẫn đến tăng tần số tái sinh cây từ mô sẹo (Trần Văn Lài, 2005)
3.1.4 Ảnh hưởng của thành phần nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn; nhiều môi trường đã được xây dựng và sử dụng như White, MS, Gamborg và Nitsch, và tùy theo đối tượng nuôi cấy mà các hệ cơ bản này được tối ưu hóa thành nhiều biến thể khác nhau để phù hợp Có những quy luật chung là các cây hòa thảo thường cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4-D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên; ở lúa mì cần lượng đường saccarose từ 60–120 g/L, trong khi các cây họ cà chỉ cần 20–40 g/L Dịch chiết khoai tây và nấm men có tác dụng đối với nhiều môi trường nuôi cấy (Hồ Kì Quang Minh, 2009).
Những nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro
Năm 2014, Nguyễn Thanh Hải và cs đã nghiên cứu tạo cây cải đông dư bằng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro Bao phấn cây cải đông dư được cấy trên môi trường B5 bổ sung tổ hợp 0,5 mg/L α – NAA và 1 mg/L Kinetin cho tỷ lệ hình thành phôi cao nhất là 2,33 % Phôi vô tính có thể tạo cây hoàn chỉnh trong môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L IAA; 0,5 mg/L BA Chồi đỉnh của cây tái sinh từ phôi vô tính có khả năng nhân nhanh tốt nhất khi sử dụng môi trường MS có bổ sung 1 mg/L BA Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L α - NAA là môi trường thích hợp cho việc tạo rễ
Năm 2017, Lương Thị Mơ và cs đã nghiên cứu tạo cây ớt bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro Bao phấn cây ớt được cấy trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L cho kết quả cảm ứng tốt nhất số lượng bao phấn cảm ứng khoảng 6 bao phấn/bình Môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L và Kinetin 2,0 mg/L cho kết quả cảm ứng tốt nhất số lượng bao phấn cảm ứng khoảng 8 bao phấn/bình Là môi trường thích hợp nhất cho việc cảm ứng tạo phôi từ bao phấn cây ớt Môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/L cho kết quả
20 tạo chồi tốt nhất số lượng chồi cảm ứng khoảng 3 chồi/bình Là môi trường thích hợp nhất cho việc cảm ứng tạo chồi từ phôi ớt
Năm 2011, Irikova and Grozeva nghiên cứu so sánh các kết quả trong nuôi cấy bao phấn cây ớt Tìm hiểu các vấn đề liên quan tới lĩnh vực này, và ảnh hưởng của các yếu tố quan trọng cho sự hình thành phôi thành công và phát triển cây con như điều kiện phát triển và tuổi của cây mẹ, kiểu gen của cây mẹ, giai đoạn phát triền của bao phấn, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, chất điều hòa tăng trưởng Kết quả cho thấy môi trường thích hợp là môi trường bazơ (môi trường cảm ứng C và môi trường tái sinh R-Dumas de Vaulx et al 1981, MS-Murashige và Skoog 1962), chất điều hòa tăng trưởng thực vật là Kinetin và 2,4-D, giai đoạn phát triền của tế bào là vào cuối kì Shock nhiệt trước khi cấy là 4 °C và sau khi cấy là 35 °C
Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
Vật liệu
1.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: tháng 9 năm 2018 đến tháng 03 năm 2019 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3, Bình Dương
Cây ớt sừng xanh được trồng từ hạt được sản xuất tại công ty TNHH giống cây trồng Phú Nông giống F1 SUPER PN-488
Bao phấn được tách từ nụ hoa ớt sừng xanh được thu hái tại khu nhà lưới của Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương, được khử trùng và cấy vào môi trường CP có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật phù hợp để tiến hành thí nghiệm
1.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Phòng chuẩn bị môi trường, phòng hấp khử trùng, phòng bảo quản hóa chất: nồi hấp, máy cất nước lần một, lò vi sóng, tủ lạnh, máy đo pH, cân kỹ thuật, cân phân tích, đĩa Petri, Erlen
Phòng cấy vô trùng: tủ cấy, máy điều hòa, dao cấy, kẹp, đèn cồn, đèn UV
Phòng nuôi mẫu: máy điều hòa, đèn chiếu sáng, kệ sắt, nhiệt kế
Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 2 o C Độ ẩm: 70 ± 5 %
Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux
Thời gian ủ tối: 24 giờ/ngày pH môi trường: 5,7 – 5,8
Để nuôi cấy mô thực vật, sử dụng môi trường CP có bổ sung đường 30 g/L và agar 8 g/L, kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng như NAA và kinetin; nồng độ của các chất này được điều chỉnh tùy mục đích của từng thí nghiệm để đạt hiệu quả tối ưu.
Sử dụng môi trường R1 có bổ sung đường 30 g/L, agar 8 g/L và chất điều hòa tăng trưởng thực vật kinetin với nồng độ 0,1 mg/L
Các hóa chất để pha môi trường CP
Các hóa chất để pha môi trường R1
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quan sát hình thái bao phấn trước khi cấy
Mục đích thí nghiệm: xác định và mô tả thời kỳ phát triển của hạt phấn trước khi cấy
Vật liệu thí nghiệm nụ hoa ớt được thu hái ở các giai đoạn khác nhau
Mô tả thí nghiệm: bao phấn được tách ra và nhuộm trong thuốc nhuộm acetocarmine theo quy trình như sơ đồ II.1 và quan sát dưới kính hiển vi
Ngâm trong acid HCl 10 % 15 phút
Ngâm trong acid HCl 10 % 1 phút
Ngâm trong thuốc nhuộm acetocarmine 20 phút Đặt mẫu trong acid acetic 45 %
Quan sát dưới kính hiển vi
Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn
Hình II.1 Quy trình nhuộm bao phấn ớt bằng thuốc nhuộm acetocarmine
Khảo sát nồng độ Kinetine ảnh hưởng đến sự cảm ứng bao phấn tạo phôi cây ớt Capsicum annuum L
Mục đích thí nghiệm: tìm ra nồng độ Kinetin thích hợp cho việc cảm ứng tạo phôi từ bao phấn ớt
Vật liệu thí nghiệm: nụ hoa ớt được thu hái 2 ngày trước khi nở
Môi trường nuôi cấy: môi trường CP cơ bản có bổ sung Kinetin thay đổi theo các nồng độ: 0,4 mg/L, 0,45 mg/L, 0,5 mg/L, 0,55 mg/L, 0,6 mg/L
Mô tả thí nghiệm: nụ hoa ớt sau khi được thu hái và được ủ ở 4 °C trong 2 ngày sẽ được khử trùng qua cồn 70° trong 3 phút, sau đó được ngâm trong Ca(OCl)2 10 % trong
Quy trình nuôi cấy pollen bắt đầu bằng khử trùng và tách bao phấn, sau đó được cấy lên môi trường nuôi cấy phù hợp để phát triển Mẫu được bảo quản ở điều kiện thích hợp nhằm kích thích sự phát triển và theo dõi tiến trình phân lập trên đĩa Petri Tiếp theo, đĩa chứa mẫu được chuyển đến khu vực tối để tiếp tục quá trình nuôi cấy và quan sát sự biến đổi cho đến khi hoàn tất.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, 1 bình/lần, 10 mẫu/bình
Thời gian theo dõi: 3 tuần
Chỉ tiêu đánh giá: số lượng bao phấn cảm ứng
Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Sự khác biệt giữa các nhóm được xác định có ý nghĩa ở mức 95% (p